技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及一类环境敏感型的α1-肾上腺素能受体近红外荧光 探针以及其在α1肾上腺素受体细胞成像、亚细胞定位和表达水平检测等药理学和生理学研 究中的应用。
背景技术
具有7次跨膜结构的G-蛋白偶联受体，是最大的细胞表面受体家族，其编码基因约占人 类蛋白编码基因组的4％[Zhang,R.；Xie,X.ToolsforGPCRdrugdiscovery.ActaPharmacol. Sin.2012,33,372-84.]。作为一种多功能的分子机器，G-蛋白偶联受体调节着由激素和神经递 质介导的大多数生理反应，是将近26％上市处方药物的作用靶点。尽管G-蛋白偶联受体的化 学与结构生物学研究取得了可喜的进展，但是由于动态受体的构象多样性，其药理学及其生 理学研究仍存在着很大的挑战[Granier,S.,Kobilka,B.AneweraofGPCR structuralandchemicalbiology.Nat.Chem.Biol.2012,8,670-673.]。为了开发出用作受体研究的 有效工具，荧光标记的药物分子，即小分子荧光配体越来与受到药物学家的关注。过去的几 十年里，大量的G-蛋白偶联受体的小分子荧光配体被相继报道出来，而且已经广泛地应用于 细胞水平的受体可视化和药理学研究[Ma,Z.；Du,L.；Li,M.Towardfluorescentprobesfor G-protei-coupledpeceptors(GPCRs).J.Med.Chem.2014,57,8187-8203.]。然而，这些小分子荧 光配体仍然存在的局限。一方面大多数已报道的荧光配体的荧光波长较短，常与细胞或组织 本身的自发荧光产生干扰，而且这些短波的光穿透力弱，无法有效的透过深层组织，限制了 其广泛应用。另一方面，传统的荧光配体缺乏一种有效的荧光开关机制，从而产生较强的非 特异性结合信号，导致信噪比较差。
肾上腺素能受体是介导儿茶酚胺作用的一类组织受体，隶属于G-蛋白偶联家族，分为α 和β两种亚型，是交感神经系统反应的重要介质。α1-肾上腺素能受体包含三种亚型：α1A、α1B和α1D[Zhong,H.；Minneman,K.P.Alpha1-adrenoceptorsubtypes.Eur.J.Pharmacol.1999,375, 261-276]，主要调节平滑肌收缩、心肌收缩和肝脏葡萄糖代谢。研究表明，α1-肾上腺素能受 体是治疗良性前列腺增生(BPH)和高血压的药理靶点[Rosini,M.；Bolognesi,M.L.；Giardina, D.；Minarini,A.；Tumiatti,V.；Melchiorre,C.Recentadvancesinalpha1-adrenoreceptorantagonists aspharmacologicaltoolsandtherapeuticagents.Curr.Top.Med.Chem.2007,7,147-162]。此外， 研究还发现，α1-肾上腺素能受体在前列腺肿瘤组织中高度表达，其拮抗剂对雄激素依赖和非 依赖前列腺癌细胞都有促凋亡作用。α1-肾上腺素能受体的不正常表达及分布于许多生理疾病 息息相关，例如高血压、前列腺肥大、前列腺癌等。
相比于肾上腺素能受体家族的其他成员如β受体，α1-肾上腺素能受体的药理学和生理 学特征研究相对滞后。目前运用药理学手段研究α1-肾上腺素能受体具有一定的难度，这是 因为α1-肾上腺素能受体拮抗剂虽然在活性上较以前有了很大的改善，但在组织选择性方面 仍有待进一步优化；另一方面，α1-肾上腺素能受体的三维晶体结构尚未解析，很难从基于 分子水平对这些实验现象进行解释。因此开发出高灵敏的α1-肾上腺素能受体的小分子荧光 配体显得尤为重要。虽然近几年有不少α1-肾上腺素能受体荧光探针相继问世，但他们都存 在着上述传统荧光探针的缺点，即波长短且缺乏荧光开关机制。这些缺点大大限制了这些 荧光探针的应用。
为寻找更为灵敏、高效的荧光探针，Cy系列荧光染料越来越受到研究人员的青睐。Cy 荧光染料可以发近红外的荧光，并具有一定环境敏感的性质，已广泛地应用在生物大分子， 尤其是DNA的荧光检测中。但是其在蛋白质的细胞荧光成像中的应用较少。在初期的研究 中发现，Cy5荧光染料(化合物C1，实例一)可以使多种细胞明显着色，但是这种着色没 有任何选择性(附图5)。如何化学修饰和连接Cy荧光染料，使得其荧光标记具有高度的 选择性，也是科研人员亟待解决的难题。
发明内容
针对现有技术的不足，在已有的工作基础上，本发明把α1-肾上腺素能受体特异性识别 基团与Cy5荧光团进行连接，将荧光开关机制引入探针，使荧光性质得到有效的管理，构 建出针对α1-肾上腺素能受体的高灵敏小分子近红外荧光配体，并以此探针分子作为工具药 用于α1-肾上腺素能受体的生物学和生理学特征的体内和体外研究，为α1-肾上腺素能受体 的研究提供更方便、更有效、全新的研究手段；具体为：本发明提供近红外的具有环境敏 感荧光性质的α1-肾上腺素能受体小分子荧光配体及其制备方法、光学性质、生物活性、和 受体药理特征研究中的应用。该小分子荧光配体对α1-肾上腺素能受体具有高选择性和高灵 敏度，可以作为工具药去研究α1-肾上腺素能受体的生物学和生理学特征。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种环境敏感型的α1-肾上腺素能受体近红外荧光配体，具有下述结构通式：(Ⅰ)。
式中：R1为6,7-二甲氧基-2-(哌嗪-1-基)喹唑啉-4-氨，或1-(2-甲氧苯基)哌嗪；X1为含 或不含三唑环的长链连接基团；R2为不同取代基；X2为卤素离子。
优选的，n1为1～6；X2为碘或溴离子。
更为优选的，n1等于1；R2为甲基；X为碘离子。
更优选的，是下述化合物：
本发明所述化合物可用作α1-肾上腺素能受体的小分子荧光探针；
本发明所述化合物可用作与α1-肾上腺素能受体相关疾病的诊断和/检测；优选的，疾病为高 血压、前列腺肥大、前列腺癌。
本发明所述化合物可用于筛选α1-肾上腺素能受体相关疾病的药物；优选的，所述药物为α1- 肾上腺素能受体拮抗剂或激动剂。
本发明所述化合物可用于α1-肾上腺素能受体的细胞成像和/或流式检测，在此需要说明，所 述应用方法不属于疾病的诊疗方法，首先，细胞成像和/或流式检测可用于α1-肾上腺素能受 体拮抗剂或激动剂的筛选过程中；其次，用于生物体细胞时，所述细胞成像和/或流式检测 的结果，无法直接说明机体是否患α1-肾上腺素能受体相关疾病，其作为中间结果，需要进 一步的与正常细胞比对并进一步的诊断才能确定生物体是否患病。
有益结果：
(1)本发明探针分子的荧光性质随着周围环境的改变而发生变化，尤其是其荧光会因 周围环境的极性减小或者黏度增大而显著增强；
(2)当探针与α1-肾上腺素能受体结合时荧光会大大增强，可以很容易地实现受体蛋白 的可视化，提高了信噪比，避免了繁琐的洗涤步骤；
(3)本发明所述探针的荧光的波长可调范围大，可进入近红外区，能够有效的避开生 物体系的自发荧光，从而极大提供了探针的灵敏性，避免干扰；
(4)本发明所述探针在兼顾灵敏性的同时，显示出与α1-肾上腺素能受体极高的亲和力， 对α1-肾上腺素能受体特异性较高，以该类荧光配体作为工具药实现了α1-肾上腺素能受体 细胞成像、亚细胞和细胞表达水平检测等受体药理学和生理学特征的研究。
