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1、(10)授权公告号 CN 101638633 B (45)授权公告日 2012.02.15 CN 101638633 B *CN101638633B* (21)申请号 200910023791.9 (22)申请日 2009.09.04 C12N 5/06(2006.01) (73)专利权人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省西安市杨凌示范区邰城 路 3 号 (72)发明人 华进联 朱海鲸 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 陆万寿 (54) 发明名称 一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养 方法 (57) 摘要 本发明公开了一种山羊雄性生殖干细胞。
2、的体 外分离及培养方法， 从雄性山羊的睾丸的曲细精 管得到精原细胞， 山羊雄性生殖干细胞的分离纯 化方法采用0.2明胶和Matrigel差速贴壁结合 克隆法， 将未贴壁的山羊雄性生殖干细胞与贴壁 培养的其他细胞区分、 分离。 分离到的山羊雄性生 殖干细胞的培养为 MEF 有饲养层培养或者无饲养 层培养。 分离到的山羊雄性生殖干细胞具有ES细 胞特性和向神经细胞、 心肌细胞和精子样细胞的 分化潜能。 (51)Int.Cl. 审查员 安玉苹 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 3 页 CN 101638633 B1/1 页 2 1. 一。
3、种山羊雄性生殖干细胞的体外分离方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1) 分离细胞 将从无菌采集的山羊睾丸中分离的曲细精管剪碎至碎块， 用包含体积分数 10 FBS 的 DMEM 培养液重悬 2 3 次曲细精管碎块， 静置之后得到下层曲细精管细胞团 ； 然后用包含 质量分数0.1的Collagenase、 10g/ml DNase和质量分数0.1透明质酸酶的混合液消 化处理下层曲细精管细胞团23次， 每次2030分钟， 用包含体积分数10FBS的DMEM 培养液重悬， 分离得到精原细胞 ； 2) 雄性生殖干细胞的原代培养 将得到的精原细胞以 5105个 /mL 的密度接种在经质量分数 0.2。
4、的明胶 37包被 30min 的塑料培养皿， 培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液 ； 所述山羊雄性生殖干细胞分离培养液以 DMEM 高糖培养基为基础培养基， 还包括以 下组分 ： 体积分数 20的胎牛血清、 2mmol/L L- 谷氨酰胺、 1mmol/L 丙酮酸钠、 0.1mmol/L - 巯基乙醇、 0.1mmol/L 非必需氨基酸、 5 10ng/ml 的碱性成纤维生长因子、 1000U/ml 的 白血病抑制因子、 100IU/ml 青霉素和 100mg/mL 链霉素 ； 培养 12h 后将未贴壁的细胞转到经 Matrigel 基质膜 4包被 1 小时的塑料培养皿培 养， 培养液为山羊。
5、雄性生殖干细胞分离培养液或人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液 ； 未贴壁的细胞第一次转移培养 2h 后， 将转移培养后再次未贴壁的细胞转移培养到经 Matrigel 基质膜 4包被 1 小时的塑料培养皿培养， 培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培 养液或人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液 ； 未贴壁细胞第二次转移培养后， 2 天更换一次培养液 ； 细胞生长 3 7 天后， 开始出现 致密胚胎干细胞样集落 ； 3) 雄性生殖干细胞的传代培养 待致密胚胎干细胞样集落生长至周边开始出现分化细胞时， 将致密胚胎干细胞样集落 吸出， 在 PBS 中洗涤 2 次 ； 再移到 TrypLE 细胞消化液或质量分数 0。
6、.05的胰蛋白酶中消化 2 3min， 并吹吸 5 20 次 ； 将离散开的单细胞或小细胞团转移到经 Matrigel 基质膜 4 包被 1 小时的塑料培养皿培养， 培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液 ； 37、 5 CO2饱 和湿度条件下培养 ； 培养 3 7 天后， 开始出现致密胚胎干细胞样集落， 即为山羊雄性生殖干细胞。 权 利 要 求 书 CN 101638633 B1/6 页 3 一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及动物干细胞的体外增殖、 分化、 分离， 特别涉及一 种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养方法。 背景技术 00。
