一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201811307212.9

申请日:

20181105

公开号:

CN109294987A

公开日:

20190201

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:

IPC分类号:

C12N5/0783

主分类号:

C12N5/0783

申请人:

中山大学附属第一医院

发明人:

胡安斌,刘芙蓉,凌象超

地址:

510000 广东省广州市中山二路58号

优先权:

CN201811307212A

专利代理机构:

北京高沃律师事务所

代理人:

代芳

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内容摘要

本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法,属于T淋巴细胞受体技术领域,包括:将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合,得到含有阻断剂的溶液;所述阻断剂包括anti‑Tim‑3阻断抗体和/或anti‑PD‑1阻断抗体;含有阻断剂的溶液与anti‑CD3抗体、anti‑CD28抗体混合后进行培养,得到培养物;将培养物与布雷非德菌素A混合、孵育,得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。采用本发明提供的方法能够将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能恢复。

权利要求书

1.一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的免疫功能的方法,包括:1)将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合,得到含有阻断剂的溶液;所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体;2)将所述步骤1)得到的含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后进行培养,得到培养物;3)将所述步骤2)得到的培养物与布雷非德菌素A混合、孵育,得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。 2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中,当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体的浓度为8~12μg/ml。 3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中,当所述阻断剂为anti-PD-1阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-PD-1阻断抗体的浓度为8~12μg/ml。 4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)中,当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的浓度独立的为8~12μg/ml。 5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤1)免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液的细胞数量为4.5~5.5×10/200μl。 6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后,所述anti-CD3抗体的终浓度为2~3μg/ml。 7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后,所述anti-CD28抗体的终浓度为1~1.5μg/ml。 8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤2)培养的时间为4~6d。 9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤3)培养物与布雷非德菌素A混合后,所述布雷非德菌素A的终浓度为8~12μg/ml。 10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤3)孵育的时间为5~7h。

说明书

技术领域

本发明属于T淋巴细胞受体技术领域,具体涉及一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法。

背景技术

目前,我国大部分原发性肝癌患者的病因均为乙肝病毒感染,现有技术中记载了原发性肝癌(HCC)组织中浸润性T淋巴细胞(TIL)表达大量衰老分子,浸润性淋巴细胞处于免疫无能和衰老状态。浸润性T淋巴细胞较早即可在慢性肝炎病毒感染中被诱导耐受,原发性肝癌发生后浸润性T淋巴细胞在肿瘤微环境中更进一步被诱导无能和衰老,加上肝脏特有的免疫耐受器官环境,原发性肝癌中的浸润性T淋巴细胞较其它肿瘤的浸润性细胞更难以激活扩增。原发性肝癌中的浸润性T淋巴细胞对CD3单抗等刺激仅能扩增20倍,很难恢复免疫活力。传统方法很难对衰老的浸润性T淋巴细胞进行恢复,如用抗体阻断KLRG1、LAG3等其他众多衰老分子,很难恢复。因此,突破上述传统方法,寻找恢复浸润性T淋巴细胞的免疫活性的方法至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法,采用本发明提供的方法能够使免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能得到恢复。

本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法,包括:

1)将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合,得到含有阻断剂的溶液;

所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体;

2)将所述步骤1)得到的含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后进行培养,得到培养物;

3)将所述步骤2)得到的培养物与布雷非德菌素A混合、孵育,得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。

优选的,所述步骤1)中,当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体的浓度为8~12μg/ml。

优选的,所述步骤1)中,当所述阻断剂为anti-PD-1阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-PD-1阻断抗体的浓度为8~12μg/ml。

优选的,所述步骤1)中,当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的浓度独立的为8~12μg/ml。

优选的,所述步骤1)免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液的细胞数量为4.5~5.5×105/200μl。

优选的,所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后,所述anti-CD3抗体的终浓度为2~3μg/ml。

优选的,所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后,所述anti-CD28抗体的终浓度为1~1.5μg/ml。

优选的,所述步骤2)培养的时间为4~6d。

优选的,所述步骤3)培养物与布雷非德菌素A混合后,所述布雷非德菌素A的终浓度为8~12μg/ml。

优选的,所述步骤3)孵育的时间为5~7h。

本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的免疫功能的方法,所述阻断剂anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面Tim-3和/或PD-1的表达,进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。

本发明实施例的结果显示:本发明利用流式细胞术检测了肿瘤及癌旁部位浸润的CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例情况,检测了原发性肝癌患者血液、肿瘤部位及癌旁部位的CD4+和CD8+T淋巴细胞表面Tim-3和PD-1的表达情况,并且体外阻断这两种受体后,CD4+和CD8+T淋巴细胞分泌的细胞因子的量及细胞增殖情况。发现肿瘤部位浸润的CD8+T淋巴细胞的数量少于癌旁部位,原发性肝癌患者血液、肿瘤组织和癌旁组织中浸润的T淋巴细胞表面均表达抑制型受体Tim-3和PD-1,但肿瘤组织中其表达量高于癌旁,但两部位其表达量没有统计学差异。Tim-3+和PD-1+的T淋巴细胞分泌细胞因子的能力受损。体外阻断后T淋巴细胞的功能及其体外增殖能力得到一定程度的提高。从而找到一种逆转肝癌组织TIL的免疫无能状态并恢复其免疫功能的新方法。

附图说明

图1为流式细胞仪结果,其中A为流式细胞仪结果原图,B为流式细胞仪结果的分析图;

图2为流式细胞仪结果原图及数据分析图;

图3为激光共聚焦显微镜检测结果;

图4为CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子结果

图5为CD8+T淋巴细胞分泌的细胞因子结果;

图6为阻断两种表面标记物后CD4+和CD8+细胞的比例结果;

图7为阻断两种标记物后CD4+T淋巴细胞的分泌的细胞因子结果;

图8为阻断两种标记物后CD8+T淋巴细胞的分泌的细胞因子结果;

图9为阻断两种标记物后各组上清液中细胞因子的量的结果。

具体实施方式

本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的免疫功能的方法,包括:

1)将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合,得到含有阻断剂的溶液;

所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体;

