技术领域
本发明属于T淋巴细胞受体技术领域,具体涉及一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法。
背景技术
目前,我国大部分原发性肝癌患者的病因均为乙肝病毒感染,现有技术中记载了原发性肝癌(HCC)组织中浸润性T淋巴细胞(TIL)表达大量衰老分子,浸润性淋巴细胞处于免疫无能和衰老状态。浸润性T淋巴细胞较早即可在慢性肝炎病毒感染中被诱导耐受,原发性肝癌发生后浸润性T淋巴细胞在肿瘤微环境中更进一步被诱导无能和衰老,加上肝脏特有的免疫耐受器官环境,原发性肝癌中的浸润性T淋巴细胞较其它肿瘤的浸润性细胞更难以激活扩增。原发性肝癌中的浸润性T淋巴细胞对CD3单抗等刺激仅能扩增20倍,很难恢复免疫活力。传统方法很难对衰老的浸润性T淋巴细胞进行恢复,如用抗体阻断KLRG1、LAG3等其他众多衰老分子,很难恢复。因此,突破上述传统方法,寻找恢复浸润性T淋巴细胞的免疫活性的方法至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法,采用本发明提供的方法能够使免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能得到恢复。
本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法,包括:
1)将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合,得到含有阻断剂的溶液;
所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体;
2)将所述步骤1)得到的含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后进行培养,得到培养物;
3)将所述步骤2)得到的培养物与布雷非德菌素A混合、孵育,得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。
优选的,所述步骤1)中,当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体的浓度为8~12μg/ml。
优选的,所述步骤1)中,当所述阻断剂为anti-PD-1阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-PD-1阻断抗体的浓度为8~12μg/ml。
优选的,所述步骤1)中,当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的浓度独立的为8~12μg/ml。
优选的,所述步骤1)免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液的细胞数量为4.5~5.5×105/200μl。
优选的,所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后,所述anti-CD3抗体的终浓度为2~3μg/ml。
优选的,所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后,所述anti-CD28抗体的终浓度为1~1.5μg/ml。
优选的,所述步骤2)培养的时间为4~6d。
优选的,所述步骤3)培养物与布雷非德菌素A混合后,所述布雷非德菌素A的终浓度为8~12μg/ml。
优选的,所述步骤3)孵育的时间为5~7h。
本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的免疫功能的方法,所述阻断剂anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面Tim-3和/或PD-1的表达,进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。
本发明实施例的结果显示:本发明利用流式细胞术检测了肿瘤及癌旁部位浸润的CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例情况,检测了原发性肝癌患者血液、肿瘤部位及癌旁部位的CD4+和CD8+T淋巴细胞表面Tim-3和PD-1的表达情况,并且体外阻断这两种受体后,CD4+和CD8+T淋巴细胞分泌的细胞因子的量及细胞增殖情况。发现肿瘤部位浸润的CD8+T淋巴细胞的数量少于癌旁部位,原发性肝癌患者血液、肿瘤组织和癌旁组织中浸润的T淋巴细胞表面均表达抑制型受体Tim-3和PD-1,但肿瘤组织中其表达量高于癌旁,但两部位其表达量没有统计学差异。Tim-3+和PD-1+的T淋巴细胞分泌细胞因子的能力受损。体外阻断后T淋巴细胞的功能及其体外增殖能力得到一定程度的提高。从而找到一种逆转肝癌组织TIL的免疫无能状态并恢复其免疫功能的新方法。
