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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610389751.6 (22)申请日 2016.05.31 (71)申请人 安徽省农业科学院水稻研究所 地址 230031 安徽省合肥市农科南路40号 (72)发明人 李浩杨剑波李莉魏鹏程 李娟杨亚春秦瑞英许蓉芳 (74)专利代理机构 北京律谱知识产权代理事务 所(普通合伙) 11457 代理人 黄云铎 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/84(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/10(20。
2、06.01) C12N 5/10(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (54)发明名称 一种水稻胚乳不表达启动子SAFES2及其分 离方法与应用 (57)摘要 本发明提供了一种水稻胚乳不表达启动子 SAFES2及其分离方法与应用。 本发明的发明人发 现、 提取并鉴定了日本晴水稻中一段具有转录调 控活性的DNA序列， 命名为启动子SAFES2或 SAFES2。 该启动子的核苷酸序列为序列表中SEQ IDNo.1中所示序列或为该序列的同源衍生物。 本发明利用作物双元表达载体pCAMBIA1391， 将 启动子SAFES2构建于GUS报告基因上游， 构建重 组表达载体， 通过农杆。
3、菌介导转化水稻愈伤组织 再生水稻植株， GUS染色实验证实该启动子是胚 乳不表达启动子。 采用本发明的启动子与具有提 高植株生长特性的基因配合使用， 可以在提高植 株根、 茎、 叶等躯干部位性状的同时， 避免对植株 胚乳部分带来任何不良影响， 具有显著的应用价 值和远期前景。 权利要求书2页 说明书5页 序列表3页 附图2页 CN 105861506 A 2016.08.17 CN 105861506 A 1.一种水稻胚乳不表达启动子SAFES2， 其特征在于， 所述水稻胚乳不表达启动子 SAFES2包含下述序列之一或者下述序列的互补序列之一： (a)序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。
4、； (b)在序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的 核苷酸序列； (c)在序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的 核苷酸序列； (d)序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的核苷 酸序列； (e)与序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有至少90同源性的核苷酸序列。 2.根据权利要求1所述的水稻胚乳不表达启动子SAFES2， 其特征在于， 所述水稻胚乳不 表达启动子SAFES2在胚乳部位不表达， 在其他部位均有表达。 3.一种表达盒， 其特征在于， 所述表达盒包含权利要求1所述的水稻胚。
5、乳不表达启动子 SAFES2。 4.一种重组表达载体， 其特征在于， 所述重组表达载体包含权利要求1所述的水稻胚乳 不表达启动子或权利要求3所述表达盒； 在所述重组表达载体中， 所述水稻胚乳不表达启动 子SAFES2连接于载体中待表达的基因序列的上游。 5.根据权利要求4所述的 重组表达载体 ， 其特征在于 ， 所述重组表达载体为 pCAMBIA1391-SAFES2， 其中pCAMBIA1391为作物双元表达载体； 所述待表达的基因为Gus基 因， 或者所述待表达的基因是具有改善胚乳以外组织性状功能的基因。 6.一种利用权利要求1中所述的水稻胚乳不表达启动子SAFES2获得相应宿主菌的方 法。
6、， 其特征在于， 所述方法包括将权利要求1中所述的水稻胚乳不表达启动子SAFES2、 权利 要求3所述的表达盒或者权利要求4或5所述的重组表达载体， 利用冻融法转入根癌农杆菌。 7.一种利用权利要求1中所述的水稻胚乳不表达启动子SAFES2获得相应转化子的方 法， 其特征在于， 所述方法包括利用权利要求6所获得的宿主菌通过农杆菌介导方法对目标 细胞、 愈伤组织或植株进行转化， 获得相应转化子。 8.一种根据权利要求1所述的水稻胚乳不表达启动子SAFES2在培育转基因作物中的应 用， 其特征在于， 所述应用包括： 将权利要求1所述的水稻胚乳不表达启动子SAFES2连接于 载体中待表达的基因序列上。
