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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610342416.0 (22)申请日 2016.05.20 (71)申请人 内蒙古大学 地址 010021 内蒙古自治区呼和浩特市赛 罕区大学西路235号内蒙古大学 (72)发明人 梁成光周红霞 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (51)Int.Cl. C12N 5/075(2010.01) C12N 5/073(2010.01) (54)发明名称 胶质细胞源性神经营养因子GDNF的新用途 (57)摘要 本发明提供了一种胶质。
2、细胞源性神经营养 因子GDNF的新用途， 包括在45-55ng/ml的工作浓 度下促进牛卵母细胞成熟或牛早期胚胎发育。 本 发明还提供了一种促牛卵母细胞成熟培养液和 一种促牛早期胚胎发育培养液。 本发明所提供的 GDNF的新用途通过在培养液中添加GDNF因子提 高卵母细胞成熟率和早期胚胎发育率， 比常规培 养液培养下的成熟率和发育率提高10， 能够为 体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术提供高质量的 成熟卵母细胞和早期胚胎。 权利要求书1页 说明书8页 CN 105861427 A 2016.08.17 CN 105861427 A 1.胶质细胞源性神经营养因子GDNF的新用途， 其特征在于。
3、， 包括在45-55ng/ml的工作 浓度下促进牛卵母细胞成熟或牛早期胚胎发育。 2.根据权利要求1所述的新用途， 其特征在于， 包括用促牛卵母细胞成熟培养液培养牛 卵母细胞， 所述促牛卵母细胞成熟培养液包括以下浓度的各组分： 45-55ng/ml的GDNF、 9-11 体积的FBS、 90-110ng/ml的E2、 0.015-0.025AU/ml的FSH、 0.9-1.1IU/ml的LH、 35-45体 积的溶液X以及45-55体积的溶液Y， 其中， 所述溶液X为以M199培养基为基本培养基含 有25mM的Hepes， 溶液Y为M199培养基。 3.根据权利要求1或2所述的新用途， 其特征。
4、在于， 所述牛卵母细胞为GV期开始至MII期 结束阶段的牛卵母细胞。 4.根据权利要求3所述的新用途， 其特征在于， 包括将GV期开始的牛卵母细胞在pH值 7.2-7.4、 二氧化碳浓度5、 湿度100、 温度38.5的条件下培养22-26小时。 5.根据权利要求1所述的新用途， 其特征在于， 包括用促牛早期胚胎发育培养液培养牛 早期胚胎， 所述促牛早期胚胎发育培养液包括以下浓度的各组分： 45-55ng/ml的GDNF， 0.004-0.006g/ml的BSA， 0.45-0.55 g/ml的肌醇， 0.028-0.030g/ml的谷氨酸。 6.根据权利要求5所述的新用途， 其特征在于， 所。
5、述牛早期胚胎为受精卵期至囊胚期阶 段的牛早期胚胎。 7.根据权利要求6所述的新用途， 其特征在于， 包括将受精卵在pH值7.2-7.4、 二氧化碳 浓度5、 湿度100、 温度38.5的条件下培养， 每45-50小时更换一半体积的培养液。 8.一种促牛卵母细胞成熟培养液， 其特征在于， 包括以下浓度的各组分： 45-55ng/ml的 GDNF、 9-11体积的FBS、 90-110ng/ml的E2、 0.015-0.025AU/ml的FSH、 0.9-1.1IU/ml的LH、 35-45体积的溶液X以及45-55体积的溶液Y， 其中， 所述溶液X为以M199培养基为基本培 养基含有25mM的H。