2)将所述步骤2)得到的含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后进行培养,得到培养物;

3)将所述步骤2)得到的培养物与布雷非德菌素A混合、孵育,得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。

本发明将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合,得到含有阻断剂的溶液。

在本发明中,所述免疫功能受损的浸润性T细胞的来源优选为原发性肝癌患者的外周血,本发明对所述分离得到免疫功能受损的浸润性T细胞的方法没有特殊限定,采用本领域常规分离方法即可。

在本发明中,所述免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液的细胞数量为4.5~5.5×105/200μl,更优选为4.8~5.2×105/200μl,最优选为5×105/200μl。

在本发明中,所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体,当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体的浓度优选为8~12μg/ml,更优选为9~11μg/ml,最优选为10μg/ml。在本发明中,所述anti-Tim-3阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面的Tim-3的表达,进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。

在本发明中,当所述阻断剂为anti-PD-1阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-PD-1阻断抗体的浓度优选为8~12μg/ml,更优选为9~11μg/ml,最优选为10μg/ml。在本发明中,所述anti-PD-1阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面的PD-1的表达,进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。

在本发明中,当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体时,所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的浓度独立的优选为8~12μg/ml,更优选为9~11μg/ml,最优选为10μg/ml。在本发明中,所述anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面的Tim-3和PD-1的表达,进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。本发明对所述anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的来源没有特殊限定,采用常规市售产品即可。

本发明将含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后进行培养,得到培养物。

在本发明中,所述含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后,所述anti-CD3抗体的终浓度优选为2~3μg/ml,更优选为2.2~2.8μg/ml,最优选为2.5μg/ml。本发明对所述anti-CD3抗体的来源没有特殊限定,采用常规市售的即可。在本发明中,所述anti-CD3抗体上调T淋巴细胞白细胞介素2受体(interleukine-2receptor,IL-2R)表达,刺激T细胞增殖与活化。

本发明中,所述含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、anti-CD28抗体混合后,所述anti-CD28抗体的终浓度优选为1~1.5μg/ml,更优选为1.2~1.3μg/ml,最优选为1.25μg/ml。本发明对所述anti-CD28抗体的来源没有特殊限定,采用常规市售的即可。在本发明中,所述anti-CD28抗体与其配体B7相互作用,可以为T淋巴细胞活化提供必要的第二信号途径。本发明对所述anti-CD3抗体和anti-CD28抗体的来源没有特殊限定,采用常规市售产品即可。

在本发明中,所述培养的时间优选为4~6d,更优选为5d;所述培养的温度优选为37℃,所述培养优选在5%CO2的环境下进行。

本发明将得到的培养物与布雷非德菌素A混合、孵育,得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。

在本发明中,所述培养物与布雷非德菌素A混合后,所述布雷非德菌素A的终浓度优选为8~12μg/ml,更优选为9~11μg/ml,最优选为10μg/ml。本发明对所述布雷非德菌素A的来源没有特殊限定,采用常规市售的产品即可。在本发明中,所述布雷非德菌素A的作用是阻断细胞因子向细胞外分泌。

在本发明中,所述孵育的时间优选为5~7h,更优选为5.5~6.5h,最优选为6h;所述孵育的温度优选为37℃;所述孵育优选在5%CO2的环境下进行。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的免疫功能的方法做进一步详细的介绍,本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1、采集原发性肝癌患者外周血于肝素锂抗凝的采血管中,采用Ficoll-Paque Plus密度梯度离心的方法迅速分离外周血单个核细胞,操作步骤如下:

1)采用与全血等量的PBS稀释血液;

2)往离心管中加入与稀释全血等量的Ficoll分离液,将稀释后的血液沿着管壁缓慢地加在Ficoll分离液的上层,不与Ficoll分离液混匀,室温1500rpm,离心20min;离心速度采用慢升慢降,上升速度设置为1,下降速度设置为0;

3)离心后,可看到离心管中由上而下细胞分为四层,第一层为血浆层,第二层为环状白色淋巴细胞层,第三层为透明分离液层,第四层为红细胞层;收集第二层细胞放入含pH值为7.4PBS(GIBCO)7ml的离心管中,充分混匀,室温1500rpm,离心5min;将得到的沉淀重复洗一次;

4)弃上清,用PBMC培养基或者PBS重悬沉淀(沉淀即为细胞),以进行下一步实验,用96孔板培养时,每孔5*106个细胞(细胞为外周血单个核细胞)。

2、提取原发性肝癌患者的肿瘤组织和癌旁组织中的单个核细胞:

于无菌条件下取原发性肝癌患者的肿瘤和癌旁组织(距离肿瘤组织1㎝左右)标本3*3*3㎝,于生物安全柜中用无菌小剪刀剪碎,加入含双抗的10%FBS-RPMI164010ml,加入胶原酶(终浓度为1mg/ml),加入DNase I(终浓度为20ug/ml)于37℃恒温摇床中孵育2小时,间隔半小时摇晃一次,2小时后用70μm筛网过滤,然后参照外周血淋巴细胞分离方法采用Ficoll-Paque Plus密度梯度离心分离出组织中单个核细胞。

3、细胞表面标记物及核内因子染色与流式细胞检测分析

上述步骤分离的外周血单个核细胞和组织中单个核细胞,在体外培养24小时细胞状态恢复后进行细胞表面标记物或核内因子染色,染色步骤如下:

1)收集96孔板中的细胞于装有3ml含2%FBS的PBS(以下统称洗液)的流式管中,1500rpm离心5min,弃上清;

2)用200μl洗液重悬细胞,按表面抗体说明书的使用量加入对应量的抗体,进行细胞表面标志物的染色,同时加入同型对照IgG抗体进行染色,以保证抗体染色的特异性,4℃避光孵育30min;

3)4℃冰箱中取出加入4ml洗液,1500rpm 5min离心;

4)倒去上清,加入250ul的(cytofix/toperm)破膜固定剂,混匀,置于4℃冰箱避光反应30min;

5)取出,加入3ml 1X的perm/washbuffer(跟cytofix/toperm配套的),1500rpm,5min离心;