7、游， 从而构建重组表达载体； 将所述重组表达载体转化到作物 细胞、 组织或器官中进行培育， 进而获得相应转基因植株， 优选地， 所述待表达的基因为改 良作物生长特性的结构基因、 调节基因或者结构基因的反义基因。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于， 所述应用用于改良作物生长特性， 所述作 物为禾谷类作物： 水稻、 小麦、 高粱、 大麦、 燕麦、 黑麦等。 10.一种权利要求1中所述的水稻胚乳不表达启动子SAFES2的分离方法， 其特征在于， 所述方法包括： 步骤(1)、 根据所述水稻胚乳不表达启动子SAFES2的序列设计扩增引物； 步骤(2)、 以水稻品种日本晴的DNA为模板， 利用所。
8、述引物通过PCR扩增程序扩增所述水 稻胚乳不表达启动子SAFES2； 步骤(3)、 回收PCR扩增的目的片段， 并将其连接到PGEM-T-Easy载体上； 权利要求书 1/2 页 2 CN 105861506 A 2 步骤(4)、 利用连接产物按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞； 步骤(5)、 对转化产物进行PCR筛选， 获得阳性克隆， 挑取单克隆摇菌液提质粒， 用相应 限制性内切酶进行双酶切验证； 步骤(6)、 将经过鉴定的阳性克隆进行测序， 获取测序正确的核苷酸序列， 作为目标序 列。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105861506 A 3 一种水稻胚乳不表达启动子SAF。
9、ES2及其分离方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术和作物基因工程技术领域。 具体而言， 本发明涉及一种水稻 胚乳不表达启动子SAFES2及其应用。 背景技术 0002 在植物转基因系统中， 被导入的外源基因需要借助植物细胞的转录翻译和修饰体 系， 产生有活性的目标蛋白， 使目的基因发挥作用， 实现作物的遗传改良。 精确控制目的基 因产物生成的时间、 位置或数量， 对提高目标基因表达的针对性和时效性非常重要， 也是提 高转基因植物风险防控能力的重要方面。 在植物基因工程中， 通过启动子直接控制目标基 因的转录， 是调控目的基因表达最为经济有效的手段， 也是控制表达风险的可行路径。 。
10、因 此， 充分了解不同类型植物启动子的功能和特点， 对构建合适的转基因表达系统是非常重 要的。 0003 组织特异型启动子又称为器官特异型启动子， 仅在特定的组织器官或细胞类型中 具有驱动能力。 在基因工程中限定了目的基因的作用范围， 避免了组成型启动子在非必要 组织中泛式表达造成的物质能量浪费， 特别适于有组织针对性的遗传改良和生物反应器的 应用。 已发现的组织特异型启动子主要包括： 种子特异型启动子、 果实特异型启动子、 叶肉 细胞特异型启动子、 根特异型启动子。 已经应用于水稻分子育种的一些组织特异型启动子 包括： 花药特异启动子BnBp10(Cheng等， 1998)， 花药特异型启动。
11、子Pol(Peng等， 2010)， 绿色 组织特异启动子OsrbcS(Ye等， 2009)， 叶片特异启动子ZmPepc(Datta等， 1998)， 胚乳特异启 动子Gt1(Beyer等， 2002)， GluB4(He等， 2011)， 根特异启动子OsAnt1(Shrawat等， 2008)， OsRCcs(Jeong等， 2010)等等。 0004 但是， 胚乳不表达启动子的发明还鲜有报道。 水稻的胚乳即可食用的精米部位， 胚 乳不表达启动子使外源基因只在非食用部分表达， 保证食用部分不含有外源基因表达的产 物， 降低其对人类健康带来的潜在风险， 是促进转基因水稻的商业化进程的一条有。
12、效途径。 目前需要大力开展功能基因组的研究， 大量挖掘和分离具有实用价值的胚乳不表达启动 子， 消除公众对转基因水稻的偏见和顾虑， 并利用胚乳不表达启动子的特性， 充分发挥转基 因育种的优势， 培育出更多更好的新品种。 发明内容 0005 本发明的第一个目的是分离克隆一种水稻胚乳不表达启动子SAFES2， 利用该启动 子一方面驱动目标基因在水稻植株中表达， 改善其生产性能； 另一方面在胚乳中不表达目 标基因， 以此降低转基因稻米的食用安全风险。 0006 本发明的第二个目的是提供启动子SAFES2在培育转基因作物中的应用。 所涉及的 “作物” 是指禾谷类作物， 例如水稻、 小麦、 高粱、 大麦。
13、、 燕麦、 黑麦等， 优选为水稻。 0007 为了实现上述目的， 一方面， 本申请的发明人从日本晴水稻(OryzasativaL cv.Nipponbare)中分离克隆得到一段具有转录调控活性的DNA序列， 命名为SAFES2或启动 说明书 1/5 页 4 CN 105861506 A 4 子SAFES2。 启动子SAFES2包含下述序列之一或者下述序列的互补序列之一： 0008 (a)序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列； 0009 (b)在序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获 得的核苷酸序列； 0010 (c)与序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸。
