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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610334107.9 (22)申请日 2016.05.19 (71)申请人 上海君微生物科技有限公司 地址 200023 上海市虹口区霍山路170号3 幢10楼354室 (72)发明人 郑秀娟储以微 (74)专利代理机构 北京连城创新知识产权代理 有限公司 11254 代理人 刘伍堂 (51)Int.Cl. C12N 5/0784(2010.01) (54)发明名称 一种快速制备树突状细胞的改良方法 (57)摘要 本发明涉及生物技术领域， 具体地说是一种 快速制备树突状细。
2、胞的改良方法。 一种快速制备 树突状细胞的改良方法， 其特征在于： 具体改良 方法步骤如下： 取患者自体血， 分离出红细胞、 单 个核淋巴细胞、 血浆； 调整单个核淋巴细胞的浓 度； 将调整好浓度的单个核淋巴细胞加入6孔板 中， 贴壁过夜； 次日， 留下未成熟的树突状细胞； 在6孔板的每个孔内加入DC-1培养基， 培养48小 时； 再在6孔板内加入DC-2培养基， 继续培养24小 时； 获得成熟树突状细胞； 检测成熟树突状细胞 的数量、 细胞活力和细胞表型及功能。 同现有技 术相比， 用自然贴壁的方法获取DC， 诱导时间短， 成本低， 无毒副作用， DC细胞的活力大于90%， 纯 度可达809。
3、0%， 有相同的效果， 更适合推广临床 使用。 权利要求书1页 说明书2页 附图1页 CN 105861438 A 2016.08.17 CN 105861438 A 1.一种快速制备树突状细胞的改良方法， 其特征在于： 具体改良方法步骤如下： （1） 取患者自体血20毫升， 用淋巴细胞分离液分离出红细胞、 单个核淋巴细胞、 血浆； （2） 用无血清培养基调整单个核淋巴细胞， 浓度为1x107/ml； （3） 将调整好浓度的单个核淋巴细胞以3ml/孔的体积加入6孔板中， 贴壁过夜， 时间为 16小时； （4） 次日， 吸弃6孔板内的上层未贴壁的细胞， 在每孔的下层留下未成熟的树突状细胞； （5。
4、） 在6孔板的每个孔内加入DC-1培养基， 体积为2.82ml/孔， 置于二氧化碳浓度为5%， 温度为37 C， 培养48小时； （6） 再在6孔板内加入DC-2培养基， 体积为180ul/孔， 继续培养24小时； （7） 获得成熟树突状细胞； （8） 检测成熟树突状细胞的数量、 细胞活力和细胞表型及功能。 2.根据权利要求1所述的一种快速制备树突状细胞的改良方法， 其特征在于： 所述的淋 巴细胞分离液为国药集团化学试剂有限公司生产。 3.根据权利要求1所述的一种快速制备树突状细胞的改良方法， 其特征在于： 所述的 DC-1培养基为在Gibco无血清培养基中加入1000U/mL派普泰克公司生产。
5、的粒细胞-巨噬细 胞集落刺激因子和1000U/mL派普泰克公司生产的白细胞介素4。 4.根据权利要求1所述的一种快速制备树突状细胞的改良方法， 其特征在于： 所述的 DC-2培养基含有1000U/mL派普泰克公司生产的肿瘤坏死因子、 10000U/mL派普泰克公司 生产的白细胞介素1、 1000U/mL派普泰克公司生产的干扰素r、 1微摩尔/升西格玛奥德里奇 公司生产的前列腺素E2、 500ng/mL的CD40L、 2.5ug/mL的R848、 TLR7/8配体。 5.根据权利要求4所述的一种快速制备树突状细胞的改良方法， 其特征在于： 所述的 CD40L为肿瘤坏死因子相关激活蛋白。 6.根据。
6、权利要求4所述的一种快速制备树突状细胞的改良方法， 其特征在于： 所述的 R848是TLR7/8的激动剂， 加入后可以刺激TLR7/8活化。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105861438 A 2 一种快速制备树突状细胞的改良方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体地说是一种快速制备树突状细胞的改良方法。 背景技术 0002 DC名为树突状细胞， 它是机体重要的免疫细胞， 在免疫细胞治疗中有着广泛的应 用前景， 在特异的肿瘤抗原刺激下， 成熟的树突状细胞能表达多种细胞因子和趋化因子， 如： MHC分子HLA-DR， 共刺激分子CD80、 CD83、 CD86等多种细胞因子。
7、， 有效诱导抗原特异性 和非特异性免疫应答反应， 增强机体免疫功能。 但DC在人外周血中比例很低， 因此提高扩增 倍数， 增加成熟的树突状细胞数， 对治疗效果有着关键的作用。 0003 为了更好发展我国生物治疗技术， 研发适合临床应用的细胞治疗方法很有必要。 本发明的目的就是克服现有技术的不足， 优化DC制备技术， 提供一种改良的DC制备方法， 本 发明成本低， 方法简便， 纯度高， 治疗效果好。 发明内容 0004 本发明为克服现有技术的不足， 为了更好发展我国生物治疗技术， 研发适合临床 应用的细胞治疗方法很有必要。 提供一种快速制备树突状细胞的改良方法， 成本低， 方法简 便， 纯度高，。