6)倒去上清,残留200ul的洗液,振荡重悬,根据细胞数和说明书,加入所需的流式抗体量(胞内标记抗体);

7)轻微混匀后,置于4℃冰箱避光反应30min;

8)4℃冰箱取出标本,加入4ml的2%多聚甲醛的PBS,1500rpm,5min离心,倒去上清,残留200ul的buffer,振荡重悬,用Beckman Coulter Gallios10色分析型流式细胞仪进行检测(注:用等量PBS稀释4%多聚甲醛为2%的浓度);

9)流式数据采用Kaluza 1.2软件进行分析。

4、人CD3磁珠分选CD3阳性细胞及荧光染色

1)用70μm孔径的尼龙滤网过滤组织中分离出的单个核细胞,彻底振荡CD3磁珠颗粒,加入50ul磁珠于每107细胞EP管中;

2)将EP管放于摇床上彻底混匀,室温下孵育30min;

3)将EP管中细胞转移到BD流式管中,将BD流式管置于BD磁力架上,孵育10min;

4)沿BD流式管外侧壁吸取上清并弃去,上清中即为CD3阴性细胞或碎片;

5)从磁力架上取下BD流式管加入2ml PBS,吹吸混匀后再次放于BD磁力架上4min;

6)重复步骤4),如果要进一步提高CD3阳性细胞的纯度,再次重复步骤4)和5);

7)将得到的细胞种于96孔板中,200ul/孔,培养24小时后进行荧光染色。

8)24小时后收集细胞,按上述细胞表面标记染色方法染CD3阳性细胞表面CD4,CD8,Tim-3,PD-1后,于BD流式管中加入3ml双蒸水,1500rpm,5min,弃上清,重悬;

9)重复步骤8)三次,剩余200ul细胞液,铺片,加入40ul细胞液于盖玻片中央,置于生物安全柜中静置晾干,加3ul DAPI于载玻片中央,将盖玻片盖上(注意不要有气泡),将其置于4℃冰箱中保存待激光共聚焦显微镜下拍片。

5、原发性肝癌T淋巴细胞的体外阻断实验

将用CD3磁珠分选出来的CD3阳性T淋巴细胞体外培养24小时待细胞表面抗原标记恢复后,将细胞分为4组,每组三个复孔,每孔5*105细胞,200ul/孔,只加anti-Tim-3阻断抗体(终浓度为10ug/ml)组、只加anti-PD-1阻断抗体(终浓度为10ug/ml)组、加anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体(浓度比为1:1)组、只加同型对照抗体IgG组(终浓度为10ug/ml),每孔中加入anti-CD3抗体(终浓度为2.5ug/ml)、anti-CD28抗体(终浓度为1.25ug/ml)共刺激,体外培养5天后,每孔中加入BrefeldinA(终浓度为10ug/ml),再次孵育6小时后,各组收集上清120ul用于CBA实验检测上清中的细胞因子的量,收集细胞用于流式检测。

6、人Th1/Th2细胞因子CBA试剂盒检测

阻断实验中收集的四个组的上清120ul,用于上清中细胞因子的检测,详细实验步骤如下:

6.1制备人Th1/Th2/Th17细胞因子标准品

重悬和梯度稀释标准品:

1)打开一管冻干的人Th1/Th2标准品,将标准品小球转移到一支15mL锥形离心管中,并标记该管为最高浓度标准品;

2)用2mL实验稀释液重悬标准品;

3)重悬后的标准品溶液需室温下平衡至少15分钟;

4)用吸头轻轻混匀标准品,切勿剧烈震荡;

5)取出9根12×75mm流式上样管,分别标记梯度稀释的倍数1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256;

6)每管各加300μl实验稀释液;

7)梯度稀释标准品:

A.从最高浓度标准品管取300μl液体到1:2管,吹打混匀;

B.从1:2管取300μl液体到1:4管,吹打混匀,依此类推,直到1:256管;

C.仅可用枪吹打混匀,不可涡旋。

6.2混合人Th1/Th2细胞因子捕获微球

1)确定实验管数(包括标准品和对照管),如8个待测样本、9个标准品、1个阴性对照,共18管;

2)混合前每种捕获微球需充分涡旋5秒(注意:微球易沉积,吸出前必须充分混匀);

3)为保证每个实验管都含有6种微球,每种捕获微球需各取10μl,如实验管为18个,需要每种微球的量是180μl,将所有6种捕获微球都装入一根流式管中,标记为“混合微球”;

4)充分涡旋混匀;

5)将混匀的微球加入待测样本、标准品和阴性对照管中,每管60ul,然后每管加入50ulPE检测试剂,避光室温孵育3小时后,每管中加入1ml洗液离心200g,5min;

6)离心完毕弃上清,加300ul洗液,待上机。

7、数据分析

采用GraphPadPrism(5.0版本)对数据进行统计学分析,采用paired t test及独立t检验,P<0.05差异有统计学意义,误差棒代表SEM。

实验结果如下:

1肿瘤、癌旁及血液中T淋巴细胞分化及功能的比较

由于肿瘤部位和癌旁部位的微环境恶性程度不同,为了检测上述微环境中T淋巴细胞种类及功能的差异,比较了肿瘤和癌旁两个部位浸润的CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例及各自抑制型分子Tim3和PD-1的表达情况,同时利用血液中T细胞作为正常对照组。结果发现肿瘤部位的CD8+T淋巴细胞的比例明显低于癌旁部位的CD8+T淋巴细胞的比例,而该部位CD4+T淋巴细胞的比例明显高于癌旁(见图1),肿瘤部位和癌旁部位CD4+T和CD8+T淋巴细胞表面抑制型受体Tim-3和PD-1表达量差异无统计学意义,但均高于血液中CD4+和CD8+T淋巴细胞表面抑制型受体Tim-3和PD-1的表达(见图2)。

2激光共聚焦显微镜检测T淋巴细胞表面受体Tim-3和PD-1

从原发性肝癌肿瘤组织中分离出单个核细胞,用CD3磁珠将CD3+的T淋巴细胞分选出来,染CD4,CD8,Tim-3,PD-1,DAPI染核共定位,通过共聚焦显微镜检测发现CD4+和CD8+T淋巴细胞表面均有Tim-3和PD-1的表达,结果见图3。

