大菱鲆肾细胞系的构建方法.pdf

大菱鲆肾细胞系的构建方法，首先配制细胞培养液，以大菱鲆的肾脏组织为材料，漂洗剪碎后，用0.5％胰蛋白酶室温消化30分钟，采用200目尼龙纱网过滤收集细胞，将细胞以5-10×105个/瓶的量分装至25cm2培养瓶中，置于24℃培养。以后每隔4天半量更换细胞培养液，待原代细胞生长为单层时，用0.25％的胰蛋白酶消化细胞进行传代；8-10天传代1次，传至第8代时，细胞培养液中血清含量由20％减为10％，此时细胞系建立成功。利用这种方法获得的大菱鲆肾细胞系形态为成纤维样，可以连续传代40代以上，细胞系可以直接应用于病原特性研究、疫苗研制及功能基因研究；该构建方法适用于其他鱼类构建肾细胞系。

1、  一种大菱鲆肾细胞系的构建方法，其特征在于它的方法包括以下步骤：1)、配制细胞培养液、2)、原代培养、3)、传代培养；
1)、配制细胞培养液：取GIBCO公司MEM培养基，抽滤，分装，4℃保存；用时再加入占所用总体积10-20％的胎牛血清，0.05％的2-巯基乙醇，2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子，4℃存放；
2)、原代培养：取体重约150克大菱鲆的肾脏，置于高压灭菌处理的玻璃平皿中，PBS冲洗一次，70％酒精浸泡4分钟，PBS冲洗三次，将肾组织剪成大约1mm³的小块，加入约10倍组织块体积的0.5％胰蛋白酶，室温消化30分钟；加入2ml细胞培养液终止消化，用200目尼龙纱网过滤至新的一次性培养皿中，加入2ml细胞培养液冲洗纱网再过滤一次，将滤过液收集至15ml离心管中，以2200rpm离心2分钟，去上清；加2ml细胞培养液重悬沉淀，以2200rpm再次离心2分钟，去上清；加1ml细胞培养液重悬细胞沉淀，计数细胞后，按照5-10×10⁵个/瓶的量分装至25cm²的培养瓶中，补充细胞培养液至3ml，正置于24℃培养箱中培养；然后每隔4天半量更换细胞培养液一次；
3)、传代培养：原代培养细胞开始增殖后，细胞数目增多，细胞生长成为单层后，以0.25％胰酶消化法传代悬起细胞，以1∶1-1∶2进行传代；以后8-10天传代一次；传至第8代时，细胞培养液中血清含量减为总体积的10％，此时，细胞系建立成功。

大菱鲆肾细胞系的构建方法
技术领域：
本发明属于海洋生物细胞培养技术，涉及一种利用大菱鲆肾脏组织构建大菱鲆肾细胞系的方法。
背景技术：
构建与培养动物细胞系早已成为研究病毒学、免疫学、遗传学、毒理学、肿瘤治疗的有力工具。自从20世纪60年代以来，已有超过100个的鱼类细胞系建立并应用于病毒学、免疫学方面的研究。
大菱鲆(Scophthalmus maximus)是原产欧洲的名贵鱼种，自1992年引入我国并开展工厂化养殖以来，养殖年产值已超过40亿元，成为我国北方海水养殖的一项支柱产业。然而，随着大菱鲆养殖业的快速发展，由弧菌、虹彩病毒等病原引起的疾病愈加频发，滥用药物等问题也日益严重，特别是2006年的“多宝鱼(大菱鲆)药残事件”，更让大菱鲆养殖业遭受沉重打击，至今仍未能完全恢复。综观整个大菱鲆养殖产业，病害问题已经成为制约其健康发展的主要瓶颈。而从根本上解决大菱鲆的病害问题，必须加强对菱鲆致病病原特性和免疫抗病基因功能的研究力度，细胞系作为其中必不可少的研究工具更是引起众多研究者的兴趣。
迄今为止，虽然有大菱鲆胚胎细胞系(中国水产科学研究院黄海水产研究所，陈松林，Aquaculture 249：63-68)、鳍细胞系(中国海洋大学，樊廷俊，中国海洋大学学报37(5)：759-766)等少数几个细胞系的文献报道，但是仍未见免疫组织如脾、肾等细胞系的报道。如果能利用大菱鲆免疫组织，体外建立免疫组织的细胞系，就可以更有针对性地研究病原在免疫细胞系中的致病机理，另一方面，也可以更方便的研究免疫抗病基因的功能。
发明内容：
本发明的目的在于利用大菱鲆免疫组织——肾脏，提供一种大菱鲆肾细胞系的建立技术以及其在研究病毒及功能基因中的应用。
大菱鲆肾细胞系的构建方法，包括以下步骤：1、配制细胞培养液、2、原代培养、3、传代培养。
1、配制细胞培养液：取GIBCO公司MEM培养基，抽滤，分装，4℃保存；用时再加入占所用总体积10-20％的胎牛血清，0.05％的2-巯基乙醇，2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子，4℃存放。