8、 治疗效果好。 0005 为实现上述目的， 设计一种快速制备树突状细胞的改良方法， 其特征在于： 具体改 良方法步骤如下： （1） 取患者自体血20毫升， 用淋巴细胞分离液分离出红细胞、 单个核淋巴细胞、 血浆； （2） 用无血清培养基调整单个核淋巴细胞， 浓度为1x107/ml； （3） 将调整好浓度的单个核淋巴细胞以3ml/孔的体积加入6孔板中， 贴壁过夜， 时间为 16小时； （4） 次日， 吸弃6孔板内的上层未贴壁的细胞， 在每孔的下层留下未成熟的树突状细胞； （5） 在6孔板的每个孔内加入DC-1培养基， 体积为2.82ml/孔， 置于二氧化碳浓度为5%， 温度为37 C， 培养48。
9、小时； （6） 再在6孔板内加入DC-2培养基， 体积为180ul/孔， 继续培养24小时； （7） 获得成熟树突状细胞； （8） 检测成熟树突状细胞的数量、 细胞活力和细胞表型及功能。 0006 所述的淋巴细胞分离液为国药集团化学试剂有限公司生产。 0007 所述的DC-1培养基为在Gibco无血清培养基中加入1000U/mL派普泰克公司生产 的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和1000U/mL派普泰克公司生产的白细胞介素4。 0008 所述的DC-2培养基含有1000U/mL派普泰克公司生产的肿瘤坏死因子、 10000U/ mL派普泰克公司生产的白细胞介素1、 1000U/mL派普泰克公司生产。
10、的干扰素r、 1微摩尔/升 西格玛奥德里奇公司生产的前列腺素E2、 500ng/mL的CD40L、 2.5ug/mL的R848、 TLR7/8配 体。 说明书 1/2 页 3 CN 105861438 A 3 0009 所述的CD40L为肿瘤坏死因子相关激活蛋白。 0010 所述的R848是TLR7/8的激动剂， 加入后可以刺激TLR7/8活化； 因为TLR称为Toll样 受体， 所以R848称为配体， 就如钥匙和锁的一对一关系。 0011 本发明同现有技术相比， 用自然贴壁的方法获取DC， 诱导时间短， 成本低， 无毒副 作用， DC细胞的活力大于90%， 纯度可达8090%， 有相同的效果。
11、， 更适合推广临床使用。 0012 本发明细胞制备方法简便， 成本低， 细胞成熟度高， 特异性杀伤力强的特点， 更适 合临床细胞生物治疗使用。 附图说明 0013 图1为本发明制备树突状细胞与同型对照和磁珠分选的树突状细胞培养法的MHC II类分子及共刺激分子表达水平图。 具体实施方式 0014 下面根据附图对本发明做进一步的说明。 0015 如图1所示， 其中左侧一列为同型对照图， 左侧第二列为磁珠分选的DC细胞培养法 的MHCII类分子及共刺激分子表达水平图， 其余四列为非磁珠分选的DC细胞培养法的MHC II类分子及共刺激分子表达水平图， 两种DC细胞制备方式相比， 本发明制备的DC细胞。
12、具有 较好的完全成熟表型。 0016 DC-1培养基为： Gibco无血清培养基加入1000U/mL派普泰克公司生产的粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子和1000U/mL派普泰克公司生产的白细胞介素4。 0017 DC-2培养基为： 1000U/mL派普泰克公司生产的肿瘤坏死因子、 10000U/mL派普 泰克公司生产的白细胞介素1、 1000U/mL派普泰克公司生产的干扰素r、 1微摩尔/升西格玛 奥德里奇公司生产的前列腺素E2、 500ng/mL的CD40L、 2.5ug/mL的R848、 TLR7/8配体。 0018 CD40L为肿瘤坏死因子相关激活蛋白。 0019 R848是TLR7/8的。
13、激动剂， 加入后可以刺激TLR7/8活化。 0020 具体改良方法步骤如下： （1） 取患者自体血20毫升， 用淋巴细胞分离液分离出红细胞、 单个核淋巴细胞、 血浆； （2） 用无血清培养基调整单个核淋巴细胞， 浓度为1x107/ml； （3） 将调整好浓度的单个核淋巴细胞以3ml/孔的体积加入6孔板中， 贴壁过夜， 时间为 16小时； （4） 次日， 吸弃6孔板内的上层未贴壁的细胞， 在每孔的下层留下未成熟的树突状细胞； （5） 在6孔板的每个孔内加入DC-1培养基， 体积为2.82ml/孔， 置于二氧化碳浓度为5%， 温度为37 C， 培养48小时； （6） 再在6孔板内加入DC-2培养基， 体积为180ul/孔， 继续培养24小时； （7） 获得成熟树突状细胞； （8） 检测成熟树突状细胞的数量、 细胞活力和细胞表型及功能。 说明书 2/2 页 4 CN 105861438 A 4 图1 说明书附图 1/1 页 5 CN 105861438 A 5 。