14、序列具有至少90同源性的核苷酸序 列； 0011 (d)在序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获 得的核苷酸序列； 0012 (e)序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸后所获得的 核苷酸序列。 0013 优选地， 所述水稻胚乳不表达启动子SAFES2由序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序 列构成。 0014 需要说明的是： 序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列， 序列5 端的22bp， 即 “gcggtaatagaaatgtggaggg” 其为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列； 序列3 端的22bp， 即 “cactt。
15、taaacacataattaacc” ， 其为获得启动子过程中使用的反向引物的留 存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)。 需要强调的是， 本文中所提到的启动子 既可以指上述整个DNA序列， 也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。 即便本领域技 术人员在本发明的基础上， 采用其他引物获得了类似序列， 其也落入本发明的保护范围之 内。 0015 另一方面， 本发明还提供一种包含上述水稻胚乳不表达启动子SAFES2的表达盒。 0016 又一方面， 本发明还提供一种重组表达载体， 所述重组表达载体包含上述的水稻 胚乳不表达启动子SAFES2。 在所述重组表达载体中， 所述水稻胚乳不表达启。
16、动子SAFES2连 接于待表达的基因序列的上游， 待表达基因可以为任何对水稻的生长特性具有改善能力的 基因， 通过本发明的启动子驱动该基因在胚乳以外的组织特异性地集中表达， 从而实现改 善水稻生长性能而不影响胚乳生长性能的功能； 优选地， 所述待表达的基因为Gus基因。 0017 另一方面， 本发明还提供一种利用所述的水稻胚乳不表达启动子SAFES2获得相应 宿主菌的方法， 所述方法包括将所述的水稻胚乳不表达启动子SAFES2、 所述的表达盒或者 所述的重组表达载体， 利用冻融法转入根癌农杆菌。 0018 另一方面， 本发明提供一种利用所述的水稻胚乳不表达启动子SAFES2获得相应转 化子的方。
17、法， 所述方法包括将上面所获得的宿主菌通过农杆菌介导方法对目标细胞、 愈伤 组织或植株进行转化， 获得相应转化子。 其中， 所述转化子优选为转基因细胞系、 愈伤组织 或植株。 0019 再一方面， 本发明提供上述水稻胚乳不表达启动子SAFES2在培育转基因作物中的 应用。 所述应用包括： 0020 A)、 将所述的水稻胚乳不表达启动子SAFES2连接于目的基因的上游； 0021 B)、 将含有所述水稻胚乳不表达启动子SAFES2与目的基因的重组表达载体转入到 根癌农杆菌中； 0022 C)、 利用转入了所述重组表达载体的根癌农杆菌对目标植物愈伤组织进行农杆菌 转化； 说明书 2/5 页 5 C。
18、N 105861506 A 5 0023 D)、 利用转化后的愈伤组织培育相应植株， 在所述植株中， 所述的水稻胚乳不表达 启动子SAFES2能够驱动目的基因表达， 而在胚乳中不驱动目的基因表达。 0024 此外， 本发明提供一种所述水稻胚乳不表达启动子SAFES2的分离方法， 其特征在 于， 所述方法包括： 0025 步骤(1)、 根据所述水稻胚乳不表达启动子SAFES2的序列设计扩增引物； 0026 步骤(2)、 以水稻品种日本晴的DNA为模板， 利用所述引物通过PCR扩增程序扩增所 述水稻胚乳不表达启动子SAFES2； 0027 步骤(3)、 回收PCR扩增的目的片段， 并将其连接到PG。
19、EM-T-Easy载体上； 0028 步骤(4)、 利用连接产物按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞； 0029 步骤(5)、 对转化产物进行PCR筛选， 获得阳性克隆， 挑取单克隆摇菌液提质粒， 用 相应限制性内切酶进行双酶切验证； 0030 步骤(6)、 将经过鉴定的阳性克隆进行测序， 获取测序正确的核苷酸序列， 作为目 标序列。 0031 综上所述， 本发明的发明人发现、 提取并鉴定了日本晴水稻(OryzasativaL cv.Nipponbare)中一段具有转录调控活性的DNA序列， 并将其命名为SAFES2(序列表中的 SEQIDNo:1)。 具体而言， 发明人发现该序列具。