附图说明
图1为流式细胞仪结果,其中A为流式细胞仪结果原图,B为流式细胞仪结果的分析图;
图2为流式细胞仪结果原图及数据分析图;
图3为激光共聚焦显微镜检测结果;
图4为CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子结果
图5为CD8+T淋巴细胞分泌的细胞因子结果;
图6为阻断两种表面标记物后CD4+和CD8+细胞的比例结果;
图7为阻断两种标记物后CD4+T淋巴细胞的分泌的细胞因子结果;
图8为阻断两种标记物后CD8+T淋巴细胞的分泌的细胞因子结果;
图9为阻断两种标记物后各组上清液中细胞因子的量的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的免疫功能的方法,包括:
1)将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合,得到含有阻断剂的溶液;
所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体;
2)将所述步骤2)得到的含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后进行培养,得到培养物;
3)将所述步骤2)得到的培养物与布雷非德菌素A混合、孵育,得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。
本发明将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合,得到含有阻断剂的溶液。
在本发明中,所述免疫功能受损的浸润性T细胞的来源优选为原发性肝癌患者的外周血,本发明对所述分离得到免疫功能受损的浸润性T细胞的方法没有特殊限定,采用本领域常规分离方法即可。
在本发明中,所述免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液的细胞数量为4.5~5.5×105/200μl,更优选为4.8~5.2×105/200μl,最优选为5×105/200μl。
在本发明中,所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体,当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体的浓度优选为8~12μg/ml,更优选为9~11μg/ml,最优选为10μg/ml。在本发明中,所述anti-Tim-3阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面的Tim-3的表达,进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。
在本发明中,当所述阻断剂为anti-PD-1阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-PD-1阻断抗体的浓度优选为8~12μg/ml,更优选为9~11μg/ml,最优选为10μg/ml。在本发明中,所述anti-PD-1阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面的PD-1的表达,进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。
在本发明中,当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的浓度独立的优选为8~12μg/ml,更优选为9~11μg/ml,最优选为10μg/ml。在本发明中,所述anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面的Tim-3和PD-1的表达,进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。本发明对所述anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的来源没有特殊限定,采用常规市售产品即可。
本发明将含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后进行培养,得到培养物。