附图说明
图1.PTC-1在不同溶剂(A)以及DMSO与HEPES缓冲的混合溶液(B)中的荧光发射光 谱；PTC-1在不同体积甘油和水的混合溶液中的荧光强度和荧光寿命(C)；不同浓度PTC-1 在水中的荧光寿命(D)。
图2.PTC-1(A)和荧光团C1(B)对不同蛋白的荧光响应；多沙唑嗪淬灭PTC-1对α1-受体三种 亚型蛋白特异性响应的荧光强度(C)；PTC-1对α1-受体转染的HEK293细胞特异性响应 (D)；PTC-1的HEK293细胞成像结果(E)：α1A-HEK293细胞(a，b)，α1D-HEK293 细胞(c，d)，HEK293细胞(e)，α1B-EGFP-HEK293细胞(f，g)；细胞以PTC-1(300nM) 孵育(a，c，e，f)，细胞以PTC-1与多沙唑嗪混合溶液(300nm+3μM)进行孵育(b，d，g)
图3.PTC-1的不同肿瘤细胞成像结果。a，PC-3细胞，PTC-1；a’，PC-3细胞，PTC-1+doxazosin； b，DU145细胞，PTC-1；b’，PC-3细胞，PTC-1+doxazosin；PTC-1；c，Hela细胞，PTC-1； d，ES-2细胞，PTC-1；e，A549细胞，PTC-1；f，MCF-7细胞，PTC-1；g，HepG2细胞， PTC-1。
图4.流式细胞术测定α1-受体表达。A，α1A-HEK293与HEK293细胞；B，PC-3与Hela 细胞。
图5.Cy荧光染料C1(30nM)在不同细胞的成像结果。(A)HEK293细胞；(B)PC-3细胞； (C)ES-2细胞.(a)明场；(b)红色荧光；(c)a与b的叠合.Scalebar＝20μm。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发 明。
实例一：PTC-1～3的合成
反应试剂与条件:(a)3-碘代丙酸,乙腈,回流,48h,81％；(b)碘甲烷,乙腈,回流,12h, 86％；(c)盐酸-N-(3-苯氨基-2-丙烯亚基)苯胺,AcOH/AC2O,120℃,4h；吡啶/AcOH,120℃,4h； 30％两步；(d)炔丙胺,EDCI,DMAP,二氯甲烷,r.t.,6h,53％；(e)哌嗪,H2O,100℃,81％；(f) 酰基氯,TEA,乙腈,1h,0℃,62-75％；(g)NaN3,DMSO,100℃,6h,35-88％；(h)CuSO4,抗坏 血酸钠,tBuOH/H2O＝2:1,50℃,1h,48.9-67.3％。
中间体C3：1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-碘鎓
2,3,3-三甲基-3H-吲哚(1.0g,6.23mmol)和3-碘丙酸(1.86g,9.3mmol)溶于15mL 乙腈中，回流48小时后，降至室温。旋干溶剂后，在超声震荡下，缓慢加入100mL乙酸 乙酯，有大量沉淀析出。过滤，20mL乙酸乙酯洗涤滤饼，干燥后等白色固体1.8g，产率 81％。熔点：181-183℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ12.72(s,1H),8.01-7.98(m,1H), 7.85-7.83(m,1H),7.62-7.60(m,2H),4.67(t,2H,J＝7.0Hz),3.00(t,2H,J＝7.0Hz),2.86(s,3 H),1.53(s,6H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ198.4,172.0,142.2,141.3,129.8,129.4, 124.0,116.0,54.7,44.0,31.6,22.4,14.9.ESI-MS:m/z[M-I-]calcdforC14H18N2O2+232.1,found 232.4。
中间体C4：1,2,3,3-四甲基-3H-吲哚-1-碘鎓
2,3,3-三甲基-3H-吲哚(2.0g,12.5mmol)和碘甲烷(2.3g,16.3mmol)溶于20mL乙腈 中，回流12小时后，降至室温。过滤，20mL乙腈洗涤滤饼，干燥后等白色固体3.2g，产 率86％。分解点：:244-245℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.93-7.91(m,1H),7.85-7.82(m, 1H),7.65-7.60(m,2H),3.98(s,3H),2.78(s,3H),1.54(s,6H).13CNMR(100MHz, DMSO-d6):δ196.5,142.6,142.1,129.8,129.3,123.8,115.6,54.4,35.2,22.2,14.7.ESI-MS:m/z [M-I-]calcdforC12H14N+174.1,found174.4。
中间体C2：1-(2-羧乙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚-2-甲叉基)五-1,3- 二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓
氮气保护下，中间体C3(684.6mg,2.2mmol)和1-苯胺基-3-苯亚胺基丙烯盐酸盐(517.5 mg,2mmol)溶于4mL乙酸和4mL乙酸酐中，回流搅拌4小时。降至室温后，旋干溶剂， 残留物溶于4mL乙酸和4mL吡啶中。将中间体C4(602.5mg,2mmol)加至反应液中，氮 气保护下回流2小时。降至室温，旋干溶剂，经两次硅胶柱层析分离得蓝色化合物341mg， 产率30％。分解点：171-172℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.35(q,2H,J＝12.0Hz), 7.61(t,2H,J＝7.6Hz),7.43-7.33(m,4H),7.26-7.20(m,2H),6.57(t,1H,J＝12.4Hz),6.40 (d,1H,J＝14.0Hz),6.22(d,1H,J＝13.6Hz),4.26(t,2H,J＝7.2Hz)3.56(s,3H),2.26(t,2H, J＝7.2Hz),1.67(s,6H),1.66(s,6H).ESI-MS:m/z[M-I-]calcdforC29H33N2O2+441.2,found 441.6。
中间体C1：3,3-二甲基-1-(3-氧-3-(2-炔丙基-1-氨基-)丙基)-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基 吲哚-2-甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓
将中间体C2(427mg,0.82mmol),丙炔胺(158μL,2.46mmol),N,N-二甲氨基吡啶 (DMAP,150mg,1.23mmol)，碳二亚胺盐酸盐(EDCI,173mg,0.9mmol)溶于20mL二氯甲 烷中，室温搅拌6小时。将反应液以100mL二氯甲烷稀释，然后分别以100mL饱和柠檬 酸溶液，100mL饱和碳酸氢钠溶液，50mL水和50mL饱和氯化钠溶液洗涤两次，无水硫酸 钠干燥有机相过夜，过滤，旋出有机溶剂。将残留物以3mL干燥的二氯甲烷溶解，加50mL 乙醚，超声振荡，过滤得蓝色国体243mg，产率53％。分解点：175-176℃.1HNMR(400 MHz,DMSO-d6):δ8.53(t,1H,J＝5.2Hz),8.39-8.27(q,2H,J＝12.8Hz),7.64(d,1H,J＝7.2 Hz)7.61(d,1H,J＝7.6Hz),7.43-7.20(m,6H),6.58(t,1H,J＝12.4Hz),6.36(d,1H,J＝14.0 Hz),6.22(d,1H,J＝13.6Hz),4.32(t,2H,J＝6.0Hz)3.81(dd,2H,J2＝5.2Hz,J2＝2.4Hz) 3.63(s,3H),3.11(t,2H,J＝2.4Hz)2.60(t,2H,J＝6.4Hz),1.67(s,6H),1.66(s,6H).13CNMR (100MHz,DMSO-d6):δ174.2,172.5,169.5,154.8,154.2,143.2,142.3,141.6,141.4,128.9, 128.8,126.0125.4,124.9,122.8,111.7,111.4,104.4,103.4,81.2,73.8,49.5,49.2,40.4(covered withDMSO)33.3,31.7,28.5,27.7,27.4；ESI-MS:m/z[M-I-]calcdforC32H36N3O+478.3,found 478.5。
中间体8：6,7-二甲氧基-2-(哌嗪-1-基)喹唑啉-4-氨
将2-氯-4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉(9.96g,41.56mmol)和哌嗪(35.8g,41.56mmol)加 入到50mL水中，于100℃搅拌6h。降至室温后，将50mL1.7NKOH溶液缓慢加入到 反应液中，室温搅拌1h，过滤得沉淀，20mL水洗涤滤饼，甲醇重结晶得白色固体9.7g， 产率81％.熔点.219-220℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.40(s,1H),7.03(s,2H),6.70 (s,1H),3.82(s,3H),3.78(s,3H),3.64(t,4H,J＝4.8Hz),2.71(t,4H,J＝4.4Hz)；13CNMR (100MHz,DMSO-d6):δ161.4,159.1,154.6,149.4,145.2,105.6,104.2,103.2,56.3,55.8,46.2, 45.3；ESI-MS:m/z[M+H]+calcdforC14H20N5O2+290.2,found290.4。
中间体7a：1-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑-2-基)哌嗪-1-基)-2-氯乙基-1-酮
中间体8(1g,3.46mmol)和三乙胺(1mL,6.9mmol)加热溶解于100mL乙腈。冰水浴 下，2-氯乙酰氯(286.3μL,3.8mmol)逐滴加入反应液中。冰浴搅拌1h后，蒸除溶剂。向残 留物中加入5mL甲醇，室温搅拌20min，过滤，10mL甲醇洗涤滤饼，干燥，得白色固体 950mg,产率75％.分解点:218-219℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.43(s,1H),7.16(s, 2H),6.75(s,1H),4.43(s,2H),3.83(s,3H),3.79-3.72(m,7H),3.52(t,4H,J＝2.7Hz)； 13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ165.2,161.6,158.7,154.7,149.1,145.6,105.7,104.2,103.5, 56.3,55.9,49.1(Methanol),45.8,44.2,43.8,42.4,42.2；ESI-MS:m/z[M+H]+calcdfor C16H21ClN5O3+366.1327,found366.1334。
中间体7b：1-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑-2-基)哌嗪-1-基)-3-氯丙基-1-酮
中间体7b的合成以3-氯丙酰氯为原料，按照7a的合成方法，得白色固体920mg,产 率为70％.熔点：212-215℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.42(s,1H),7.15(s,2H),6.74 (s,1H),3.83-3.78(m,8H),3.74(t,2H,J＝4.4Hz),3.69(t,2H,J＝5.6Hz),3.52-3.51(m,4H), 2.92(t,2H,J＝6.8Hz)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ168.3,161.6,158.7,154.7,149.2, 145.5,105.7,104.2,103.4,56.3,55.9,45.3,44.2,43.9,41.7,41.1,35.8；ESI-MS:m/z[M+H]+calcdforC17H23ClN5O3+380.1,found380.5。
中间体7c：1-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑-2-基)哌嗪-1-基)-3-氯丙基-1-酮
中间体7c的合成以4-氯丁酰氯为原料，按照7a的合成方法，得白色固体850mg,产 率为62％.熔点：186-189℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.42(s,1H),7.16(s,2H), 6.74(s,1H),3.83(s,3H),3.78(s,3H),3.75(t,2H,J＝4.0Hz)3.70(t,4H,J＝6.4Hz),3.52(t, 4H,J＝6.4Hz),2.51-2.50(m,2H),1.99(m,2H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ170.2, 161.2,158.7,154.7,149.5,145.5,105.6,104.2,103.4,56.3,55.9,45.5,45.3,44.2,43.9,41.6, 29.9,28.5,；ESI-MS:m/z[M+H]+calcdforC18H25ClN5O3+394.2。
中间体P1：1-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉2-基)哌嗪-1-基)-2-叠氮乙基-1-酮