20、有驱动基因在水稻植株中表达而不在胚乳 中表达的能力， 提取出该序列并对上述能力进行了鉴定。 发明人将该序列经酶切后连接到 作物双元表达载体pCAMBIA1391上， 获得相应的重组质粒(即重组表达载体)， 利用该重组质 粒转化根癌农杆菌菌株EHA105， 然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化， 得到转基因水 稻植株。 对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现， GUS基因在根、 茎、 叶、 叶鞘、 胚及种皮 中具有较强活性， 但在胚乳细胞中不表达。 从而证明该序列具有驱动基因特异的在水稻植 株中表达而不在胚乳表达的活性。 0032 技术效果 0033 本发明所述的启动子SAFES2可与作物双元表。
21、达载体连接， 用于取代组成型启动 子。 并且， 该启动子可以与所需的目标基因连接， 构建重组表达载体， 经转化后， 可在水稻植 株中表达而不在胚乳表达， 即改善了水稻的生产性能， 也保证了稻米的食用安全性， 具有重 要的理论及实际意义。 附图说明 0034 以下， 结合附图来详细说明本发明的实施方案， 其中： 0035 图1为将SAFES2启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图， 其中图1中A为 pCAMBIA1391示意图， B为pCAMBIA1391-SAFES2示意图， 其中示出了利用SAFES2启动子驱动 位于其下游的GUS基因表达； 0036 图2为对本发明的启动子进行。
22、酶切验证的结果示意图。 0037 图3为根(a)、 茎(b)、 叶鞘(c)、 叶(d)、 种子(e)中GUS染色结果。 蓝色为GUS组织化学 染色， 代表组织中有GUS表达。 标尺2.5mm 具体实施方式 0038 以下参照具体的实施例来说明本发明。 本领域技术人员能够理解， 这些实施例仅 说明书 3/5 页 6 CN 105861506 A 6 用于说明本发明， 其不以任何方式限制本发明的范围。 0039 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的生 化试剂， 载体耗材等， 如无特殊说明， 均为市售购买产品。 0040 实施例1分离克隆启动子SAFES2 0。
23、041 步骤1、 引物的设计 0042 根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(OryzasativaLcv.Nipponbare)全基因组 序列， 依据水稻SAFES2基因的序列设计扩增引物， 并根据选用的载体及靶标基因的特点， 设 计引物的酶切位点。 0043 本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391(图1中A部分， 来自于CAMBIA， 公开 使用载体， 安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存) 为例， 靶标基因为Gus基因， 具体设计的引物为： 正向引物(SEQIDNo:2)5 端带HindIII， 酶 切位点(AAGCTT)， 反向引物(SEQIDN。
24、o:3)5 端带EcoRI， 酶切位点(GAATTC)， 引物序列如 下： 0044 正向引物： AAGCTTGCGGTAATAGAAATGTGGAGGGHindIII 0045 反向引物： GAATTCGGTTAATTATGTGTTTAAAGTGEcoRI 0046 由深圳华大基因公司合成。 0047 步骤2、 启动子SAFES2的分离克隆 0048 以水稻品种日本晴DNA为模板， 利用正向引物、 反向引物扩增启动子SAFES2， 按常 规PCR体系， 采用如下扩增程序： 0049 95预变性5min； 95变性30s， 58退火30s， 72延伸2min30s， 35个循环； 最后 72延。
25、伸10min。 0050 回收PCR扩增的目的片段， 将其连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司， 按载 体说明书中的比例混合)上， 按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后， 经菌落PCR筛 选获得阳性克隆， 挑取单克隆摇菌液提质粒， 用HindIII和EcoRI进行双酶切验证， 目的片段 长度2018bp， 如图2所示。 将经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。 验证正确的克 隆即为所要获得的启动子SAFES2， 其核酸序列如SEQIDNo:1所示。 0051 实施例2启动子SAFES2的功能验证及应用 0052 1.遗传转化载体的构建和农杆菌的转化。