3Tim-3+与Tim-3-、PD-1+与PD-1-T淋巴细胞分泌的细胞因子的比较

在抗肿瘤免疫中,最重要的是T淋巴细胞分泌的IFN-γ、TNF-α的量,经检测肿瘤组织部位浸润的T淋巴细胞数量较少,为更好的比较Tim-3+与Tim-3-、PD-1+与PD-1-T淋巴细胞分泌的细胞因子的量,选取癌旁部位浸润的T淋巴细胞来做进一步的比较。研究发现Tim-3+或PD-1+的CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子均比Tim-3-或PD-1-的CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子量少,结果见图4,CD8+T淋巴细胞也显示了同样的结果,见图5。

4体外T淋巴细胞表面受体Tim-3和PD-1的阻断实验

体外将肿瘤或癌旁组织中T淋巴细胞表面标记Tim-3或PD-1阻断5天后,单独Tim-3或PD-1或同时阻断Tim-3和PD-1组CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例均较未处理组高,结果见图6,并且,Tim-3和PD-1同时阻断组CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例最高。同型对照组CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的比例最低。四个不同处理组分泌的细胞因子IFN-γ、TNF-α及细胞增殖标记Ki67的表达量也显示了同样的差异。并且同时阻断组分泌的细胞因子IFN-γ、TNF-α及细胞增殖标记Ki67的量与未处理组相比差异有统计学意义,结果见图7和8。

5CBA检测各个不同处理组上清中细胞因子的量

收集阻断实验中各个处理组的细胞培养上清,用多因子检测试剂盒Th1/Th2CBA试剂盒检测各处理组上清中IFN-γ、TNF-α的量,经检测发现T淋巴细胞表面受体Tim-3、PD-1单独阻断组和Tim-3、PD-1同时阻断组的细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、TNF-α的量与同型对照组相比均增多,结果见图9。

由以上实施例可以得出,本发明利用流式细胞术检测了肿瘤及癌旁部位浸润的CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例情况,检测了原发性肝癌患者血液、肿瘤部位及癌旁部位的CD4+和CD8+T淋巴细胞表面Tim-3和PD-1的表达情况,并且体外阻断这两种受体后,CD4+和CD8+T淋巴细胞分泌的细胞因子的量及细胞增殖情况。发现肿瘤部位浸润的CD8+T淋巴细胞的数量少于癌旁部位,原发性肝癌患者血液、肿瘤组织和癌旁组织中浸润的T淋巴细胞表面均表达抑制型受体Tim-3和PD-1,但肿瘤组织中其表达量高于癌旁,但两部位其表达量没有统计学差异。Tim-3+和PD-1+的T淋巴细胞分泌细胞因子的能力受损。体外阻断后T淋巴细胞的功能及其体外增殖能力得到一定程度的提高。从而找到一种逆转肝癌组织TIL的免疫无能状态并恢复其免疫功能的新方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811307212.9 (22)申请日 2018.11.05 (71)申请人 中山大学附属第一医院 地址 510000 广东省广州市中山二路58号 (72)发明人 胡安斌刘芙蓉凌象超 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569 代理人 代芳 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) (54)发明名称 一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免 疫功能的方法 (57)摘要 本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润 性T淋巴细胞免疫功能的方法, 属于T。

2、淋巴细胞受 体技术领域, 包括: 将免疫功能受损的浸润性T淋 巴细胞溶液与阻断剂混合, 得到含有阻断剂的溶 液; 所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或 anti-PD-1阻断抗体; 含有阻断剂的溶液与anti- CD3抗体、 anti-CD28抗体混合后进行培养, 得到 培养物; 将培养物与布雷非德菌素A混合、 孵育, 得到免疫功能恢复的浸润性T淋巴细胞。 采用本 发明提供的方法能够将免疫功能受损的浸润性T 淋巴细胞的免疫功能恢复。 权利要求书1页 说明书7页 附图8页 CN 109294987 A 2019.02.01 CN 109294987 A 1.一种非治疗目的的恢复浸润性。

3、T淋巴细胞的免疫功能的方法, 包括: 1)将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合, 得到含有阻断剂的溶液; 所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体; 2)将所述步骤1)得到的含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、 anti-CD28抗体混合后进 行培养, 得到培养物; 3)将所述步骤2)得到的培养物与布雷非德菌素A混合、 孵育, 得到免疫功能恢复的浸润 性T淋巴细胞。 2.根据权利要求1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤1)中, 当所述阻断剂为anti-Tim- 3阻断抗体时, 所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体的浓度为812 。

4、g/ml。 3.根据权利要求1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤1)中, 当所述阻断剂为anti-PD-1 阻断抗体时, 所述含有阻断剂的溶液中anti-PD-1阻断抗体的浓度为812 g/ml。 4.根据权利要求1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤1)中, 当所述阻断剂为anti-Tim- 3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体时, 所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体和 anti-PD-1阻断抗体的浓度独立的为812 g/ml。 5.根据权利要求1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤1)免疫功能受损的浸润性T淋巴 细胞溶液的细胞数量为4.55.5105/200 l。 6.。

5、根据权利要求1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3 抗体、 anti-CD28抗体混合后, 所述anti-CD3抗体的终浓度为23 g/ml。 7.根据权利要求1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3 抗体、 anti-CD28抗体混合后, 所述anti-CD28抗体的终浓度为11.5 g/ml。 8.根据权利要求1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤2)培养的时间为46d。 9.根据权利要求1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤3)培养物与布雷非德菌素A混合 后, 所述布雷非德菌素A的终浓度为812 g/ml。 10.。