将叠氮化钠(0.89g13.65mmol)缓慢小心地加入中间体7a(1.0g,2.73mmol)的DMSO (10mL)溶液中，于100℃搅拌6h，降至室温。反应液以200mL二氯甲烷溶液稀释,然 后分别以100mL饱和碳酸氢钠溶液，100mL水和100mL饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸 镁干燥有机相过夜。过滤，旋出溶剂得粗产品，硅胶柱层析纯化得白色粉末0.66g,产率65％. 熔点：231-233℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.42(s,1H),7.15(s,2H),6.74(s,1H), 4.20(s,2H),3.83(s,3H),3.79(s,3H),3.74(m,4H),3.53(t,2H),3.37(t,2H)；13CNMR(100 MHz,DMSO-d6):δ166.5,161.6,158.7,154.7,149.2,145.5,105.7,104.1,103.4,56.3,55.9,50.2, 44.6,44.0,43.8,42.0；ESI-MS:m/z[M+H]+calcdforC16H21N8O3+373.1731,found373.1723。
中间体P2：1-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉2-基)哌嗪-1-基)-2-叠氮丙基-1-酮
中间体P2的合成以7b为原料，按照P1的合成方法，得白色固体440mg,产率35％.熔 点：192-195℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.43(s,1H),7.16(s,2H),6.75(s,1H),3.83 (s,3H),3.79(s,3H),3.75(t,2H,J＝5.2Hz),3.71(t,2H,J＝5.6Hz),3.56(m,6H),2.70(t,2 H,J＝6.4Hz)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ168.9,161.6,158.7,154.7,149.2,145.5,105.6, 104.2,103.4,56.3,55.9,47.2,45.2,44.2,43.8,41.6,32.3；ESI-MS:m/z[M+H]+calcdfor C17H23N8O3+387.1888,found387.1893。
中间体P3：1-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉2-基)哌嗪-1-基)-2-叠氮丁基-1-酮
中间体P3的合成以7c为原料，按照P1的合成方法，得白色固体1.1g,,产率88％.熔 点：199-202℃.1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.43(s,1H),7.16(s,2H),6.75(s,1H),3.83 (s,3H),3.79(s,3H),3.74(t,2H,J＝4.8Hz),3.69(t,2H,J＝5.2Hz),3.50(m,4H),3.39(t,2 H,J＝6.8Hz),2.46(t,2H,J＝7.2Hz),1.82-1.75(m,2H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ 170.2,161.2,158.7,154.7,149.5,145.5,105.6,104.2,103.4,56.3,55.9,50.8,45.3,44.3,43.9, 41.6,29.7,24.6,；ESI-MS:m/z[M+H]+calcdforC18H25N8O3+401.2044,found401.2045。
荧光配体PTC-1：1-(3-(((1-(2-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)哌嗪-1-基)-2-氧乙 基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚 -2-甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓
将中间体C1和中间体P1溶于3.9mL叔丁醇：水(2:1)中，避光下将0.1M抗坏血酸 钠(1.8mL)和0.1M硫酸铜(0.5mL)加至反应液中，50℃搅拌1h，检测反应完全，降至 室温。旋出溶剂，残留物溶于5mL2MNH4OH溶液中，以二氯甲烷萃取(3x25mL)，无 水硫酸钠干燥过夜。过滤，旋干，粗产品经硅胶柱层析纯化得蓝色化合物23.9mg,产率48.9％. 1HNMR(300MHz,CD3OD):δ8.30-8.18(m,2H),7.68(s,1H),7.50-7.20(m,9H),6.93(s,1H), 6.50(t,1H,J＝12.3Hz),6.35-6.25(m,2H),5.46(s,2H),4.40-4.34(m,4H),3.92-3.83(m,10 H),3.69(t,4H,J＝3.3Hz),2.72(t,2H,J＝6.9Hz),1.72(s,6H),1.68(s,6H)；ESI-HRMS: m/z[M-I-]calcdforC48H56N11O4+850.4511,found850.4512.HPLCpurity99.1％,tR＝10.459 min,250×10.00mm,CH3OH(0.05％triethylamine):H2O＝95:5,2mL/min。
荧光配体PTC-2：1-(3-(((1-(2-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)哌嗪-1-基)-2-氧丙 基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚 -2-甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓
荧光配体PTC-2的合成以中间体P2为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物 33.4mg,产率：67.3％.1HNMR(300MHz,CD3OD):δ8.22-8.07(m,2H),7.63(s,1H), 7.43-7.12(m,9H),6.83(s,1H),6.53(t,1H,J＝12.3Hz),6.27(d,1H,J＝14.1Hz),6.16(d,1 H,J＝12.3Hz),4.60(t,2H,J＝6.3Hz),4.30-4.22(m,4H),3.82(s,3H),3.79(s,3H),3.69(t, 4H,J＝5.4Hz),3.57(m,5H),3.48(t,2H,J＝5.4Hz),3.03(t,2H,J＝6.3Hz),2.61(t,2H,J ＝6.9Hz),1.64(s,6H),1.57(s,6H)；ESI-HRMS:m/z[M-I-]calcdforC49H58N11O4+864.4668, found864.4656.HPLCpurity99.9％,tR＝10.664min,250×10.00mm,CH3OH(0.05％ triethylamine):H2O＝95:5,2mL/min。
荧光配体PTC-3：1-(3-(((1-(2-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)哌嗪-1-基)-2-氧丁 基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚 -2-甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓
荧光配体PTC-3的合成以中间体P3为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物 30.4mg,产率：60.4％.1HNMR(300MHz,CD3OD):δ8.20-8.09(m,2H),7.57(s,1H), 7.43-7.13(m,9H),6.91(s,1H),6.54(t,1H,J＝9.3Hz),6.26(d,1H,J＝10.5Hz),6.19(d,1H, J＝10.2Hz),4.35-4.28(m,6H),3.85(s,3H),3.81(s,3H),3.79(t,2H,J＝3.6Hz),3.75(t,2H, J＝3.3Hz),3.60(t,2H,J＝4.5Hz),3.57(s,3H),3.52(t,2H,J＝3.9Hz),2.65(t,2H,J＝5.1 Hz),2.39(t,2H,J＝5.1Hz),2.12(m,2H),1.64(s,6H),1.58(s,6H)；ESI-HRMS:m/z[M-I-] calcdforC50H60N11O4+878.4824,found878.4823.HPLCpurity99.1％,tR＝9.733min,250× 10.00mm,CH3OH(0.05％triethylamine):H2O＝95:5,2mL/min。
实例二：PTC-4～6的合成
反应试剂和条件:(a)H2O/乙腈,NaN3,80℃,20h,43-74％；(b)TsCl,三乙胺,三氯甲烷,r.t., 24h,65-88％；(c)K2CO3,乙腈,90℃,64-69％；(d)CuSO4,抗坏血酸钠,tBuOH/H2O＝2:1, 50℃,1h,55.2-72.5％。
中间体11a：2-叠氮乙醇
将NaN3(3.12g,48mmol)小心地加入到2-溴乙醇(2g,16mmol)的乙腈(10mL)和水 (40mL)的混合溶液中，于80℃强力搅拌20h后，降至室温。反应液以二氯甲烷萃取(3×50 mL)，无水硫酸镁干燥过夜，过滤，蒸除溶剂得透明油状物0.7g,产率50％.1HNMR(300MHz, CDCl3):δ3.80(td,2H,J1＝4.8Hz,J2＝3.0Hz),3.27(t,2H,J＝5.4Hz),1.96(s,1H)。
中间体11b：3-叠氮-1-丙醇
中间体11b的合成以3-溴-1-丙醇为原料，按照11a的合成方法，得1.2g，产率74％. 1HNMR(300MHz,CDCl3):δ3.77(t,2H,J＝6.0Hz),3.48(t,2H,J＝6.6Hz),1.91(s,1H), 1.88-1.79(m,2H)。
中间体11c：4-叠氮-1-丁醇
中间体11c的合成以4-氯-1-丁醇为原料，按照11a的合成方法，得0.8g，产率43％. 1HNMR(300MHz,CDCl3):δ3.68(td,2H,J1＝6.0Hz,J2＝2.1Hz),3.48(t,3H,J＝5.4Hz), 1.75-1.59(m,4H)。
中间体10a：2-叠氮乙基-4-甲基苯磺酸酯
中间体11a(1.3g,15mmol)，对甲苯磺酰氯(5.7g,30mmol)和三乙胺(3g,30mmol)的 二氯甲烷溶液于室温下搅拌24h。反应液以200mL二氯甲烷溶液稀释，分别以饱和碳酸钠 溶液(50mL×2)，水(50mL×2)，卤水(50mL×2)洗涤，无水硫酸镁干燥过夜，过滤， 蒸除溶剂。粗产物经硅胶柱层析分离纯化，得黄色油状物2.3g,产率65％.1HNMR(300MHz, CDCl3):δ7.83(d,2H,J＝8.4Hz),7.38(d,2H,J＝8.1Hz),4.18(t,2H,J＝5.1Hz),3.50(t,2 H,J＝5.1Hz),2.46(s,3H).ESI-MS:m/z[M+NH4]+calcdforC9H15N4O3S+259.1,found259.3。
中间体10b：2-叠氮丙基-4-甲基苯磺酸酯
中间体10b的合成以中间体11b(1.12g,11mmol)为原料，按照10a的合成方法，得黄色 油状物2.5g，产率88％。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.81(d,2H,J＝8.1Hz),7.38(d,2H,J ＝8.1Hz),4.13(t,2H,J＝6.0Hz),3.40(t,2H,J＝6.6Hz),2.46(s,3H),1.93-1.85(m,2H). ESI-MS:m/z[M+NH4]+calcdforC10H17N4O3S+273.1,found273.4。
中间体10c：2-叠氮丁基-4-甲基苯磺酸酯
中间体10c的合成以中间体11c(0.6g,5.2mmol)为原料，按照10a的合成方法，得黄色油状 物1.2g,86％。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.80(d,2H,J＝8.4Hz),7.37(d,2H,J＝8.1Hz), 4.07(t,2H,J＝6.0Hz),3.28(t,2H,J＝6.6Hz),2.46(s,3H),1.82-1.57(m,4H)；ESI-MS:m/z [M+NH4]+calcdforC11H19N4O3S+287.1,found287.3。
中间体P4：2-(4-(2-叠氮乙基)哌嗪-1-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氨
向中间体8(1.0g，3.46mmol)和10a(920mg，3.8mmol)的乙腈溶液中(60mL) 加入1.43g碳酸钾，混合物回流24h后，立即过滤得滤液。蒸除溶剂，经硅胶柱层析纯化得 白色固体0.86g，产率69％.M.p.119-121℃.1HNMR(300MHz,CDCl3):δ6.94(s,1H),6.80(s, 1H),5.13(s,2H),3.97(s,3H)3.93(s,3H),3.89(t,4H,J＝4.8Hz),3.42(t,2H,J＝6.0Hz), 2.66(t,2H,J＝6.0Hz),2.59(t,4H,J＝5.1Hz)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ166.5,158.8, 154.7,149.0,145.4,105.5,104.2,103.3,57.3,56.3,55.5,47.6,44.1,44.0；ESI-MS:m/z[M+H]+calcdforC16H23N8O2+359.2,found359.6。
中间体P5：2-(4-(2-叠氮丙基)哌嗪-1-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氨