26、 0053 所用载体为作物双元表达载体pCAMBIA1391， 用HindIII和EcoRI进行双酶切， 回收 线性化处理的pCAMBIA1391。 同时用HindIII和EcoRI对克隆得到的启动子SAFES2进行酶切， 回收目的片段。 将上述的pCAMBIA1391片段和SAFES2片段用T4DNA连接酶(购于TaKaRa公司) 进行连接， 得到启动子SAFES2与Gus基因融合的重组表达载体pCAMBIA1391-SAFES2(图1B)， 利用冻融法将重组表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105(安徽 省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督。
27、检验测试中心水稻组保存)。 0054 2启动子SAFES2的功能验证及应用 0055 步骤1： 农杆菌介导的水稻遗传转化 0056 成熟水稻种子去掉颖壳后， 用70酒精浸泡种子1min， 倒掉酒精。 用含有1滴Tween 20的50次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4)溶液浸泡种子40min(150r/min)。 倒掉次氯酸 钠， 无菌水洗5遍至溶液澄清， 无次氯酸钠味道。 无菌水浸泡种子过夜。 用解剖刀沿种子的糊 说明书 4/5 页 7 CN 105861506 A 7 粉层将胚剥下， 将胚接种于愈伤诱导培养基上。 30下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽 分离， 将去芽的状态良好、 分裂旺盛的初级。
28、愈伤组织进行预培养35天后用于农杆菌转化。 0057 采用上述 “作物表达载体的构建和农杆菌的转化” 过程中转入了重组表达载体的 根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化， 该遗传转化、 转化子筛选及转基因植株再生等参 照YongboDuan(YongboDuan， ChenguangZhai， etal.Anefficientandhigh- throughputprotocolforAgrobacteriummediatedtransformationbasedon phosphomannoseisomerasepositiveselectioninJaponicarice(Oryzasativ。
29、aL.) J.PlantCellReport， 2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。 获得转 基因再生植株。 0058 步骤2、 GUS组织化学染色 0059 参照Jefferson(JeffersonRA等人.GUSfusion： -Glucuronidaseasa sensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplantJ.EMBOJ.， 1987， 6: 3901-3907)等提出的方法， 将从上面获得的转基因再生植株中分离的需要染色的组织浸入 染色液中， 37保温箱中放置24-36小时， 加入无。
30、水乙醇浸泡直至完全脱色， 在显微镜下拍 照记录。 结果见图3(需要说明的是， 鉴于专利文本中不接受彩色图片， 因此， 本申请的发明 人将彩色的图3修改为灰度图像， 但是， 即便这样， 基于图3中的颜色深浅度， 也可以清晰地 分辨出各部位是否发生染色)， 图中示出了根(a)、 茎(b)、 叶鞘(c)、 叶(d)、 种子(e)中GUS染 色结果,蓝色为GUS组织化学染色， 代表组织中有GUS表达。 染色结果表明SAFES2启动子在 根、 茎、 叶、 叶鞘、 胚及种皮中具有较强活性， 能够引导Gus基因表达， 但在胚乳细胞中不表 达。 0060 因此， 基于该染色结果可以明确判断， 本发明的胚乳不表。
31、达启动子在胚乳中不表 达， 而在胚乳之外的其他主要组织中表达。 0061 为了验证实验的可重复性， 本发明进行了三次重复实验， 实验结果均与上面实施 例类似， 这里不再累述。 0062 虽然本发明以水稻为例进行描述， 但是申请人认为， 本发明所获得启动子的应用 场景不限于水稻， 本发明启动子可以用于各种禾本科作物， 例如水稻、 小麦、 玉米、 大麦、 高 梁或燕麦， 优选为水稻。 0063 以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明， 本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形， 只要不脱离本发明的精神， 均应属于本发明所附权利要求的范 围。 说明书 5/5 页 8 CN 105861506 A 8 0001 序列表 1/3 页 9 CN 105861506 A 9 0002 序列表 2/3 页 10 CN 105861506 A 10 0003 序列表 3/3 页 11 CN 105861506 A 11 图1 图2 说明书附图 1/2 页 12 CN 105861506 A 12 图3 说明书附图 2/2 页 13 CN 105861506 A 13 。