一种花脸蘑蛋白LsAPI及其制备方法和应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101671386 B (45)授权公告日 2012.05.02 CN 101671386 B *CN101671386B* (21)申请号 200910093040.4 (22)申请日 2009.09.25 C07K 7/08(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/18(2006.01) A01N 47/44(2006.01) A01P 1/00(2006.01) (73)专利权人 北京市农林科学院 地址 100097 北京市海淀区曙光花园中路 9 号 (72。

2、)发明人 李兴红 燕继晔 严红 周莹 马凤金 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 胡长远 CN 101375691 A,2009.03.04, 陈湘莲等 . 花脸香蘑发酵物的体外抗氧 化及抗肿瘤活性研究 .中国菌物学会第四届 会员代表大会暨全国第七届菌物学学术讨论 会 .2008,263-266. 罗心毅等 . 人工栽培花脸香蘑氨基酸研 究 .氨基酸和生物资源 .2003, 第 25 卷 ( 第 3 期 ),14-15. (54) 发明名称 一种花脸蘑蛋白 LsAPI 及其制备方法和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种花脸蘑蛋白 LsAPI 及其 制。

3、备方法， LsAPI 的制备方法为 ： 将花脸蘑子实 体粉末加入磷酸缓冲液中浸泡， 离心 ； 向所得上 清液中加入硫酸铵至饱和度为 50和 70， 在 0 6下放置 6 16h， 离心 ； 用磷酸缓冲液溶 解沉淀、 重蒸馏水透析、 用超滤管进行超滤得蛋 白溶液 ； 再经阴离子交换柱分离， 用 0.02mol/ L、 pH8.0Tris-HCl 洗脱， 洗脱液中所含物质即为 LsAPI。LsAPI 为单一的蛋白， 为其遗传工程应用 提供了基础 ； 其次， LsAPI 对烟草花叶病毒抑制效 果好 ； 还有 LsAPI 为天然提取物， 对人类和环境均 无害 ； LsAPI 制备方法简单， 原料易得，。

4、 成本较低。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘树柏 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 CN 101671386 B1/1 页 2 1. 一种抗植物病毒的花脸蘑蛋白 LsAPI， 其特征在于所述的花脸蘑蛋白 LsAPI 来自花 脸蘑(Lepista sordida)， 其N端氨基酸序列为 ： ATVSFFAGADCTGRN ； 经SDS聚丙烯酰胺凝胶 电泳鉴定， 所述的花脸蘑蛋白 LsAPI 的分子量为 16.4KD ； 所述的花脸蘑蛋白 LsAPI， 按照如 下方法制备 ： (1) 将花脸蘑子实体粉末 。

5、2g 加入到 0.025M、 pH8.0 的磷酸缓冲液 20ml 中浸泡 2h， 然后 10000rpm 离心 25min， 弃沉淀， 取上清液 ； (2) 向步骤 (1) 所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为 50， 在 4放置 8h， 然后 10000rpm 离心 25min， 弃沉淀， 取上清液 ； (3) 向步骤 (2) 所得上清液加入硫酸铵至饱和度为 70， 在 4放置 8h 后， 10000rpm 离心 25min， 收取沉淀 ； (4) 离心后的沉淀用 0.025mol/L、 pH8.0 的磷酸缓冲液溶解后， 然后经 3 倍重量的重蒸 馏水透析10小时， 将透析得到的透析液分别用Mi。

6、llipore公司生产的Amicon Ultra-153KD 和 30KD 超滤管进行超滤截留， 得到分子量在 9 90KD 的蛋白溶液 ； (5) 步骤 (4) 所得蛋白溶液经阴离子交换柱分离， 用 0.02mol/L、 pH8.0Tris-HCl 洗脱， 收集洗脱液， 该洗脱液中所含物质即为花脸蘑蛋白 LsAPI。 2. 权利要求 1 所述的花脸蘑蛋白 LsAPI 的制备方法， 包括如下步骤 ： (1) 将花脸蘑子实体粉末 2g 加入到 0.025M、 pH8.0 的磷酸缓冲液 20ml 中浸泡 2h， 然后 10000rpm 离心 25min， 弃沉淀， 取上清液 ； (2) 向步骤 (。