6、epes， 溶液Y为M199培养基。 9.一种促牛早期胚胎发育培养液， 其特征在于， 包括以下浓度的各组分： 45-55ng/ml的 GDNF， 0.004-0.006g/ml的BSA， 0.45-0.55 g/ml的肌醇， 0.028-0.030g/ml的谷氨酸。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105861427 A 2 胶质细胞源性神经营养因子GDNF的新用途 技术领域 0001 本发明属于动物繁殖育种领域， 具体涉及胶质细胞源性神经营养因子GDNF的新用 途。 背景技术 0002 对于大多数哺乳动物而言， 繁衍后代是生命周期中除个体生存之外最重要的生命 活动。 后代的繁衍起始于雌性动。
7、物卵母细胞生长、 成熟、 受精和早期胚胎发育。 对于例如牛 和羊的良种家畜而言， 人们常采用体外受精-胚胎移植(IVF-ET)技术进行扩繁， 这一技术是 以卵母细胞的体外成熟开始的。 因此， 卵母细胞成熟质量的好坏直接影响了后代的产出。 市 面上主要以M199为牛卵母细胞体外成熟液的基础液， 在体外成熟培养时， 基础液中加入 100ng/ml雌二醇、 0.02AU/ml的FSH、 1IU/ml的LH和10的FBS； 早期胚胎体外发育液为SOF和 RCC1。 但是现有的牛卵母细胞体外成熟方法和早期胚胎体外发育方法效果不佳。 0003 模拟体内条件是提高卵母细胞成熟率和早期胚胎发育率的最佳途径。 。
8、卵母细胞成 熟和早期胚胎发育过程中除内源性的基因表达与调控之外， 外界信号分子也是影响其能否 正常发育的重要调控方式之一。 这种调控最常见也是最直接的一种方式就是通过旁分泌因 子来发挥作用， 因此有必要对牛卵母细胞和早期胚胎发育的调控机制进行深入的研究， 为 更好的实现二者在体外受精和胚胎移植中的应用提供有效手段。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种促进牛卵母细胞成熟或牛早期胚胎发育的方法。 0005 为了达到以上目的， 本发明提供了胶质细胞源性神经营养因子GDNF的新用途， 包 括在45-55ng/ml的工作浓度下促进牛卵母细胞成熟或牛早期胚胎发育。 0006 具体包括在牛卵母细胞。
9、或牛早期胚胎培养液中添加工作浓度为45-55ng/ml的 GDNF获得促牛卵母细胞成熟培养液或促牛早期胚胎发育培养液。 0007 胶质细胞源性神经营养因子(Glialcelllinederivedneurotrophicfactor， GDNF)是一种神经营养因子， 最早是从大鼠胶质瘤细胞系上清液中分离出来的。 GDNF是转化 生长因子 超家族(Transforminggrowthfactor-bata， TGF )的远祖成员， 家族中还包括 neurturin、 artemin和persephin等同源二聚体， 它们的受体分别为Gfra1、 Gfra2、 Gfra3和 Gfra4。 GDNF。
10、分子量为15kDa。 目前发现其对中枢神经系统和外周神经系统的神经元的生存 具有重要作用。 0008 可选的， 当所述用途为促进牛卵母细胞成熟时， 包括用促牛卵母细胞成熟培养液 培养牛卵母细胞， 所述促牛卵母细胞成熟培养液包括以下浓度的各组分： 45-55ng/ml的 GDNF、 9-11体积的FBS、 90-110ng/ml的E2、 0.015-0.025AU/ml的FSH、 0.9-1.1IU/ml的LH、 35-45体积的溶液X以及45-55体积的溶液Y， 其中， 所述溶液X为以M199培养基为基本培 养基含有25mM的Hepes， 溶液Y为M199培养基。 优选的， 当所述促牛卵母细胞。
11、成熟培养液包括 以下浓度的各组分时， 能够获得最佳的促成熟效果： 50ng/ml的GDNF， 10体积的FBS， 说明书 1/8 页 3 CN 105861427 A 3 100ng/ml的E2、 0.02AU/ml的FSH、 1IU/ml的LH、 40体积的溶液X(Gibco， 货号： 12340-030) 和50体积的溶液Y(Gibco， 货号： 11150-059)可选的， 所述牛卵母细胞为GV期开始至MII期 结束阶段的牛卵母细胞。 0009 其中， GV期是指卵母细胞静止于第一次减数分裂前期的双线期， 也称生发泡时期。 0010 MII期是指卵母细胞静止于第二次减数分裂中期， 也是卵。