7、02 生殖细胞的发生、 增殖、 分化的研究是生命科学研究的重要课题之一。 在动物繁殖 育种中， 高产、 优质的遗传资源完全依赖于生殖细胞来完成遗传 ； 在人类， 由于精子细胞的 发生、 成熟障碍等引起的不育症更是困扰众多患者的一个现实问题 ； 在基础研究中， 精子更 是发育生物学研究的最重要研究对象之一 ； 因此生殖细胞的发生、 分化的研究， 在畜牧业生 产和生物医学研究中具有重要的意义。然而高等哺乳动物生殖细胞的发生、 转移、 分化完 全在体内完成， 因此很难动态实时地检测和研究其中的分子事件 (Hua 等， Recentadvances in the derivation of germ 。
8、cells from the embryonic stem cells.StemCells and Development， 2008， 17 ： 399-411)。 0003 干细胞是一类具有自我更新、 高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。胚胎干细胞 (ES 细胞或 ESCs) 是由早期胚胎内细胞团 (ICM) 或原始生殖细胞 (PGCs) 分离而来的多能 干细胞。 由于胚胎干细胞的独特生物学特性， 使干细胞在细胞替代治疗、 组织器官修复与重 建、 基因治疗以及发育生物学模型、 新药开发和毒理实验等， 几乎所有的生命科学和生物医 药领域均具有重要的意义。 0004 近 年 来，一 些 著 名 。
9、的 研 究 (Sesndel 等， Generation of functional multipotentadult stem cells from GPR125+ germline progenitors.Nature ； 2007， 449 ： 346-350 ； Bukovsky 等， Generation of pluripotent stem cells from adult humantestis.Nature， 456， 344-349) 发现从胚胎期动物生殖嵴的原始生殖细胞或雄性的睾 丸可以得到类似于 ES 细胞的多能性分化潜能的雄性生殖干细胞 (mGSCs)。一般认为， 这。
10、些 雄性生殖干细胞 (mGSCs) 来源于原始生殖细胞 (primordial germ cells， PGCs)， 终生存在 于性分化后的睾丸中， 包括性分化后到精子发生过程中， 具有自我增殖和分化潜能的细胞 总称 ； 不同于精原干细胞 (SSCs)， mGSCs 可以分化为机体所有的类型细胞， 精原干细胞指未 分化的 A 型精原细胞， 一般认为其只有向精子分化的潜能 (Ko 等， 2009)。但也有人认为目 前生殖干细胞的起源并不清楚 (Yu 等， Pluripotent stem celllines.Genes & Dev， 2008， 22 ： 1987-1997)。 0005 由于成。
11、年动物睾丸的精原细胞在体外合适的条件下， 可能转化为多能性的雄性 生殖干细胞 (Matsui 等， Derivation of pluripotential embryonic stemcells from murine primordial germ cells in culture.Cell， 1992， 70 ： 841-847 ； 董武子等， 新生 牛雄性生殖细胞源类 ES 的培养及检测， 畜牧兽医学报， 2007， 38(2) ： 144-148 ； Guan 等， Pluripotency of spermatogonial stem cellsfrom adult mouse t。
12、estis.Nature， 2006， 440 ： 1199-1203 ； Sesndel 等， Generationof functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.Nature ； 2007， 449 ： 346-350 ； Kanatsu-Shinohara 说 明 书 CN 101638633 B2/6 页 4 等， Pluripotency of a singlespermatogonial stem cell in mice.Biol Reprod.， 2008， 78(4) ：。
13、 681-687 ； Kanatsu 等， Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis.Cell， 2004， 119 ： 1001-1012 ； Bukovsky 等， Generation of pluripotent stem cells from adulthuman testis.Nature， 456， 344-349 ； Kanatsu-Shinohara 等， Pluripotency of asingle spermatogonial stem cell in mice.Biol Reprod。