在本发明中,所述含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后,所述anti-CD3抗体的终浓度优选为2~3μg/ml,更优选为2.2~2.8μg/ml,最优选为2.5μg/ml。本发明对所述anti-CD3抗体的来源没有特殊限定,采用常规市售的即可。在本发明中,所述anti-CD3抗体上调T淋巴细胞白细胞介素2受体(interleukine-2receptor,IL-2R)表达,刺激T细胞增殖与活化。
本发明中,所述含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后,所述anti-CD28抗体的终浓度优选为1~1.5μg/ml,更优选为1.2~1.3μg/ml,最优选为1.25μg/ml。本发明对所述anti-CD28抗体的来源没有特殊限定,采用常规市售的即可。在本发明中,所述anti-CD28抗体与其配体B7相互作用,可以为T淋巴细胞活化提供必要的第二信号途径。本发明对所述anti-CD3抗体和anti-CD28抗体的来源没有特殊限定,采用常规市售产品即可。
在本发明中,所述培养的时间优选为4~6d,更优选为5d;所述培养的温度优选为37℃,所述培养优选在5%CO2的环境下进行。
本发明将得到的培养物与布雷非德菌素A混合、孵育,得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。
在本发明中,所述培养物与布雷非德菌素A混合后,所述布雷非德菌素A的终浓度优选为8~12μg/ml,更优选为9~11μg/ml,最优选为10μg/ml。本发明对所述布雷非德菌素A的来源没有特殊限定,采用常规市售的产品即可。在本发明中,所述布雷非德菌素A的作用是阻断细胞因子向细胞外分泌。
在本发明中,所述孵育的时间优选为5~7h,更优选为5.5~6.5h,最优选为6h;所述孵育的温度优选为37℃;所述孵育优选在5%CO2的环境下进行。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的免疫功能的方法做进一步详细的介绍,本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1、采集原发性肝癌患者外周血于肝素锂抗凝的采血管中,采用Ficoll-Paque Plus密度梯度离心的方法迅速分离外周血单个核细胞,操作步骤如下:
1)采用与全血等量的PBS稀释血液;
2)往离心管中加入与稀释全血等量的Ficoll分离液,将稀释后的血液沿着管壁缓慢地加在Ficoll分离液的上层,不与Ficoll分离液混匀,室温1500rpm,离心20min;离心速度采用慢升慢降,上升速度设置为1,下降速度设置为0;
3)离心后,可看到离心管中由上而下细胞分为四层,第一层为血浆层,第二层为环状白色淋巴细胞层,第三层为透明分离液层,第四层为红细胞层;收集第二层细胞放入含pH值为7.4PBS(GIBCO)7ml的离心管中,充分混匀,室温1500rpm,离心5min;将得到的沉淀重复洗一次;
4)弃上清,用PBMC培养基或者PBS重悬沉淀(沉淀即为细胞),以进行下一步实验,用96孔板培养时,每孔5*106个细胞(细胞为外周血单个核细胞)。
2、提取原发性肝癌患者的肿瘤组织和癌旁组织中的单个核细胞:
于无菌条件下取原发性肝癌患者的肿瘤和癌旁组织(距离肿瘤组织1㎝左右)标本3*3*3㎝,于生物安全柜中用无菌小剪刀剪碎,加入含双抗的10%FBS-RPMI164010ml,加入胶原酶(终浓度为1mg/ml),加入DNase I(终浓度为20ug/ml)于37℃恒温摇床中孵育2小时,间隔半小时摇晃一次,2小时后用70μm筛网过滤,然后参照外周血淋巴细胞分离方法采用Ficoll-Paque Plus密度梯度离心分离出组织中单个核细胞。
3、细胞表面标记物及核内因子染色与流式细胞检测分析
上述步骤分离的外周血单个核细胞和组织中单个核细胞,在体外培养24小时细胞状态恢复后进行细胞表面标记物或核内因子染色,染色步骤如下:
1)收集96孔板中的细胞于装有3ml含2%FBS的PBS(以下统称洗液)的流式管中,1500rpm离心5min,弃上清;
2)用200μl洗液重悬细胞,按表面抗体说明书的使用量加入对应量的抗体,进行细胞表面标志物的染色,同时加入同型对照IgG抗体进行染色,以保证抗体染色的特异性,4℃避光孵育30min;
3)4℃冰箱中取出加入4ml洗液,1500rpm 5min离心;
4)倒去上清,加入250ul的(cytofix/toperm)破膜固定剂,混匀,置于4℃冰箱避光反应30min;