6、根据权利要求1所述的方法, 其特征在于, 所述步骤3)孵育的时间为57h。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109294987 A 2 一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法 技术领域 0001 本发明属于T淋巴细胞受体技术领域, 具体涉及一种非治疗目的的恢复浸润性T淋 巴细胞免疫功能的方法。 背景技术 0002 目前, 我国大部分原发性肝癌患者的病因均为乙肝病毒感染, 现有技术中记载了 原发性肝癌(HCC)组织中浸润性T淋巴细胞(TIL)表达大量衰老分子, 浸润性淋巴细胞处于 免疫无能和衰老状态。 浸润性T淋巴细胞较早即可在慢性肝炎病毒感染中被诱导耐受, 原发 性肝癌发生后浸润。

7、性T淋巴细胞在肿瘤微环境中更进一步被诱导无能和衰老, 加上肝脏特 有的免疫耐受器官环境, 原发性肝癌中的浸润性T淋巴细胞较其它肿瘤的浸润性细胞更难 以激活扩增。 原发性肝癌中的浸润性T淋巴细胞对CD3单抗等刺激仅能扩增20倍, 很难恢复 免疫活力。 传统方法很难对衰老的浸润性T淋巴细胞进行恢复, 如用抗体阻断KLRG1、 LAG3等 其他众多衰老分子, 很难恢复。 因此, 突破上述传统方法, 寻找恢复浸润性T淋巴细胞的免疫 活性的方法至关重要。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方 法, 采用本发明提供的方法能够使免疫功能受损的浸润性T淋巴细。

8、胞的免疫功能得到恢复。 0004 本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞免疫功能的方法, 包括: 0005 1)将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合, 得到含有阻断剂的溶 液; 0006 所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体; 0007 2)将所述步骤1)得到的含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、 anti-CD28抗体混合 后进行培养, 得到培养物; 0008 3)将所述步骤2)得到的培养物与布雷非德菌素A混合、 孵育, 得到免疫功能恢复的 浸润性T淋巴细胞。 0009 优选的, 所述步骤1)中, 当所述阻断剂为anti-Tim。

9、-3阻断抗体时, 所述含有阻断剂 的溶液中anti-Tim-3阻断抗体的浓度为812 g/ml。 0010 优选的, 所述步骤1)中, 当所述阻断剂为anti-PD-1阻断抗体时, 所述含有阻断剂 的溶液中anti-PD-1阻断抗体的浓度为812 g/ml。 0011 优选的, 所述步骤1)中, 当所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗 体时, 所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的浓度独立的 为812 g/ml。 0012 优选的, 所述步骤1)免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液的细胞数量为4.5 5.5105/200 l。

10、。 0013 优选的, 所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、 anti-CD28抗体混合后, 说明书 1/7 页 3 CN 109294987 A 3 所述anti-CD3抗体的终浓度为23 g/ml。 0014 优选的, 所述步骤2)含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、 anti-CD28抗体混合后, 所述anti-CD28抗体的终浓度为11.5 g/ml。 0015 优选的, 所述步骤2)培养的时间为46d。 0016 优选的, 所述步骤3)培养物与布雷非德菌素A混合后, 所述布雷非德菌素A的终浓 度为812 g/ml。 0017 优选的, 所述步骤3)孵育的时间为57。

11、h。 0018 本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的免疫功能的方法, 所述 阻断剂anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋 巴细胞表面Tim-3和/或PD-1的表达, 进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免 疫功能。 0019 本发明实施例的结果显示: 本发明利用流式细胞术检测了肿瘤及癌旁部位浸润的 CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例情况, 检测了原发性肝癌患者血液、 肿瘤部位及癌旁部位的 CD4+和CD8+T淋巴细胞表面Tim-3和PD-1的表达情况, 并且体外阻断这两种受体后, CD4+和 CD8+T淋巴细胞分泌的细。

12、胞因子的量及细胞增殖情况。 发现肿瘤部位浸润的CD8+T淋巴细胞 的数量少于癌旁部位, 原发性肝癌患者血液、 肿瘤组织和癌旁组织中浸润的T淋巴细胞表面 均表达抑制型受体Tim-3和PD-1, 但肿瘤组织中其表达量高于癌旁, 但两部位其表达量没有 统计学差异。 Tim-3+和PD-1+的T淋巴细胞分泌细胞因子的能力受损。 体外阻断后T淋巴细胞 的功能及其体外增殖能力得到一定程度的提高。 从而找到一种逆转肝癌组织TIL的免疫无 能状态并恢复其免疫功能的新方法。 附图说明 0020 图1为流式细胞仪结果, 其中A为流式细胞仪结果原图, B为流式细胞仪结果的分析 图; 0021 图2为流式细胞仪结果原。

13、图及数据分析图; 0022 图3为激光共聚焦显微镜检测结果; 0023 图4为CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子结果 0024 图5为CD8+T淋巴细胞分泌的细胞因子结果; 0025 图6为阻断两种表面标记物后CD4+和CD8+细胞的比例结果; 0026 图7为阻断两种标记物后CD4+T淋巴细胞的分泌的细胞因子结果; 0027 图8为阻断两种标记物后CD8+T淋巴细胞的分泌的细胞因子结果; 0028 图9为阻断两种标记物后各组上清液中细胞因子的量的结果。 具体实施方式 0029 本发明提供了一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的免疫功能的方法, 包括: 0030 1)将免疫功能受损的浸润性T淋巴。

14、细胞溶液与阻断剂混合, 得到含有阻断剂的溶 液; 0031 所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体; 0032 2)将所述步骤2)得到的含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、 anti-CD28抗体混合 说明书 2/7 页 4 CN 109294987 A 4 后进行培养, 得到培养物; 0033 3)将所述步骤2)得到的培养物与布雷非德菌素A混合、 孵育, 得到免疫功能恢复的 浸润性T淋巴细胞。 0034 本发明将免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液与阻断剂混合, 得到含有阻断剂 的溶液。 0035 在本发明中, 所述免疫功能受损的浸润性T细胞的来源优选为。

15、原发性肝癌患者的 外周血, 本发明对所述分离得到免疫功能受损的浸润性T细胞的方法没有特殊限定, 采用本 领域常规分离方法即可。 0036 在本发明中, 所述免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞溶液的细胞数量为4.55.5 105/200 l, 更优选为4.85.2105/200 l, 最优选为5105/200 l。 0037 在本发明中, 所述阻断剂包括anti-Tim-3阻断抗体和/或anti-PD-1阻断抗体, 当 所述阻断剂为anti-Tim-3阻断抗体时, 所述含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体的浓 度优选为812 g/ml, 更优选为911 g/ml, 最优选为10 g/ml。。