12、母细胞成熟时期。 0011 在牛卵母细胞GV期开始至MII期结束过程中的任何时间点添加工作浓度的GDNF均 能起到一定的促进牛卵母细胞成熟的效果。 优选的， 所述用途为将GV期开始的牛卵母细胞 在促牛卵母细胞成熟培养液中培养至MII期结束。 0012 优选的， 所述用途为将GV期开始的牛卵母细胞在pH值7.2-7.4、 二氧化碳浓度5、 湿度100、 温度38.5的条件下培养22-26小时， 进一步优选为24小时。 0013 可选的， 当所述用途为促进牛早期胚胎发育时， 包括用促牛早期胚胎发育培养液 培养牛早期胚胎， 所述促牛早期胚胎发育培养液包括以下浓度的各组分： 45-55ng/ml的 G。
13、DNF， 0.004-0.006g/ml的BSA， 0.45-0.55 g/ml的肌醇， 0.028-0.030g/ml的谷氨酸。 0014 优选的， 当所述促牛早期胚胎发育培养液包括以下浓度的各组分时能够获得最佳 的促发育效果： 50ng/ml的GDNF， 0.006g/ml的BSA， 0.5 g/ml的肌醇， 0.0292g/ml的谷氨酸。 0015 可选的， 所述牛早期胚胎为受精卵期至囊胚期阶段的牛早期胚胎。 0016 其中， 受精卵期是指成熟的卵母细胞与精子结合形成合子时期。 0017 囊胚期是指受精卵经过6-7天的发育， 形成内细胞团、 滋养层细胞和囊胚腔的胚胎 发育时期。 0018。
14、 在受精卵期开始至囊胚期结束过程中的任何时间点添加工作浓度的GDNF均能起 到一定的促进牛早期胚胎发育的效果。 优选的， 所述用途为将受精卵在促牛早期胚胎发育 培养液中培养至囊胚期结束。 0019 优选的， 所述用途为将受精卵在pH值7.2-7.4、 二氧化碳浓度5、 湿度100、 温度 38.5的条件下培养， 每45-50小时更换一半体积的培养液， 进一步优选每48小时更换一半 体积的培养液。 0020 本发明还提供了一种促牛卵母细胞成熟培养液， 包括以下浓度的各组分： 45- 55ng/ml的GDNF、 9-11体积的FBS、 90-110ng/ml的E2、 0.015-0.025AU/m。
15、l的FSH、 0.9- 1.1IU/ml的LH、 35-45体积的溶液X以及45-55体积的溶液Y， 其中， 所述溶液X为以M199 培养基为基本培养基含有25mM的Hepes， 溶液Y为M199培养基。 0021 优选的， 所述促牛卵母细胞成熟培养液包括以下浓度的各组分： 50ng/ml的GDNF， 10体积的FBS， 100ng/ml的E2、 0.02AU/ml的FSH、 1IU/ml的LH、 40体积的溶液X和50体 积的溶液Y。 0022 其中， 所述溶液X可以为Gibco公司货号为12340-030的商品化产品； 溶液Y可以为 Gibco公司货号为11150-059的商品化产品。 0。
16、023 本发明还提供了一种促牛早期胚胎发育培养液， 包括以下浓度的各组分： 45- 55ng/ml的GDNF， 0.004-0.006g/ml的BSA， 0.45-0.55 g/ml的肌醇， 0.028-0.030g/ml的谷氨 酸。 优选的， 包括以下浓度的各组分： 50ng/ml的GDNF， 0.006g/ml的BSA， 0.5 g/ml的肌醇， 0.0292g/ml的谷氨酸。 0024 优选的， 所述促牛早期胚胎发育培养液中还包括浓度为30 l/ml的必需氨基酸和 说明书 2/8 页 4 CN 105861427 A 4 浓度为10 l/ml的非必需氨基酸。 在本发明的一种特别优选的实施。
17、方式中， 必需氨基酸和非 必须氨基酸购自美国Sigma公司， 货号分别为： B6766和M7145。 每10ml所述促牛早期胚胎发 育培养液中还含有SOF溶液， SOF溶液的用量使得所述促牛早期胚胎发育培养液的终体积为 10ml。 0025 在本发明的一种特别优选的实施方式中， 所述促牛早期胚胎发育培养液是首先按 照实施例2中表5-10所给出的方式配制牛早期胚胎发育培养液， 再在其中加入工作浓度为 45-55ng/ml的GDNF配制而成的。 0026 本发明所提供的GDNF的新用途通过在培养液中添加GDNF因子提高卵母细胞成熟 率和早期胚胎的胚胎发育率， 比常规培养液培养下的成熟率和发育率提高。