5)取出,加入3ml 1X的perm/washbuffer(跟cytofix/toperm配套的),1500rpm,5min离心;
6)倒去上清,残留200ul的洗液,振荡重悬,根据细胞数和说明书,加入所需的流式抗体量(胞内标记抗体);
7)轻微混匀后,置于4℃冰箱避光反应30min;
8)4℃冰箱取出标本,加入4ml的2%多聚甲醛的PBS,1500rpm,5min离心,倒去上清,残留200ul的buffer,振荡重悬,用Beckman Coulter Gallios10色分析型流式细胞仪进行检测(注:用等量PBS稀释4%多聚甲醛为2%的浓度);
9)流式数据采用Kaluza 1.2软件进行分析。
4、人CD3磁珠分选CD3阳性细胞及荧光染色
1)用70μm孔径的尼龙滤网过滤组织中分离出的单个核细胞,彻底振荡CD3磁珠颗粒,加入50ul磁珠于每107细胞EP管中;
2)将EP管放于摇床上彻底混匀,室温下孵育30min;
3)将EP管中细胞转移到BD流式管中,将BD流式管置于BD磁力架上,孵育10min;
4)沿BD流式管外侧壁吸取上清并弃去,上清中即为CD3阴性细胞或碎片;
5)从磁力架上取下BD流式管加入2ml PBS,吹吸混匀后再次放于BD磁力架上4min;
6)重复步骤4),如果要进一步提高CD3阳性细胞的纯度,再次重复步骤4)和5);
7)将得到的细胞种于96孔板中,200ul/孔,培养24小时后进行荧光染色。
8)24小时后收集细胞,按上述细胞表面标记染色方法染CD3阳性细胞表面CD4,CD8,Tim-3,PD-1后,于BD流式管中加入3ml双蒸水,1500rpm,5min,弃上清,重悬;
9)重复步骤8)三次,剩余200ul细胞液,铺片,加入40ul细胞液于盖玻片中央,置于生物安全柜中静置晾干,加3ul DAPI于载玻片中央,将盖玻片盖上(注意不要有气泡),将其置于4℃冰箱中保存待激光共聚焦显微镜下拍片。
5、原发性肝癌T淋巴细胞的体外阻断实验
将用CD3磁珠分选出来的CD3阳性T淋巴细胞体外培养24小时待细胞表面抗原标记恢复后,将细胞分为4组,每组三个复孔,每孔5*105细胞,200ul/孔,只加anti-Tim-3阻断抗体(终浓度为10ug/ml)组、只加anti-PD-1阻断抗体(终浓度为10ug/ml)组、加anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体(浓度比为1:1)组、只加同型对照抗体IgG组(终浓度为10ug/ml),每孔中加入anti-CD3抗体(终浓度为2.5ug/ml)、anti-CD28抗体(终浓度为1.25ug/ml)共刺激,体外培养5天后,每孔中加入BrefeldinA(终浓度为10ug/ml),再次孵育6小时后,各组收集上清120ul用于CBA实验检测上清中的细胞因子的量,收集细胞用于流式检测。
6、人Th1/Th2细胞因子CBA试剂盒检测
阻断实验中收集的四个组的上清120ul,用于上清中细胞因子的检测,详细实验步骤如下:
6.1制备人Th1/Th2/Th17细胞因子标准品
重悬和梯度稀释标准品:
1)打开一管冻干的人Th1/Th2标准品,将标准品小球转移到一支15mL锥形离心管中,并标记该管为最高浓度标准品;
2)用2mL实验稀释液重悬标准品;
3)重悬后的标准品溶液需室温下平衡至少15分钟;
4)用吸头轻轻混匀标准品,切勿剧烈震荡;
5)取出9根12×75mm流式上样管,分别标记梯度稀释的倍数1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256;
6)每管各加300μl实验稀释液;
7)梯度稀释标准品:
A.从最高浓度标准品管取300μl液体到1:2管,吹打混匀;
B.从1:2管取300μl液体到1:4管,吹打混匀,依此类推,直到1:256管;
C.仅可用枪吹打混匀,不可涡旋。
6.2混合人Th1/Th2细胞因子捕获微球
1)确定实验管数(包括标准品和对照管),如8个待测样本、9个标准品、1个阴性对照,共18管;
2)混合前每种捕获微球需充分涡旋5秒(注意:微球易沉积,吸出前必须充分混匀);
3)为保证每个实验管都含有6种微球,每种捕获微球需各取10μl,如实验管为18个,需要每种微球的量是180μl,将所有6种捕获微球都装入一根流式管中,标记为“混合微球”;
4)充分涡旋混匀;
5)将混匀的微球加入待测样本、标准品和阴性对照管中,每管60ul,然后每管加入50ulPE检测试剂,避光室温孵育3小时后,每管中加入1ml洗液离心200g,5min;
6)离心完毕弃上清,加300ul洗液,待上机。
7、数据分析