2、原代培养：取体重约150克大菱鲆的肾脏，置于高压灭菌处理的玻璃平皿中，PBS冲洗一次，70％酒精浸泡4分钟，PBS冲洗三次，将肾组织剪成大约1mm³的小块，加入约10倍组织块体积的0.5％胰蛋白酶，室温消化30分钟。加入2ml细胞培养液终止消化，用200目尼龙纱网过滤至新的一次性培养皿中，加入2ml细胞培养液冲洗纱网再过滤一次，将滤过液收集至15ml离心管中，以2200rpm离心2分钟，去上清。加2ml细胞培养液重悬沉淀，以2200rpm再次离心2分钟，去上清。加1ml细胞培养液重悬细胞沉淀，计数细胞后，按照5-10×10⁵个/瓶的量分装至25cm²的培养瓶中，补充细胞培养液至3ml，正置于24℃培养箱中培养。然后每隔4天半量更换细胞培养液一次。
3、传代培养：原代培养细胞开始增殖后，细胞数目增多，细胞生长成为单层后，以0.25％胰酶消化法传代悬起细胞，以1∶1-1∶2进行传代；以后8-10天传代一次；传至第8代时，细胞培养液中血清含量减为总体积的10％，此时，细胞系建立成功。
该细胞建系技术的主要特点是：
细胞系可以连续传代，大菱鲆肾细胞已传40代以上；能提供大量的大菱鲆肾细胞系；细胞系可以直接应用于病原特性研究、疫苗研制及功能基因研究。
用上述大菱鲆肾细胞系的构建方法构建的大菱鲆肾细胞系，其最适生长温度为24℃，生长曲线正常，染色体为正常的44条，可以进行连续传代，也可以对其进行冷冻保存。以大菱鲆红体病虹彩病毒转染细胞系可以检测到病毒粒子的存在，以pEGFP-N3进行基因转染实验，也观察到较强的绿色荧光，证实大菱鲆肾细胞系可以直接应用于病毒感染试验及外源基因功能研究。
本发明大菱鲆肾细胞系的构建方法重复性强，染色体鉴定方法可信，配制的培养液营养成分全面，取材的大菱鲆体重恰当，该构建方法可以适用于构建其他鱼类的肾组织来源的鱼类细胞系，应用价值极大。
附图说明：
图1：相差显微镜下传代培养的大菱鲆肾细胞系；
A：大菱鲆肾细胞原代；B：大菱鲆肾细胞17代；
图2：大菱鲆肾细胞系在不同温度下的生长曲线；
图3：大菱鲆肾细胞系的染色体核型图；
A：染色体数目分布；B：二倍体中期分相；C：核型；
图4：大菱鲆肾细胞系感染大菱鲆红体病虹彩病毒图片；
A：细胞感染病毒之前；B：细胞感染病毒5天后；C、D：感染病毒的细胞电镜切片图；n表示细胞核；
图5：大菱鲆肾细胞系转染pEGFP-N3后的荧光图片。
具体实施方式：
下面通过实施例结合附图详细叙述本发明的构建、鉴定和应用方法：
一、大菱鲆肾细胞系的构建方法，步骤如下：1、配制细胞培养液、2、原代培养、3、传代培养。
1、配制细胞培养液：取9.6克GIBCO公司MEM培养基和4.76克Hepes，充分溶解混匀4小时后，用NaOH调节pH为7.4，然后抽滤，分装，4℃保存保存；用时再加入占所用体积20％的胎牛血清、0.05％的2-巯基乙醇，2ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子，4℃存放。
2、原代培养：选取体重约150克的大菱鲆取肾脏，置于高压灭菌处理的玻璃平皿中，PBS冲洗一次，70％酒精浸泡4分钟，PBS冲洗三次，将肾组织剪成大约1mm³的小块，加入组织块约10倍体积的0.5％胰蛋白酶，室温消化30分钟。加入2ml细胞培养液终止消化，用200目尼龙纱网过滤至新的一次性培养皿中，加入2ml细胞培养液冲洗纱网再过滤一次，将滤过液收集至15ml离心管中，以2200rpm离心2分钟，去上清。加2ml细胞培养液重悬沉淀，以2200rpm再次离心2分钟，去上清。加1ml细胞培养液重悬细胞沉淀，计数细胞后，按照5×10⁵/瓶的量分装至25cm²的培养瓶中，补充细胞培养液至3ml，正置于24℃培养箱中培养。然后每隔4天半量更换细胞培养液一次。
3、传代培养：原代培养细胞开始增殖后，细胞数目增多，细胞生长成为单层后(如图1，A所示)，以0.25％胰酶消化法传代悬起细胞，以1∶2进行传代；以后8天传代一次；传至第8代时，细胞培养液中血清含量减为总体积的10％；自接种组织至今，已传代40代，细胞已能稳定增值，可定为细胞系，命名为SMKC。该细胞系主要细胞类型为成纤维样细胞(如图1，B所示)。