18、10， 能够为 IVF-ET技术提供高质量成熟卵母细胞和早期胚胎。 具体实施方式 0027 下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。 0028 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 0029 实施例1GDNF对牛卵母细胞成熟的影响 0030 (1)牛卵母细胞的采集 0031 本实验采用的牛卵巢来自呼和浩特市屠宰场。 收集新鲜的牛卵巢， 用37生理盐 水清洗3次后， 在37恒温条件下迅速送往实验室。 用装配有12号针头的注射器抽取直径2- 8mm卵泡中的卵丘-卵母细胞复合体(CO。
19、Cs)。 体式显微镜下捡出卵丘包裹均匀的卵母细胞， 用牛洗卵液洗三次待用。 牛洗卵液的配方如表1所示： 0032 表1牛洗卵液 0033 0034 (2)牛卵母细胞的成熟培养 0035 分别在牛卵母细胞成熟培养液中(如表2所示)添加不同浓度的GDNF并统计各组的 卵母细胞成熟率。 成熟培养液分成六个管， 一管为对照组， 其他五管分别添加工作浓度为 1ng/ml、 5ng/ml、 15ng/ml、 50ng/ml和150ng/ml的GDNF， 并分别用四孔板平衡液体， 每孔平衡 量为500 l， 至少平衡2hrs。 采集好的COCs分为六组， 每组50枚卵丘-卵母细胞复合体， 分别 移入平衡好的。
20、六种培养液中， 在38.5、 5的CO2和100湿度的条件下培养24hrs。 0036 表2牛卵母细胞成熟培养液 说明书 3/8 页 5 CN 105861427 A 5 0037 0038 (3)去除卵丘细胞统计成熟率 0039 1.5ml的EP管中加入500 l含有300IU/ml透明质酸酶的牛洗卵液， 将结束成熟培养 的卵丘卵母细胞移入EP管内， 涡旋5分钟。 用牛洗卵液洗5遍， 将卵丘细胞洗干净。 用DAPI染 15分钟后观察核型， 统计成熟率。 0040 如表3的结果显示， 牛卵母细胞成熟培养液中添加50ng/ml的GDNF组的牛卵母细胞 成熟率为81.25(26/32)， 显著高于。
21、其他各组(P0.05)。 其他添加GDNF的各组与对照组相 比， 成熟率略有提高， 但没有统计学差异(1ng/ml： 64.71(22/34)； 5ng/ml： 68.57(24/ 35)； 15ng/ml： 71.88(23/32)； 150ng/ml： 67.74(21/31)； 对照： 62.5(20/32)。 实验共 重复进行了三次。 0041 表3不同浓度的GDNF对牛卵丘卵母细胞复合体成熟的影响 0042 0043 在牛卵母细胞成熟培养液中， 添加1ng/ml、 5ng/ml、 15ng/ml、 50ng/ml和150ng/ml 等五个浓度的GDNF， 不含因子组为对照组。 将已分。
22、好的六组牛卵母细胞进行体外成熟， 并统 计比较各组间比率和差异(没有相同上角标的两组数字之间有统计学差异， P0.05)。 0044 实施例2GDNF对牛早期胚胎发育的影响 0045 (1)牛的体外受精 0046 将采集的COCs按照以下步骤进行体外受精。 0047 、 受精A液(精子稀释液， BO液30ml+0.0583g咖啡因)和受精的B液(BO液3ml+ 说明书 4/8 页 6 CN 105861427 A 6 0.06gBSA+20 l肝素； BSA购自Sigma货号： A3311)平衡到37， 石蜡油加热37(盖在做好 的精子滴上)， 消毒解冻精子所使用的剪刀和镊子。 BO液配方如表。
23、4所示： 0048 表4BO液 0049 0050 、 解冻精子： 从液氮罐中取出精子放入37水浴锅中， 解冻10秒后移入10ml受精 A液中。 2000rpm离心5min， 弃上清。 0051 、 加入受精A液至10ml， 1700rpm离心5min， 弃上清。 0052 、 加入1ml受精A液静止2min(在37水域锅中静置)。 0053 、 1ml受精B液+1ml精子悬液混匀后做100 l精子滴， 盖上37的石蜡油。 0054 、 用1:1的A、 B混合液洗卵母细胞3次后放入准备好的精子悬浮液滴中， 20枚卵/ 每滴。 0055 、 受精6hrs。 0056 (2)牛早期胚胎发育 005。