采用GraphPadPrism(5.0版本)对数据进行统计学分析,采用paired t test及独立t检验,P<0.05差异有统计学意义,误差棒代表SEM。
实验结果如下:
1肿瘤、癌旁及血液中T淋巴细胞分化及功能的比较
由于肿瘤部位和癌旁部位的微环境恶性程度不同,为了检测上述微环境中T淋巴细胞种类及功能的差异,比较了肿瘤和癌旁两个部位浸润的CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例及各自抑制型分子Tim3和PD-1的表达情况,同时利用血液中T细胞作为正常对照组。结果发现肿瘤部位的CD8+T淋巴细胞的比例明显低于癌旁部位的CD8+T淋巴细胞的比例,而该部位CD4+T淋巴细胞的比例明显高于癌旁(见图1),肿瘤部位和癌旁部位CD4+T和CD8+T淋巴细胞表面抑制型受体Tim-3和PD-1表达量差异无统计学意义,但均高于血液中CD4+和CD8+T淋巴细胞表面抑制型受体Tim-3和PD-1的表达(见图2)。
2激光共聚焦显微镜检测T淋巴细胞表面受体Tim-3和PD-1
从原发性肝癌肿瘤组织中分离出单个核细胞,用CD3磁珠将CD3+的T淋巴细胞分选出来,染CD4,CD8,Tim-3,PD-1,DAPI染核共定位,通过共聚焦显微镜检测发现CD4+和CD8+T淋巴细胞表面均有Tim-3和PD-1的表达,结果见图3。
3Tim-3+与Tim-3-、PD-1+与PD-1-T淋巴细胞分泌的细胞因子的比较
在抗肿瘤免疫中,最重要的是T淋巴细胞分泌的IFN-γ、TNF-α的量,经检测肿瘤组织部位浸润的T淋巴细胞数量较少,为更好的比较Tim-3+与Tim-3-、PD-1+与PD-1-T淋巴细胞分泌的细胞因子的量,选取癌旁部位浸润的T淋巴细胞来做进一步的比较。研究发现Tim-3+或PD-1+的CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子均比Tim-3-或PD-1-的CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子量少,结果见图4,CD8+T淋巴细胞也显示了同样的结果,见图5。
4体外T淋巴细胞表面受体Tim-3和PD-1的阻断实验
体外将肿瘤或癌旁组织中T淋巴细胞表面标记Tim-3或PD-1阻断5天后,单独Tim-3或PD-1或同时阻断Tim-3和PD-1组CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例均较未处理组高,结果见图6,并且,Tim-3和PD-1同时阻断组CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例最高。同型对照组CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的比例最低。四个不同处理组分泌的细胞因子IFN-γ、TNF-α及细胞增殖标记Ki67的表达量也显示了同样的差异。并且同时阻断组分泌的细胞因子IFN-γ、TNF-α及细胞增殖标记Ki67的量与未处理组相比差异有统计学意义,结果见图7和8。
5CBA检测各个不同处理组上清中细胞因子的量
收集阻断实验中各个处理组的细胞培养上清,用多因子检测试剂盒Th1/Th2CBA试剂盒检测各处理组上清中IFN-γ、TNF-α的量,经检测发现T淋巴细胞表面受体Tim-3、PD-1单独阻断组和Tim-3、PD-1同时阻断组的细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α的量与同型对照组相比均增多,结果见图9。
由以上实施例可以得出,本发明利用流式细胞术检测了肿瘤及癌旁部位浸润的CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例情况,检测了原发性肝癌患者血液、肿瘤部位及癌旁部位的CD4+和CD8+T淋巴细胞表面Tim-3和PD-1的表达情况,并且体外阻断这两种受体后,CD4+和CD8+T淋巴细胞分泌的细胞因子的量及细胞增殖情况。发现肿瘤部位浸润的CD8+T淋巴细胞的数量少于癌旁部位,原发性肝癌患者血液、肿瘤组织和癌旁组织中浸润的T淋巴细胞表面均表达抑制型受体Tim-3和PD-1,但肿瘤组织中其表达量高于癌旁,但两部位其表达量没有统计学差异。Tim-3+和PD-1+的T淋巴细胞分泌细胞因子的能力受损。体外阻断后T淋巴细胞的功能及其体外增殖能力得到一定程度的提高。从而找到一种逆转肝癌组织TIL的免疫无能状态并恢复其免疫功能的新方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。