中间体P5的合成以中间体10b(893mg，3.5mmol)为原料，按照P4的合成方法，得 白色固体0.8g，产率68％.mp.117-120℃.1HNMR(300MHz,CDCl3):δ7.08(s,1H),6.98(s, 1H),5.12(s,2H),3.96(s,3H)3.95(s,3H),3.88(t,4H,J＝3.9Hz),3.40(t,2H,J＝6.9Hz), 2.53-2.44(m,6H),1.86-1.76(m,2H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ161.5,158.9,154.7, 149.2,145.4,105.6,104.2,103.3,56.3,55.8,55.3,53.3,49.4,44.0,26.1；ESI-MS:m/z[M+H]+calcdforC17H25N8O2+373.2,found373.4。
中间体P6：2-(4-(2-叠氮丁基)哌嗪-1-基)-6,7-二甲氧基喹唑啉-4-氨
中间体P6的合成以中间体10c(1.2g,4.2mmol)为原料，按照P4的合成方法，得白色固体 0.85g，产率64％.mp.140-141℃.1HNMR(300MHz,CDCl3):δ6.93(s,1H),6.79(s,1H),5.10 (s,2H),3.97(s,3H)3.93(s,3H),3.88(t,4H,J＝4.8Hz),3.34(t,4H,J＝6.0Hz),2.53(t,4H, J＝5.1Hz),2.43(t,2H,J＝6.9Hz)1.66-1.62(m,2H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ161.5, 160.0,154.6,149.3,145.3,105.7,104.2,103.3,57.8,56.3,55.8,53.4,51.1,44.1,26.8,23.9； ESI-MS:m/z[M+H]+calcdforC18H27N8O2+387.2,found387.5。
荧光配体PTC-4：1-(3-(((1-(2-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)哌嗪-1-基)-1H-1,2,3- 三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚-2-甲叉基) 五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓
荧光配体PTC-4的合成以中间体P4为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物 33.4mg,产率：67.3％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.20-8.10(m,2H),7.71(s,1H), 7.42-7.15(m,9H),6.91(s,1H),6.55(t,1H,J＝12.4Hz),6.25(d,1H,J＝13.6Hz),6.20(d,1 H,J＝13.6Hz),4.45(t,2H,J＝6.0Hz),4.29(m,4H),3.84(s,3H),3.81(s,3H),3.72(t,4H,J ＝4.4Hz),3.56(s,3H),2.80(t,2H,J＝6.0Hz),2.65(t,2H,J＝6.8Hz),2.52(t,2H,J＝4.8 Hz),1.64(s,6H),1.59(s,6H)；ESI-HRMS:m/z[M-I-]calcdforC48H58N11O3+836.4719,found 836.4714.HPLCpurity100.0％,tR＝13.981min,250×4.60mm,CH3OH(0.05％triethylamine): H2O＝9:1,1mL/min.
荧光配体PTC-5：1-(3-(((1-(2-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)哌嗪-1-基)-1H-1,2,3- 三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚-2-甲叉基)五 -1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓
荧光配体PTC-5的合成以中间体P5为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物 27.0mg,产率：55.2％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.20-8.10(m,2H),7.61(s,1H),7.43-7.13 (m,9H),6.91(s,1H),6.55(t,1H,J＝12.4Hz),6.26(d,1H,J＝14.0Hz),6.19(d,1H,J＝ 13.6Hz),4.37(t,2H,J＝6.8Hz),4.30-4.27(m,4H),3.85(s,3H),3.81(s,3H),3.74(t,4H,J ＝4.8Hz),3.56(s,3H),2.64(t,2H,J＝6.8Hz),2.45(t,4H,J＝7.2Hz),2.33(t,2H,J＝6.8 Hz),2.05-1.98(m,2H),1.64(s,6H),1.59(s,6H)；ESI-HRMS:m/z[M-I-]calcdfor C49H60N11O3+850.4875,found850.4873.HPLCpurity96.2％,tR＝14.110min,250×4.60mm, CH3OH(0.05％triethylamine):H2O＝9:1,1mL/min.
荧光配体PTC-6：1-(3-(((1-(2-(4-(4-氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉-2-基)哌嗪-1-基)-1H-1,2,3- 三唑-4-基)甲基)氨基)-3-氧丙基)-3,3-二二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚-2-甲叉基) 五-1,3-二烯-1-基)-3H-吲哚-1-碘鎓
荧光配体PTC-6的合成以中间体P6为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物 36.0mg,产率：72.5％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.21-8.10(m,2H),7.60(s,1H), 7.41-7.13(m,9H),6.90(s,1H),6.56(t,1H,J＝12.4Hz),6.26(d,1H,J＝14.0Hz),6.21(d,1 H,J＝13.6Hz),4.32-4.29(m,6H),3.85(s,3H),3.81(s,3H),3.74(t,4H,J＝6.4Hz),3.57(s, 3H),2.66(t,2H,J＝6.8Hz),2.49(t,4H,J＝4.4Hz),2.40(t,2H,J＝7.2Hz),1.88-1.80(m,2 H),1.64(s,6H),1.60(s,6H),1.51-1.48(m,2H)；ESI-HRMS:m/z[M-I-]calcdfor C50H62N11O3+864.5032,found864.5028.HPLCpurity95.4％,tR＝14.251min,250×4.60mm, CH3OH(0.05％triethylamine):H2O＝9:1,1mL/min.