7、1) 所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为 50， 在 4放置 8h， 然后 10000rpm 离心 25min， 弃沉淀， 取上清液 ； (3) 向步骤 (2) 所得上清液加入硫酸铵至饱和度为 70， 在 4放置 8h 后， 10000rpm 离心 25min， 收取沉淀 ； (4) 离心后的沉淀用 0.025mol/L、 pH8.0 的磷酸缓冲液溶解后， 然后经 3 倍重量的重蒸 馏水透析10小时， 将透析得到的透析液分别用Millipore公司生产的Amicon Ultra-153KD 和 30KD 超滤管进行超滤截留， 得到分子量在 9 90KD 的蛋白溶液 ； (5) 步骤 (4) 所得。

8、蛋白溶液经阴离子交换柱分离， 用 0.02mol/L、 pH8.0Tris-HCl 洗脱， 收集洗脱液， 该洗脱液中所含物质即为花脸蘑蛋白 LsAPI。 3. 权利要求 1 所述的花脸蘑蛋白 LsAPI 在防治烟草花叶病毒病上的应用。 权 利 要 求 书 CN 101671386 B1/6 页 3 一种花脸蘑蛋白 LsAPI 及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于生物农药， 具体涉及一种花脸蘑蛋白 LsAPI 及其制备方法和应用。 背景技术 0002 植物病毒病是仅次于真菌病的病害， 每年给农业生产造成严重损失， 如全球每年 仅烟草花叶病毒 ( 简称 TMV) 所造成的损失就可达 。

9、1 亿美元， 目前对于烟草花叶病毒还没有 有效的防治方法。 0003 食用菌含有的蛋白种类多样， 不仅营养丰富， 而且还含有许多活性物质， 对于提高 人体免疫力、 防癌、 抗癌都有一定的作用。 目前有关食用菌中抗病毒活性物质的研究主要集 中于抗动物病毒方面， 在抗植物病毒方面的研究很少。 0004 花 脸 蘑 (Lepista sordida)，属 担 子 菌 亚 门 (Basidiomycotina)，层 菌 纲 (Hymenomycetes)， 伞菌目 (Agaricales)， 口蘑科 (Tricholomataceae)， 香蘑属 (Lepista)。 其子实体一般中等大小 ； 幼嫩时。

10、其菌盖稍上凸， 呈钟状， 成熟的子实体菌盖呈平展状态。花 脸蘑蛋白质含量丰富， 粗蛋白含量为40.5， 且氨基酸组成比较齐全。 但是其人工培养较困 难。 在我国， 野生花脸蘑的分布较广， 在黑龙江， 河北， 河南， 甘肃， 青海， 四川， 新疆， 西藏， 内 蒙古， 广西， 云南， 湖南， 福建均有分布。 专利申请 花脸蘑提取物以及它的制备方法与应用 (200810223439.5) 公开了一种花脸蘑提取物和花脸蘑蛋白提取物， 以及它们在防治烟草花 叶病毒病上的应用， 但是并没有明确具体的活性物质， 因此， 有待进一步的研究和探索。 发明内容 0005 本发明目的是提供一种抗植物病毒的花脸蘑蛋。

11、白 LsAPI。 0006 本发明另一个目的是提供上述花脸蘑蛋白 LsAPI 的制备方法。 0007 本发明第三个目的是提供上述花脸蘑蛋白 LsAPI 在防治烟草花叶病毒病上的应 用。 0008 实现本发明的技术方案如下 ： 0009 本发明一种抗植物病毒的花脸蘑蛋白 LsAPI， 所述花脸蘑蛋白来自花脸蘑 (Lepista sordida)， 其 N 端氨基酸序列为 ： ATVSFFAGADCTGRN(SEQ ID No ： 1)。 0010 上述花脸蘑蛋白 LsAPI， 按照如下方法制备 ： 0011 (1)、 将花脸蘑子实体粉末加入 0.01 0.05mol/L、 pH6.0 9.0 的。

12、磷酸缓冲液中 浸泡 1 3h， 然后离心， 收集上清液 ； 0012 (2)、 向步骤(1)所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为50， 在06下放置6 16h， 然后离心， 收集上清液 ； 0013 (3)、 向步骤 (2) 所得的上清液中加入硫酸铵至饱和度为 70， 在 0 6下放置 6 16h， 然后离心， 收集沉淀 ； 0014 (4)、 用 0.1 0.3mol/L、 pH 为 6.0 9.0 的磷酸缓冲液溶解步骤 (3) 所得沉淀， 然后经 1 3 倍重量的重蒸馏水透析 8 16 小时， 将透析得到的透析液分别用 3KD 和 30KD 说 明 书 CN 101671386 B2/6 页 。