24、7 表5SOF液 0058 0059 表6stockA 说明书 5/8 页 7 CN 105861427 A 7 0060 0061 表7stockB 0062 0063 表8stockC 0064 0065 表9stockD 0066 0067 表10牛早期胚胎发育培养液 说明书 6/8 页 8 CN 105861427 A 8 0068 0069 脱卵丘细胞： 在35mm培养皿中， 用提前平衡好的含BSA的牛早期胚胎发育培养液 (按照表5-10所示的配方进行配置)做一个200 l的滴， 将受精后的COCs移入此200 l的滴 中， 用200 l枪头吹吸30下， 已脱掉卵丘的卵母细胞移入到新。
25、的牛早期胚胎发育培养液滴 中。 未脱掉的卵母细胞继续重复上一步。 0070 已脱完卵丘的卵母细胞， 用牛早期胚胎发育培养液洗3-5遍后， 分两组培养。 一组 用本发明的含50ng/ml的GDNF的促牛早期胚胎发育培养液进行培养， 另一组用表10所示的 牛早期胚胎发育培养液进行培养。 48hrs后统计卵裂率， 捡出卵裂球， 分别移到含50ng/ml的 GDNF的促牛早期胚胎发育培养液和不含GDNF的牛早期胚胎发育培养液中继续培养， 每隔 48hrs半量体积换液。 0071 卵裂球进行体外培养过程中， 每隔24hrs分别统计4细胞、 8细胞、 桑椹胚和囊胚。 0072 表11牛早期胚胎发育情况 0。
26、073 0074 0075 将采集牛卵丘-卵母细胞复合体分为两组， 一组卵母细胞在含50ng/ml的GDNF因子 的促牛卵母细胞成熟培养液中进行体外成熟、 体外受精和胚胎体外发育， 不添加GDNF因子 的组为对照组。 统计并比较各组间比率和差异(在同一行里， 没有相同上角标的两组数字之 间有统计学差异， P0.05)。 0076 体外受精实验表明， GDNF的添加对卵母细胞受精效率没有影响。 添加50ng/ml GDNF组的受精率为95.24(120/126)， 未添加组为95.79(114/119)， 无统计学差异。 0077 (3)牛早期胚胎发育培养液中添加50ng/ml的GDNF因子对早。
27、期胚胎发育的影响与 对卵母细胞成熟的影响一致。 牛早期胚胎发育培养液(如表10所示， 氨基酸和非必须氨基酸 是美国Sigma公司生产的， 货号分别为： B6766和M7145)中添加50ng/ml的GDNF因子组的受精 卵发育到4-细胞、 8-细胞、 桑椹胚和囊胚时期比率明显高于未添加组的受精卵发育到相同 说明书 7/8 页 9 CN 105861427 A 9 时期的比率。 50ng/ml的GDNF因子组4-细胞： 76.67(92/120)， 8-细胞： 66.67(80/120)， 桑椹胚： 51.67(62/120)， 囊胚： 22.50(27/120)； 对照组4-细胞： 68.42。
28、(78/114)， 8-细 胞： 42.11(48/114)， 桑椹胚： 33.33(38/114)， 囊胚： 11.40(13/114)(P0.01)。 实验结 果表明， 在牛卵母细胞成熟培养液和牛早期胚胎发育培养液中添加50ng/ml浓度的GDNF因 子对牛卵母细胞成熟和牛早期胚胎发育有促进作用， 而对受精并无影响。 0078 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明进行了详尽的描述， 但 在本发明基础上， 可以对之进行一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因此， 在不偏离本发明精神的基础上所进行的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的 范围。 说明书 8/8 页 10 CN 105861427 A 10 。