实例三：PHC-1～3的合成
反应试剂和条件:(a)K2CO3,乙腈,90℃,73-96％；(b)CuSO4,抗坏血酸钠,tBuOH/H2O＝2:1, 50℃,1h,49.4-57.7％。
中间体PH1：1-(2-叠氮乙基)-4-(2-甲氧苯基)哌嗪
向1-(2-甲氧苯基)哌嗪(665mg，3.46mmol)和11a(918mg，3.8mmol)的乙腈溶 液中(30mL)加入1.43g碳酸钾，混合物回流24h后，立即过滤得滤液。蒸除溶剂，经硅 胶柱层析纯化得黄色油状物690mg，产率76％.1HNMR(300MHz,CDCl3):δ7.02-6.84(m,4 H),3.80(s,3H),3.41(t,2H，J＝6.0Hz),3.11(m,4H)，2.73-2.65(m,6H)；ESI-MS:m/z[M+H]+calcdforC13H20N5O+262.2,found262.4。
中间体PH2：1-(2-叠氮丙基)-4-(2-甲氧苯基)哌嗪
中间体P7的合成以中间体10b(906mg，3.56mmol)为原料，按照PH1的合成方法， 得黄色油状物0.85g，产率96％.1HNMR(300MHz,CDCl3):δ7.02-6.84(m,4H),3.86(s,3H), 3.39(t,2H，J＝6.6Hz),3.10(m,4H),2.66-2.65(m,4H),2.52(t,2H,J＝6.9Hz),1.84-1.79(m, 2H)；ESI-MS:m/z[M+H]+calcdforC14H22N5O+276.2,found276.5。
中间体PH3：1-(2-叠氮丁基)-4-(2-甲氧苯基)哌嗪
中间体P8的合成以中间体10c(770mg，2.86mmol)为原料，按照PH1的合成方法， 得黄色油状物0.55g，产率73％.1HNMR(300MHz,CDCl3):δ7.03-6.84(m,4H),3.86(s,3H), 3.33(t,2H，J＝6.3Hz),3.10(m,4H),2.65(m,4H),2.52(t,2H,J＝6.9Hz),1.84-1.79(m,2H)； ESI-MS:m/z[M+H]+calcdforC15H24N5O+290.2,found290.4。
荧光配体PHC-1：1-(3-(((1-(2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基) 氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H- 吲哚-1-碘鎓
荧光配体PHC-1的合成以中间体PH1为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物 23.2mg,产率：53.6％。1HNMR(300MHz,CD3OD):δ8.30-8.16(m,2H),7.61(s,1H),7.75(s, 1H),7.51-7.20(m,8H),7.04-6.81(m,4H),6.64(t,1H,J＝12.6Hz),6.35(d,1H,J＝13.8Hz), 6.28(d,1H,J＝13.8Hz),4.50(t,2H,J＝6.3Hz),4.36-4.33(m,4H),3.81(s,3H),3.64(s,3 H),2.98(t,4H),2.87(t,2H,J＝7.2Hz),2.72-2.65(m,6H),1.72(s,6H),1.66(s,6H)；HPLC purity99.7％,tR＝10.195min,250×10.00mm,CH3OH(0.05％triethylamine):H2O＝95:5,2 mL/min。
荧光配体PHC-2：1-(3-(((1-(2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基) 氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H- 吲哚-1-碘鎓
荧光配体PHC-2的合成以中间体PH2为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物 25.4mg,产率：57.7％。1HNMR(300MHz,CD3OD):δ8.30-8.17(m,2H),7.68(s,1H),7.75(s, 1H),7.51-7.21(m,8H),7.02-6.85(m,4H),6.65(t,1H,J＝12.6Hz),6.35-6.25(m,2H), 4.43-4.36(m,6H),3.82(s,3H),3.64(s,3H),3.05(t,4H),2.70-2.68(m,6H),2.47(m,2H), 2.14(m,2H),1.72(s,6H),1.67(s,6H)；HPLCpurity99.7％,tR＝10.259min,250×10.00mm, CH3OH(0.05％triethylamine):H2O＝95:5,2mL/min。
荧光配体PHC-3：1-(3-(((1-(2-(4-(2-甲氧苯基)哌嗪-1-基)丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基) 氨基)-3-氧丙基)-3,3-二甲基-2-((1E,3E,5E)-5-(1,3,3-三甲基吲哚甲叉基)五-1,3-二烯-1-基)-3H- 吲哚-1-碘鎓
荧光配体PHC-3的合成以中间体PH3为原料，按照PTC-1的合成方法，得蓝色化合物 22.1mg,产率：49.4％。δ8.30-8.17(m,2H),7.69(s,1H),7.75(s,1H),7.51-7.17(m,8H), 7.07-6.85(m,4H),6.66(t,1H,J＝12.9Hz),6.35-6.25(m,2H),4.40-4.36(m,6H),3.82(s,3H), 3.64(s,3H),3.08(t,4H),2.95-2.62(m,8H),2.00(m,2H),1.72(s,6H),1.67(s,6H),1.59(m, 2H)；HPLCpurity99.7％,tR＝10.169min,250×10.00mm,CH3OH(0.05％triethylamine): H2O＝95:5,2mL/min