13、4 的超滤管进行超滤截留， 留取分子量为 9 90KD 之间的蛋白溶液 ； 0015 (5) 步骤 (4) 所得蛋白溶液经阴离子交换柱分离， 用 0.02mol/L、 pH8.0 的 Tris-HCl 洗脱， 收集洗脱液， 该洗脱液中所含物质即为花脸蘑蛋白 LsAPI。 0016 按照通用的命名法， 将上述所得花脸蘑蛋白命名为 LsAPI(LepistaSordida Antivirus Protein)。 0017 上述花脸蘑蛋白LsAPI步骤(1)中所述的花脸蘑菌丝干粉与磷酸缓冲液之间的比 例为 1g 10 25ml。 0018 上述花脸蘑蛋白 LsAPI 步骤 (1) 中所述的磷酸缓冲液。

14、的 pH 值优选为 8.0。 0019 上述花脸蘑蛋白 LsAPI 步骤 (1)、 (2) 或步骤 (3) 中所述的离心的速度为 10000rpm。 0020 上述花脸蘑蛋白 LsAPI 步骤 (1)、 (2) 或步骤 (3) 中所述的离心的时间为 25min。 0021 所述的花脸蘑菌丝干粉可于市场上购买得到。 0022 上述花脸蘑蛋白 LsAPI 的制备方法， 包括如下步骤 ： 0023 (1)、 将花脸蘑子实体粉末加入 0.01 0.05mol/L， pH6.0 9.0 的磷酸缓冲液中 浸泡 1 3h， 然后离心， 收集上清液 ； 0024 (2)、 向步骤(1)所得上清液中加入硫酸铵至。

15、饱和度为50， 在06下放置6 16h， 然后离心， 收集上清液 ； 0025 (3)、 向步骤 (2) 所得的上清液中加入硫酸铵至饱和度为 70， 在 0 6下放置 6 16h， 然后离心， 收集沉淀 ； 0026 (4)、 用 0.1 0.3mol/L、 pH 为 6.0 9.0 的磷酸缓冲液溶解步骤 (3) 所得沉淀， 然后经 1 3 倍重量的重蒸馏水透析 8 16 小时， 再将透析得到的透析液分别用 3KD 和 30KD 的超滤管进行超滤截留， 留取分子量为 9 90KD 之间的蛋白溶液 ； 0027 (5) 步 骤 (4) 所 得 蛋 白 溶 液 经 阴 离 子 交 换 柱 分 离，。

16、 然 后 用 0.02mol/L、 pH8.0Tris-HCl 洗脱， 收集洗脱液， 洗脱液中所含物质即为花脸蘑蛋白 LsAPI。 0028 上述制备方法步骤 (1) 中所述的花脸蘑菌丝干粉与磷酸缓冲液之间的比例为 1g 10 25ml。 0029 上述制备方法步骤 (1) 中所述的磷酸缓冲液的 pH 值优选为 8.0。 0030 上述制备方法步骤 (1)、 (2) 或步骤 (3) 中所述的离心的速度为 10000rpm。 0031 上述制备方法步骤 (1)、 (2) 或步骤 (3) 中所述的离心的时间为 25min。 0032 上述制备方法如无特别说明， 均为常规方法。 0033 本发明花脸。

17、蘑蛋白 LsAPI 可用于防治植物病毒， 如烟草花叶病毒等。具体方法为 将本发明花脸蘑蛋白用水稀释至蛋白总浓度为 100 200ug/mL， 喷施于 3 4 叶期烟草上 即可。 0034 本发明具有的优点和有益效果 ： (1) 本发明将花脸蘑蛋白提取物中的活性物质 具体为一种单一的蛋白， 为获得该蛋白的氨基酸序列及其编码基因提供了基础， 进而为遗 传工程应用该蛋白提供了可能 ； (2) 本发明花脸蘑蛋白 LsAPI 对植物病毒的抑制效果好， 如在花脸蘑蛋白浓度为 100ug/mL 时喷施烟草 72 小时后， 对烟草花叶病毒的抑制率达到 91.56； (3) 本发明花脸蘑蛋白 LsAPI 为天然。