16、 在本发明中, 所述anti- Tim-3阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面的Tim-3的表达, 进而能够 恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。 0038 在本发明中, 当所述阻断剂为anti-PD-1阻断抗体时, 所述含有阻断剂的溶液中 anti-PD-1阻断抗体的浓度优选为812 g/ml, 更优选为911 g/ml, 最优选为10 g/ml。 在 本发明中, 所述anti-PD-1阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面的PD-1 的表达, 进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。 0039 在本发明中, 当所述阻断剂为anti-Tim-。

17、3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体时, 所述 含有阻断剂的溶液中anti-Tim-3阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的浓度独立的优选为8 12 g/ml, 更优选为911 g/ml, 最优选为10 g/ml。 在本发明中, 所述anti-Tim-3阻断抗体 和anti-PD-1阻断抗体能够阻断免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞表面的Tim-3和PD-1的表 达, 进而能够恢复免疫功能受损的浸润性T淋巴细胞的免疫功能。 本发明对所述anti-Tim-3 阻断抗体和anti-PD-1阻断抗体的来源没有特殊限定, 采用常规市售产品即可。 0040 本发明将含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、。

18、 anti-CD28抗体混合后进行培养, 得 到培养物。 0041 在本发明中, 所述含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、 anti-CD28抗体混合后, 所 述anti-CD3抗体的终浓度优选为23 g/ml, 更优选为2.22.8 g/ml, 最优选为2.5 g/ml。 本发明对所述anti-CD3抗体的来源没有特殊限定, 采用常规市售的即可。 在本发明中, 所述 anti-CD3抗体上调T淋巴细胞白细胞介素2受体(interleukine-2receptor,IL-2R)表达, 刺 激T细胞增殖与活化。 0042 本发明中, 所述含有阻断剂的溶液与anti-CD3抗体、 anti-C。

19、D28抗体混合后, 所述 anti-CD28抗体的终浓度优选为11.5 g/ml, 更优选为1.21.3 g/ml, 最优选为1.25 g/ ml。 本发明对所述anti-CD28抗体的来源没有特殊限定, 采用常规市售的即可。 在本发明中, 所述anti-CD28抗体与其配体B7相互作用, 可以为T淋巴细胞活化提供必要的第二信号途 径。 本发明对所述anti-CD3抗体和anti-CD28抗体的来源没有特殊限定, 采用常规市售产品 即可。 0043 在本发明中, 所述培养的时间优选为46d, 更优选为5d; 所述培养的温度优选为 说明书 3/7 页 5 CN 109294987 A 5 37,。

20、 所述培养优选在5CO2的环境下进行。 0044 本发明将得到的培养物与布雷非德菌素A混合、 孵育, 得到免疫功能恢复的浸润性 T淋巴细胞。 0045 在本发明中, 所述培养物与布雷非德菌素A混合后, 所述布雷非德菌素A的终浓度 优选为812 g/ml, 更优选为911 g/ml, 最优选为10 g/ml。 本发明对所述布雷非德菌素A 的来源没有特殊限定, 采用常规市售的产品即可。 在本发明中, 所述布雷非德菌素A的作用 是阻断细胞因子向细胞外分泌。 0046 在本发明中, 所述孵育的时间优选为57h, 更优选为5.56.5h, 最优选为6h; 所 述孵育的温度优选为37; 所述孵育优选在5C。

21、O2的环境下进行。 0047 下面结合具体实施例对本发明所述的一种非治疗目的的恢复浸润性T淋巴细胞的 免疫功能的方法做进一步详细的介绍, 本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。 0048 实施例1 0049 1、 采集原发性肝癌患者外周血于肝素锂抗凝的采血管中, 采用Ficoll-Paque Plus密度梯度离心的方法迅速分离外周血单个核细胞, 操作步骤如下: 0050 1)采用与全血等量的PBS稀释血液; 0051 2)往离心管中加入与稀释全血等量的Ficoll分离液, 将稀释后的血液沿着管壁缓 慢地加在Ficoll分离液的上层, 不与Ficoll分离液混匀, 室温1500rpm, 离心2。

22、0min; 离心速 度采用慢升慢降, 上升速度设置为1, 下降速度设置为0; 0052 3)离心后, 可看到离心管中由上而下细胞分为四层, 第一层为血浆层, 第二层为环 状白色淋巴细胞层, 第三层为透明分离液层, 第四层为红细胞层; 收集第二层细胞放入含pH 值为7.4PBS(GIBCO)7ml的离心管中, 充分混匀, 室温1500rpm, 离心5min; 将得到的沉淀重复 洗一次; 0053 4)弃上清, 用PBMC培养基或者PBS重悬沉淀(沉淀即为细胞), 以进行下一步实验, 用96孔板培养时, 每孔5*106个细胞(细胞为外周血单个核细胞)。 0054 2、 提取原发性肝癌患者的肿瘤组织。

23、和癌旁组织中的单个核细胞: 0055 于无菌条件下取原发性肝癌患者的肿瘤和癌旁组织(距离肿瘤组织1左右)标本 3*3*3, 于生物安全柜中用无菌小剪刀剪碎, 加入含双抗的10FBS-RPMI164010ml, 加入 胶原酶(终浓度为1mg/ml), 加入DNase I(终浓度为20ug/ml)于37恒温摇床中孵育2小时, 间隔半小时摇晃一次, 2小时后用70 m筛网过滤, 然后参照外周血淋巴细胞分离方法采用 Ficoll-Paque Plus密度梯度离心分离出组织中单个核细胞。 0056 3、 细胞表面标记物及核内因子染色与流式细胞检测分析 0057 上述步骤分离的外周血单个核细胞和组织中单个。