实例四：光学性质和受体亲和力的测定
以酚妥拉明(Phentolamine)为阳性药，采用放射性配体竞争性结合实验[Zhang,W.；Ma, Z.；Li,W.；Li,G.；Chen,L.；Liu,Z.；Du,L.；Li,M.Discoveryofquinazoline-basedfluorescent probestoα1-adrenergicreceptors.ACSMedChemLett.2015,6,502-506.]，测定荧光配体分子与 α1-肾上腺素能受体的亲和力，结果如表1，探针分子与α1-肾上腺素能受体有较高的亲和力， 均在纳摩尔级别，酚妥拉明相当，并且分子对受体三个亚型的亲和力没有显著性差异。荧 光性质方面，配体分子最大吸收波长为640nm，发射波长为665nm，在DMSO中的荧光 量子产率比PBS中稍大。在进一步的考察中，我们选择亲和力最强的PTC-1进行进一步的 研究。
表1荧光配体分子的光学性质以及其对α1-肾上腺素能受体的亲和力
a最大吸收和发射波长的测定在50mMPBS缓冲溶液中进行；bKi是由IC50值经Cheng-Prusoff方程 式计算所得；ND,notdetection；NA,notavailable
实例五：测定周围环境对配体分子荧光性质的影响
虽然上述荧光性质测量中，在DMSO和HEPES缓冲液中探针分子的荧光量子产率差 别不大，但是其荧光强度在有机溶液中大大增强(约7倍，图1A,1B)，此外荧光强度和荧 光寿命随溶液黏度的增加而增加(约3倍，图1C,1D)。说明该类分子属于环境敏感型的荧 光探针。
实例六：PTC-1对α1-肾上腺素能受体特异性识别。
PTC-1与α1-肾上腺素能受体特异性识别从膜蛋白和细胞两个水平进行考察。
首先，将PTC-1与不同类型的蛋白共同孵育，结果发现PTC-1对α1-肾上腺素能受体显 示出较高的选择性。α1-受体三个亚型蛋白可以使PTC-1释放较强的荧光信号，而其他蛋白 即使过量10倍，释放的荧光信号仍较弱，说明PTC-1对α1-受体蛋白有较强的选择性(图 2A)。当过量的多沙唑嗪(α1-受体拮抗剂)加入后，该荧光信号减弱，进一步证明了探针 分子PTC-1与α1-受体之间的特异性结合(图2C)。图2B显示了荧光染料C1与不同蛋白孵 育后的荧光信号强弱情况，不同蛋白之间差异并不明显，显示出无选择性。
其次，我们选取α1A和α1D受体转染的HEK293细胞与PTC-1共同孵育，同样可以观察 到强烈的荧光信号，而且该信号可以被过量的多沙唑嗪淬灭。基于此，我们实现了在细胞 水平上α1-受体原位成像。选取α1A和α1D稳转的HEK293A细胞、α1B-EGFP瞬转的HEK293A 细胞以及未转染的HEK293A细胞为考察对象。具体操作：收集细胞，接种于共聚焦小皿 中(5×104个/皿，2mL/皿)，培养24-36h。吸出培养基，1×PBS洗涤一次，加PTC-1(300nM)， PTC-1与多沙唑嗪混合溶液(300nm+3μM)，在37℃下孵育10min，不需洗涤，直接在 ZeissAxioObserverA1荧光显微镜或共聚焦显微镜LSM700下观察，拍照。结果如图2D所 示，在没有洗涤步骤的染色过程中，PTC-1明显地标记了三个亚型α1-受体转染的HEK293 细胞，这种标记可以被过量的多沙唑嗪竞争下来，导致荧光值下降。三种亚型的受体的亚 细胞定位差别明显，α1A在细胞膜和细胞质里都有分布，α1B主要分布在细胞膜上，而α1D主要分布在细胞质里。这和文献报道的结论高度一致[Chalothorn,D.；McCune,D.F.； Edelmann,S.E.；García-Cazarín,M.L.；Tsujimoto,G.；Piascik,M.T.；Differencesinthecellular localizationandagonist-mediatedinternalizationpropertiesoftheα1-adrenoceptorsubtypes.Mol. Pharmacol.2002,61:1008-1016.]。值得注意的是，在我们构建的α1B-EGFP瞬转的HEK293A 细胞成像中，绿色荧光(EGFP)与红色荧光(PTC-1)几乎完全重叠，这也充分说明了PTC-1 荧光配体分子的特异性和实用性。
实例七：PTC-1测定不同细胞α1-肾上腺素能受体表达水平。
利用PTC-1可以比较不同细胞的α1-肾上腺素能受体表达水平。这部分研究分别通过细 胞成像和细胞流式术两种手段来进行考察。对于细胞成像，以七种肿瘤细胞(前列腺癌PC-3 细胞，前列腺癌DU145细胞，肝癌HepG2细胞，卵巢癌ES-2细胞，宫颈癌Hela细胞，乳 腺癌MCF-7细胞和肺癌A549细胞)为研究对象。细胞与PTC-1(300nM)孵育30min后， 进行成像(其他操作与上述HEK293细胞成像一致)，结果(图3)显示α1-肾上腺素能受 体在PC-3和DU145两种前列腺癌细胞表达水平较高，而其他五种肿瘤细胞株中表达相对 较低。对于流式细胞术，以转染的α1A-HEK293细胞、未转染的HEK293细胞以及PC-3细 胞、Hela细胞分别为研究对象。具体操作为：收集细胞，分于1.5mLEP管中(1×106个/ 管，500μL)，2000rpm×5min洗涤细胞2次。每管加PTC-1(60nM,500μL)或PTC-1与多沙 唑嗪的混合溶液(60nM+600nM，500μL)在37℃下孵育30min，无需洗涤，直接上机检 测。结果(图4)显示PTC-1可以将高表达α1-受体的细胞与低表达α1-受体的细胞很好地区 分开。此外，我们对荧光团C1在不同细胞中的荧光成像也进行了研究，如图5所示。尽管 所有的成像结果均是洗涤之后得到的，不同细胞株仍然显示出强烈的荧光信号，各个细胞 株中没有显著性差异。