18、提取物， 对人类和环境均无害， 使用安全 ； (4) 本发明花脸蘑蛋白 LsAPI 制备方法简单， 原料易得， 成本较低， 适于大规模的生产和应用。 说 明 书 CN 101671386 B3/6 页 5 附图说明 0035 图1为花脸蘑蛋白LsAPI的SDS-PAGE鉴定图谱， 其中1为LsAPI， 2为分子量标准。 0036 图 2 为用分子筛 (Gel filtration) 鉴定花脸蘑蛋白 LsAPI 的分子量的曲线图其 中图 2a 中 A 为牛血清白蛋白、 B 为鸡卵清蛋白、 C 为胰蛋白酶 ； 0037 图 2b 中为花脸蘑蛋白 LsAPI。 具体实施方式 0038 下述实施例中所。

19、述的方法， 如无特别说明， 均为常规方法。 下述实施例中所述的百 分含量， 如无特别说明， 均为质量百分含量。 0039 实施例 1 花脸蘑蛋白 LsAPI 的制备 0040 按照如下方法制备 ： 0041 (1) 将花脸蘑子实体粉末 2g 加入到 0.025M、 pH8.0 的磷酸缓冲液 20ml 中浸泡 2h， 然后 10000rpm 离心 25min， 弃沉淀， 取上清液。 0042 (2) 向步骤 (1) 所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为 50， 在 4放置 8h， 然后 10000rpm 离心 25min， 弃沉淀， 取上清液。 0043 (3) 向步骤 (2) 所得上清液加入硫酸铵。

20、至饱和度为 70， 在 4放置 8h 后， 10000rpm 离心 25min， 收取沉淀。 0044 (4) 离心后的沉淀用 0.025mol/L、 pH8.0 的磷酸缓冲液溶解后， 然后经 3 倍重量的 重蒸馏水透析 10 小时， 将透析得到的透析液分别用 Amicon Ultra-153KD 和 30KD 超滤管 (Millipore 公司生产 ) 进行超滤截留， 得到分子量在 9 90KD 的蛋白溶液。 0045 (5)步骤(4)所得蛋白溶液经阴离子交换柱分离， 用0.02mol/L、 pH8.0Tris-HCl洗 脱， 收集洗脱液， 该洗脱液中所含物质即为花脸蘑蛋白 LsAPI。 0。

21、046 实施例 2 花脸蘑蛋白 LsAPI 的制备 0047 按照如下方法制备 ： 0048 (1) 将花脸蘑子实体粉末 2g 加入到 0.03M， pH9.0 的磷酸缓冲液 30ml 中浸泡 3h， 然后 10000rpm 离心 25min， 弃沉淀， 取上清液。 0049 (2) 向步骤 (1) 所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为 50， 在 6放置 12h 后， 10000rpm 离心 25min， 弃沉淀， 取上清液。 0050 (3) 向步骤 (2) 所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为 70， 在 6 12h 后， 10000rpm 离心 25min， 弃上清， 收取沉淀。 0051 (。

22、4) 用 0.03mol/L、 pH9.0 的磷酸缓冲液溶解步骤 (3) 所得沉淀， 然后经 1 倍重量 的重蒸馏水透析 13 小时， 将透析得到的透析液分别用 Amicon Ultra-153KD 和 30KD 的超滤 管 (Millipore 公司生产 ) 进行超滤截留， 得到分子量在 9 90KD 的蛋白溶液。 0052 (5)步骤(4)所得蛋白溶液经阴离子交换柱分离， 再用0.02mol/L、 pH8.0Tris-HCl 洗脱， 收集洗脱液， 该洗脱液中所含物质即为花脸蘑蛋白 LsAPI。 0053 实施例 3 花脸蘑蛋白 LsAPI 的制备 0054 按照如下方法制备 ： 0055 。