二、大菱鲆肾细胞系的鉴定和应用方法：包括：1、细胞的冻存与复苏、2、细胞生长曲线绘制、3、染色体分析、4、病毒感染实验、5、GFP报告基因的细胞转染。
1、细胞的冻存与复苏：
1)、细胞的冻存：选取生长旺盛、处于指数生长期的、细胞密度90％以上的一瓶细胞，加入1ml 0.25％胰蛋白酶消化2分钟，吸去消化液，用2ml冻存液(含10％二甲基亚砜的细胞培养液)悬浮细胞，移至冻存管，4℃放置30分钟，-80℃冰箱放置12小时，然后移至液氮中保存，并做好记录。
2)、细胞的复苏：自液氮中取出保存的冻存管，迅速置于40℃水浴中融化，2200rpm离心5分钟，弃上清，加入2ml细胞培养液悬起细胞，转移至培养瓶中，放置于培养箱中24℃培养，待细胞贴壁后弃上清，加入3ml新的细胞培养液。
2、细胞生长曲线绘制：
为了分析大菱鲆肾细胞系的生长情况，取15代细胞接种于12个十二孔板，每板5孔接种细胞，每孔2×10⁴个细胞，每3个十二孔板为一组，将四组孔板分别置于15℃，20℃，24℃，30℃的培养箱中培养。在接种后的第1，2，3，4，5天，在四组孔板中，每组各取3个十二个孔板中各一孔的细胞，以0.25％胰蛋白酶消化，细胞计数板计数。以培养时间为横坐标，以每ml细胞数量为纵坐标，绘制生长曲线，如图2所示。从图中可见，24℃为大菱鲆肾细胞系的最适生长温度。
3、染色体分析：
将12代大菱鲆肾细胞以4×10⁶个/瓶的密度接种于25cm²的培养瓶中，24℃培养36h后，加入终浓度0.5ug/ml的秋水仙素，3h后，消化收集细胞，离心后的细胞沉淀以0.075M KCl溶液处理25分钟，离心后去上清，加入1ml的卡诺固定液(甲醇∶乙酸＝3∶1)，预固定2分钟，离心后细胞沉淀再次用卡诺固定液固定15分钟。最后离心，细胞重悬于0.5ml的卡诺固定液中，-20℃保存过夜。第二天，细胞悬液以冷滴法滴片，风干，5％吉姆萨染色25分钟，最后用Nikon显微镜观察。结果显示大菱鲆肾细胞的染色体数目在26-84之间，其中主要的染色体数目为44条，在观察的100个分裂相细胞中占68％(图3，A)，染色体核型为2n＝4m+12st+28t(图3，B、C)。
4、病毒感染实验：
以第17代大菱鲆肾细胞为对象，检测大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)对该细胞的敏感程度。细胞接种24小时后，将浓度为10³TCID₅₀/ml的病毒溶液加入细胞培养瓶中，1小时后，移去病毒溶液，更换新鲜细胞培养液，继续培养，约5天后，观察到细胞病变效应(CPE)后(图4，A，B)，将细胞做电镜切片观察。
将感染TRBIV病毒的SMKC细胞离心后，用2.5％戊二醛4℃固定4小时，0.1M PBS缓冲液冲洗3次，每次10分钟。1％锇酸4℃固定2小时，0.1M PBS缓冲液冲洗3次，每次10分钟。乙醇系列梯度脱水，30％，50％，70％，90％，100％的乙醇每次10分钟，其中100％两次。Epon812环氧树脂包埋，37℃、45℃、65℃温箱固化，每级温度24小时。UltracutE超薄切片机超薄切片，醋酸双氧铀硝酸铅染色。JOEL公司JEM-1200EX透射电镜结果显示，在大菱鲆肾细胞系中观察到大量TRBIV病毒粒子(图4，C，D)。
5、GFP报告基因的细胞转染：
转染前一天，将第12代SMKC细胞以3×10⁵个/孔的密度接种于六孔板中，24℃培养。转染时，细胞密度超过80％，以Invitrogen公司的Lipofectamine 2000转染pEGFP-N3。具体步骤为将5ul Lipofectamine2000加入到包含245ul细胞培养液(不含血清)的1.5ml离心管中，另一个离心管中加入10ul pEGFP-N3(100ng/ul)和240ul不含血清的细胞培养液。5分钟后，将上述两管溶液混合，室温放置25分钟。500ul混合液加入到包含2ml细胞培养液(不含血清)的六孔板之一孔中，24℃培养6小时，然后，将培养液替换为正常包含血清的细胞培养液。36小时后，用Nikon ECLIPSE TE2000-U荧光显微镜观察绿色荧光的表达，发现约有30％以上的细胞表达较强荧光(图5)。