24、核细胞, 在体外培养24小时细胞 状态恢复后进行细胞表面标记物或核内因子染色, 染色步骤如下: 0058 1)收集96孔板中的细胞于装有3ml含2FBS的PBS(以下统称洗液)的流式管中, 1500rpm离心5min, 弃上清; 0059 2)用200 l洗液重悬细胞, 按表面抗体说明书的使用量加入对应量的抗体, 进行细 胞表面标志物的染色, 同时加入同型对照IgG抗体进行染色, 以保证抗体染色的特异性, 4 避光孵育30min; 0060 3)4冰箱中取出加入4ml洗液, 1500rpm 5min离心; 说明书 4/7 页 6 CN 109294987 A 6 0061 4)倒去上清, 加入。

25、250ul的(cytofix/toperm)破膜固定剂, 混匀, 置于4冰箱避光 反应30min; 0062 5)取出, 加入3ml 1X的perm/washbuffer(跟cytofix/toperm配套的), 1500rpm, 5min离心; 0063 6)倒去上清, 残留200ul的洗液, 振荡重悬, 根据细胞数和说明书, 加入所需的流式 抗体量(胞内标记抗体); 0064 7)轻微混匀后, 置于4冰箱避光反应30min; 0065 8)4冰箱取出标本, 加入4ml的2多聚甲醛的PBS, 1500rpm, 5min离心, 倒去上 清, 残留200ul的buffer, 振荡重悬, 用Bec。

26、kman Coulter Gallios10色分析型流式细胞仪进 行检测(注:用等量PBS稀释4多聚甲醛为2的浓度); 0066 9)流式数据采用Kaluza 1.2软件进行分析。 0067 4、 人CD3磁珠分选CD3阳性细胞及荧光染色 0068 1)用70 m孔径的尼龙滤网过滤组织中分离出的单个核细胞, 彻底振荡CD3磁珠颗 粒, 加入50ul磁珠于每107细胞EP管中; 0069 2)将EP管放于摇床上彻底混匀, 室温下孵育30min; 0070 3)将EP管中细胞转移到BD流式管中, 将BD流式管置于BD磁力架上, 孵育10min; 0071 4)沿BD流式管外侧壁吸取上清并弃去, 上。

27、清中即为CD3阴性细胞或碎片; 0072 5)从磁力架上取下BD流式管加入2ml PBS, 吹吸混匀后再次放于BD磁力架上4min; 0073 6)重复步骤4), 如果要进一步提高CD3阳性细胞的纯度, 再次重复步骤4)和5); 0074 7)将得到的细胞种于96孔板中, 200ul/孔, 培养24小时后进行荧光染色。 0075 8)24小时后收集细胞, 按上述细胞表面标记染色方法染CD3阳性细胞表面CD4, CD8, Tim-3, PD-1后, 于BD流式管中加入3ml双蒸水, 1500rpm, 5min, 弃上清, 重悬; 0076 9)重复步骤8)三次, 剩余200ul细胞液, 铺片, 。

28、加入40ul细胞液于盖玻片中央, 置于 生物安全柜中静置晾干, 加3ul DAPI于载玻片中央, 将盖玻片盖上(注意不要有气泡), 将其 置于4冰箱中保存待激光共聚焦显微镜下拍片。 0077 5、 原发性肝癌T淋巴细胞的体外阻断实验 0078 将用CD3磁珠分选出来的CD3阳性T淋巴细胞体外培养24小时待细胞表面抗原标记 恢复后, 将细胞分为4组, 每组三个复孔, 每孔5*105细胞, 200ul/孔, 只加anti-Tim-3阻断抗 体(终浓度为10ug/ml)组、 只加anti-PD-1阻断抗体(终浓度为10ug/ml)组、 加anti-Tim-3阻 断抗体和anti-PD-1阻断抗体(浓。

29、度比为1:1)组、 只加同型对照抗体IgG组(终浓度为10ug/ ml), 每孔中加入anti-CD3抗体(终浓度为2.5ug/ml)、 anti-CD28抗体(终浓度为1.25ug/ml) 共刺激, 体外培养5天后, 每孔中加入BrefeldinA(终浓度为10ug/ml), 再次孵育6小时后, 各 组收集上清120ul用于CBA实验检测上清中的细胞因子的量, 收集细胞用于流式检测。 0079 6、 人Th1/Th2细胞因子CBA试剂盒检测 0080 阻断实验中收集的四个组的上清120ul, 用于上清中细胞因子的检测, 详细实验步 骤如下: 0081 6.1制备人Th1/Th2/Th17细胞。

30、因子标准品 0082 重悬和梯度稀释标准品: 0083 1)打开一管冻干的人Th1/Th2标准品, 将标准品小球转移到一支15mL锥形离心管 说明书 5/7 页 7 CN 109294987 A 7 中, 并标记该管为最高浓度标准品; 0084 2)用2mL实验稀释液重悬标准品; 0085 3)重悬后的标准品溶液需室温下平衡至少15分钟; 0086 4)用吸头轻轻混匀标准品, 切勿剧烈震荡; 0087 5)取出9根1275mm流式上样管, 分别标记梯度稀释的倍数1:2、 1:4、 1:8、 1:16、 1: 32、 1:64、 1:128、 1:256; 0088 6)每管各加300 l实验稀。

31、释液; 0089 7)梯度稀释标准品: 0090 A.从最高浓度标准品管取300 l液体到1:2管, 吹打混匀; 0091 B.从1:2管取300 l液体到1:4管, 吹打混匀, 依此类推, 直到1:256管; 0092 C.仅可用枪吹打混匀, 不可涡旋。 0093 6.2混合人Th1/Th2细胞因子捕获微球 0094 1)确定实验管数(包括标准品和对照管), 如8个待测样本、 9个标准品、 1个阴性对 照, 共18管; 0095 2)混合前每种捕获微球需充分涡旋5秒(注意:微球易沉积, 吸出前必须充分混 匀); 0096 3)为保证每个实验管都含有6种微球, 每种捕获微球需各取10 l, 如。