23、(1)将花脸蘑子实体粉末2g加入0.01mol/L、 pH6.0的磷酸缓冲液50ml中浸泡1h， 说 明 书 CN 101671386 B4/6 页 6 10000rpm 离心 25min， 取上清液。 0056 (2) 向步骤 (1) 所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为 50， 在 2放置 6h， 然后 10000rpm 离心 25min， 弃沉淀， 取上清液。 0057 (3) 向步骤 (2) 所得上清液中加入硫酸铵至饱和度为 70， 在 2放置 6h， 10000rpm 离心 25min， 弃上清， 收取沉淀。 0058 (4) 用 0.01M， pH6.0 的磷酸缓冲液溶解步骤 (4) 。

24、中所得沉淀， 然后经 2 倍重量的 重蒸馏水透析 16 小时， 将透析得到的透析液分别用 Amicon Ultra-153KD 和 30KD 的超滤管 (Millipore 公司生产 ) 进行超滤截留， 得到分子量在 9 90KD 的蛋白溶液 ； 0059 (5)步骤(4)所得蛋白溶液经阴离子交换柱分离， 用0.02mol/L、 pH8.0Tris-HCl洗 脱， 收集洗脱液， 洗脱液中所含物质即为花脸蘑蛋白 LsAPI。 0060 实施例 4 花脸蘑蛋白 LsAPI 的电泳鉴定 0061 按照如下方法进行 ： 0062 (1) 配制分离胶和浓缩胶分离胶浓度 12 ( 每 5mL 凝胶中含 1。

25、.6mL 去离子水， 2.0mL 30 Acrylamide， 1.3mL 1.5M pH8.8Tris-HCl， 50L 10 SDS， 50L 10 过 硫酸铵， 2L TEMED)， 浓缩胶浓度 5 ( 每 3mL 凝胶中含 2.1mL 去离子水， 0.5mL 30 Acrylamide， 0.38mL 1.5M pH8.8Tris-HCl， 30L 10 SDS， 30L 10过硫酸铵， 3L TEMED)。 0063 (2) 用微量进样器取实施例 1 所制备的花脸蘑蛋白每孔进样 15L。浓缩胶 30V/ cm， 分离胶 20V/cm， 待指示剂距离凝胶底端 1cm 时停止电泳。 00。

26、64 (3) 染色及脱色 ： 固定 (30min)- 致敏 (30min)- 水洗 (3 次， 每次 10min)- 银染 (20min)-水洗(2次， 每次1min)-显色(视情况而定)-终止(10min)-保存(1冰醋酸中， 4保存 )。 0065 结果 ( 如图 1) 电泳显示只有一条蛋白条带， 无其他杂带， 说明实施例 1 中所得花 脸蘑蛋白 LsAPI 为一种单一的蛋白质， 通过迁移率计算本发明花脸蘑蛋白 LsAPI 的分子量 为 16.4KD。 0066 实施例 5 花脸蘑蛋白 LsAPI 的凝胶层析测定 0067 按照如下方法进行 ： 0068 (1) 凝胶层析过程于 4进行， 。

27、所用试剂均经过滤和脱气处理。凝胶层析采用 SephacrylTM S-200(1.6cm60cm) 预装层析柱， 去离子水充分平衡至 280nm 紫外吸光值不 再变化。 0069 (2) 用实施例 1 所制备的花脸蘑蛋白上样， 去离子水 0.5mL/min 洗脱， 280nm 检测 其紫外吸光值。标准蛋白分别采用牛血清白蛋白 (66.0kDa)、 鸡卵清蛋白 (44.28kDa) 和胰 蛋白酶 (25.0kDa)( 购于 Merck 公司 )， 以相同条件洗脱。分别记录 LsAPI 及标准蛋白的洗 脱体积， 绘制标准曲线， 计算 LsAPI 的分子量。 0070 (3) 结果根据标准蛋白分子量。

28、和洗脱体积 ( 牛血清白蛋白 (66.0kDa)、 鸡卵清蛋 白 (44.28kDa)、 胰蛋白酶 (25.0kDa) 和实施例 1 所制备的花脸蘑蛋白的洗脱体积分别为 32.46mL、 37.07mL、 109.91mL 和 36.95mL)( 见图 2a 和 2b) 绘制标准曲线， 得到回归方程， 通过花脸蘑蛋白的洗脱体积计算出本发明花脸蘑蛋白 LsAPI 的分子量为 16.4kD， 结合其 SDS-PAGE 分子量， 推测花脸蘑蛋白 LsAPI 为 2 个相同亚基组成的蛋白。 说 明 书 CN 101671386 B5/6 页 7 0071 实施例 6 本发明花脸蘑蛋白 LsAPI 的 。