32、实验管为18 个, 需要每种微球的量是180 l, 将所有6种捕获微球都装入一根流式管中, 标记为 “混合微 球” ; 0097 4)充分涡旋混匀; 0098 5)将混匀的微球加入待测样本、 标准品和阴性对照管中, 每管60ul, 然后每管加入 50ulPE检测试剂, 避光室温孵育3小时后, 每管中加入1ml洗液离心200g, 5min; 0099 6)离心完毕弃上清, 加300ul洗液, 待上机。 0100 7、 数据分析 0101 采用GraphPadPrism(5.0版本)对数据进行统计学分析, 采用paired t test及独 立t检验, P0.05差异有统计学意义, 误差棒代表SE。

33、M。 0102 实验结果如下: 0103 1肿瘤、 癌旁及血液中T淋巴细胞分化及功能的比较 0104 由于肿瘤部位和癌旁部位的微环境恶性程度不同, 为了检测上述微环境中T淋巴 细胞种类及功能的差异, 比较了肿瘤和癌旁两个部位浸润的CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例 及各自抑制型分子Tim3和PD-1的表达情况, 同时利用血液中T细胞作为正常对照组。 结果发 现肿瘤部位的CD8+T淋巴细胞的比例明显低于癌旁部位的CD8+T淋巴细胞的比例, 而该部位 CD4+T淋巴细胞的比例明显高于癌旁(见图1), 肿瘤部位和癌旁部位CD4+T和CD8+T淋巴细胞 表面抑制型受体Tim-3和PD-1表达量差异无统。

34、计学意义, 但均高于血液中CD4+和CD8+T淋巴 细胞表面抑制型受体Tim-3和PD-1的表达(见图2)。 0105 2激光共聚焦显微镜检测T淋巴细胞表面受体Tim-3和PD-1 0106 从原发性肝癌肿瘤组织中分离出单个核细胞, 用CD3磁珠将CD3+的T淋巴细胞分选 出来, 染CD4, CD8, Tim-3, PD-1, DAPI染核共定位, 通过共聚焦显微镜检测发现CD4+和CD8+T 淋巴细胞表面均有Tim-3和PD-1的表达, 结果见图3。 说明书 6/7 页 8 CN 109294987 A 8 0107 3Tim-3+与Tim-3-、 PD-1+与PD-1-T淋巴细胞分泌的细胞。

35、因子的比较 0108 在抗肿瘤免疫中, 最重要的是T淋巴细胞分泌的IFN-、 TNF- 的量, 经检测肿瘤组 织部位浸润的T淋巴细胞数量较少, 为更好的比较Tim-3+与Tim-3-、 PD-1+与PD-1-T淋巴细 胞分泌的细胞因子的量, 选取癌旁部位浸润的T淋巴细胞来做进一步的比较。 研究发现Tim- 3+或PD-1+的CD4+T淋巴细胞分泌的细胞因子均比Tim-3-或PD-1-的CD4+T淋巴细胞分泌的 细胞因子量少, 结果见图4, CD8+T淋巴细胞也显示了同样的结果, 见图5。 0109 4体外T淋巴细胞表面受体Tim-3和PD-1的阻断实验 0110 体外将肿瘤或癌旁组织中T淋巴细。

36、胞表面标记Tim-3或PD-1阻断5天后, 单独Tim-3 或PD-1或同时阻断Tim-3和PD-1组CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例均较未处理组高, 结果见图 6, 并且, Tim-3和PD-1同时阻断组CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例最高。 同型对照组CD4+T淋巴 细胞和CD8+T淋巴细胞的比例最低。 四个不同处理组分泌的细胞因子IFN-、 TNF- 及细胞 增殖标记Ki67的表达量也显示了同样的差异。 并且同时阻断组分泌的细胞因子IFN-、 TNF- 及细胞增殖标记Ki67的量与未处理组相比差异有统计学意义, 结果见图7和8。 0111 5CBA检测各个不同处理组上清中细胞因子的量。

37、 0112 收集阻断实验中各个处理组的细胞培养上清, 用多因子检测试剂盒Th1/Th2CBA试 剂盒检测各处理组上清中IFN-、 TNF- 的量, 经检测发现T淋巴细胞表面受体Tim-3、 PD-1 单独阻断组和Tim-3、 PD-1同时阻断组的细胞培养上清中细胞因子IFN-、 TNF- 的量与同 型对照组相比均增多, 结果见图9。 0113 由以上实施例可以得出, 本发明利用流式细胞术检测了肿瘤及癌旁部位浸润的 CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例情况, 检测了原发性肝癌患者血液、 肿瘤部位及癌旁部位的 CD4+和CD8+T淋巴细胞表面Tim-3和PD-1的表达情况, 并且体外阻断这两种受体后。

38、, CD4+和 CD8+T淋巴细胞分泌的细胞因子的量及细胞增殖情况。 发现肿瘤部位浸润的CD8+T淋巴细胞 的数量少于癌旁部位, 原发性肝癌患者血液、 肿瘤组织和癌旁组织中浸润的T淋巴细胞表面 均表达抑制型受体Tim-3和PD-1, 但肿瘤组织中其表达量高于癌旁, 但两部位其表达量没有 统计学差异。 Tim-3+和PD-1+的T淋巴细胞分泌细胞因子的能力受损。 体外阻断后T淋巴细胞 的功能及其体外增殖能力得到一定程度的提高。 从而找到一种逆转肝癌组织TIL的免疫无 能状态并恢复其免疫功能的新方法。 0114 以上所述仅是本发明的优选实施方式, 应当指出, 对于本技术领域的普通技术人 员来说, 。

39、在不脱离本发明原理的前提下, 还可以做出若干改进和润饰, 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说明书 7/7 页 9 CN 109294987 A 9 图1 图2-1 说明书附图 1/8 页 10 CN 109294987 A 10 图2-2 说明书附图 2/8 页 11 CN 109294987 A 11 图3 说明书附图 3/8 页 12 CN 109294987 A 12 图4 说明书附图 4/8 页 13 CN 109294987 A 13 图5 说明书附图 5/8 页 14 CN 109294987 A 14 图6 图7 说明书附图 6/8 页 15 CN 109294987 A 15 图8 说明书附图 7/8 页 16 CN 109294987 A 16 图9 说明书附图 8/8 页 17 CN 109294987 A 17 。

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