29、N- 端氨基酸序列测定 0072 按照如下方法进行 ： 0073 (1) 取出 PVDF 膜， 用甲醇浸泡数秒钟， 然后放入 CAPS 电印迹缓冲液中。 0074 (2) 取出实施例 4 所得的电泳凝胶， 在 CAPS 缓冲液中浸泡 10 分钟。 0075 (3) 在 50V 恒压条件下 (100-170mA) 于室温下进行电印迹转移 2 小时。 0076 (4) 取出 PVDF 膜并用去离子水略为漂洗， 用甲醇浸泡数秒钟， 然后进行染色。 0077 (5) 考马斯亮蓝染色， 可将 0.1考马斯亮蓝 R-250 溶于 40甲醇 /1乙酸， 染色 50 秒， 用 50甲醇脱色， 并用去离子水充分。

30、洗涤， 然后将剪下待测序的条带经北京大学生 命科学中心进行 N 端氨基酸序列分析。 0078 (6)结果所测得花脸蘑蛋白LsAPI的N端氨基酸序列为 ： ATVSFFAGADCTGRN(SEQ ID No ： 1)。 0079 实施例 7 花脸蘑蛋白 LsAPI 抑制烟草花叶病毒试验 0080 (1) 喷雾防治处理 ： 将实施例 1 得到的花脸蘑蛋白 LsAPI 分别用水稀释到不同的 蛋白浓度 ( 见表 1)， 分别对三至四叶期的枯斑三生烟进行整株喷雾， 每个处理三个重复， 每 个重复三株， 每株三片叶子。 同时用清水喷施于三至四叶期的枯斑三生烟作为对照(CK)， 设 置三个重复， 每个重复三。

31、株， 每株三片叶子。 0081 (2) 病毒接种液的制备 ： 病毒来源为本研究室保存的 TMV 普通株系 ( 以普通烟为 寄主， 活体保存 )， 其获取方法是 ： 将感染烟草花叶病毒 TMV 普通株系的普通烟的叶片去除 主脉， 与 pH8.0 的 0.01mol/L 的 PBS 按 1g/20ml 混合， 每 20mlPBS 加 0.015g 金刚砂， 将叶片 充分研磨， 得到接种液。 0082 (3)接种 ： 将按步骤(1)的方法喷雾72小时后得到的枯斑三生烟植株， 用步骤(2) 得到的接种液进行摩擦接种 ( 植病研究方法 ( 第三版 )， 方中达， 中国农业出版社 ) 接种后 立即用清水冲。

32、洗， 于温室中培养， 培养条件为28光照12小时， 18无光照12小时， 交替进 行。 0083 (4) 抑制率计算 ： 接种 72 小时后观察枯斑三生烟叶片产生枯斑数量， 按下式计算 出枯斑抑制率。 0084 X (CK-Y)/CK100 ( 式 I) 0085 式 I 中， X 为枯斑抑制率， 单位 ： ； CK 为清水对照叶片的平均枯斑个数， 单位 ： 个 ； Y 为经 LsAPI 诱导处理后叶片的平均枯斑个数， 单位 ： 个。 0086 表 1 花脸蘑蛋白 LsAPI 抗烟草花叶病毒试验结果 0087 说 明 书 CN 101671386 B6/6 页 8 0088 结果从表 1 可以。

33、看出， 本发明花脸蘑蛋白 LsAPI 有较高的抗 TMV 活性， 尤其在浓度 为 100g/mL 时， 其枯斑抑制率可达 90以上。 0089 序列表 0090 北京市农林科学院 0091 一种花脸蘑蛋白 LsAPI 及其制备方法和应用 0092 1 0093 PatentIn version 3.5 0094 1 0095 15 0096 PRT 0097 Lepista sordida 0098 1 0099 Ala Thr Val Ser Phe Phe Ala Gly Ala Asp Cys Thr Gly Arg Asn 0100 1 5 10 15 说 明 书 CN 101671386 B1/3 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 101671386 B2/3 页 10 图 2a 说 明 书 附 图 CN 101671386 B3/3 页 11 图 2b 说 明 书 附 图 。