14、.， 2008， 78(4) ： 681-687)。所以， mGSCs 成为转基因动物和克隆动物的理想载体细胞， 而且比起正 常的 ES 细胞， mGSCs 细胞来源数量多， 培养相对容易。但对于生殖细胞研究来说， 更为重 要的是 mGSCs 能够有效地分化产生出精子 (Ko 等， Induction ofpluripotency in adult unipotent germline stem cells.Cell Stem Cell， 2009， 5 ： 87-96)。 0006 mGSCs 在线虫、 果蝇和小鼠等模式动物上取得了一些进展， 如建立了精原干细 胞的培养体系， 基本了解各种动。
15、物雄性生殖干细胞维持的机理 (Ko 等， Induction of pluripotency in adult unipotent germline stem cells.Cell StemCell， 2009， 5 ： 87-96)。 但对大家畜如牛、 羊、 猪等的生殖干细胞， 人们了解的仍很不够， 仅见的几篇研究报 道涉及到mGSCs细胞的分离培养， 但未见有生殖干细胞的标准化分离培养方法(董武子等， 山羊胎儿睾丸细胞体外分离培养及雄性生殖系干细胞的生长行为 . 农业生物技术学报， 2004， 12(6) ： 648-652. ； 董武子等， 胎牛雄性生殖干细胞源类 ES 细胞的分离培养与。
16、多能性 研究 . 生物工程学报， 2007， 23(4) ： 751-755 ； 董武子等， 新生牛雄性生殖细胞源类 ES 的培 养及检测 . 畜牧兽医学报， 2007， 38(2) ： 144-148)。 0007 山羊是一种重要的经济动物， 生产肉、 绒、 奶等经济产品， 特别是在利用山羊乳腺 作为生物反应器生产生物制品方面具有巨大的市场潜力。如何获得、 保持优质的种质遗传 资源， 对现有种群进行改良， 成为山羊大规模养殖的迫切问题， 对山羊生殖细胞的研究成为 解决种质遗传资源的重要手段。 发明内容 0008 本发明的解决的问题在于提供一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离及培养方法， 从雄性山。
17、羊的睾丸体外分离克隆雄性生殖干细胞， 并对分离到的山羊雄性生殖干细胞离体 培养， 为研究山羊的生殖细胞奠定基础。 0009 本发明是通过以下技术方案来实现 ： 0010 一种山羊雄性生殖干细胞的体外分离方法， 包括以下步骤 ： 0011 1) 分离细胞 0012 将从无菌采集的山羊睾丸中分离的曲细精管剪碎至碎块， 用包含体积分数 10 FBS 的 DMEM 培养液重悬 2 3 次曲细精管碎块， 静置之后得到下层曲细精管细胞团 ； 然后 用包含质量分数0.1的Collagenase、 10g/ml DNase和质量分数0.1透明质酸酶的混 合液消化处理下层曲细精管细胞团 2 3 次， 每次 20。
18、 30 分钟， 用包含体积分数 10 FBS 的 DMEM 培养液重悬， 分离得到精原细胞 ； 0013 2) 雄性生殖干细胞的原代培养 0014 将得到的精原细胞以 5105个 /mL 的密度接种在经质量分数 0.2的明胶 37 包被 30min 的塑料培养皿， 培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液 ； 0015 所述山羊雄性生殖干细胞分离培养液以 DMEM 高糖培养基为基础培养基， 还包括 说 明 书 CN 101638633 B3/6 页 5 以下组分 ： 体积分数 20的胎牛血清、 2mmol/L L- 谷氨酰胺、 1mmol/L 丙酮酸钠、 0.1mmol/L - 巯基乙醇、 0.1。
19、mmol/L 非必需氨基酸、 5 10ng/ml 的碱性成纤维生长因子、 1000U/ml 的 白血病抑制因子、 100IU/ml 青霉素和 100mg/mL 链霉素 ； 0016 培养 12h 后将未贴壁的细胞转到经 Matrigel 4包被 1 小时的塑料培养皿培养， 培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液或人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液 ； 0017 未贴壁的细胞第一次转移培养 2h 后， 将转移培养后再次未贴的壁细胞转移培养 到经 Matrigel 4包被 1 小时的塑料培养皿培养， 培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养 液或人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液 ； 0018 未贴壁细胞第二。
20、次转移培养后， 2 天更换一次培养液 ； 细胞生长 3 7 天后， 开始 出现致密胚胎干细胞样集落 ； 0019 3) 雄性生殖干细胞的传代培养 0020 待致密胚胎干细胞样集落生长至周边开始出现分化细胞时， 将致密胚胎干细胞样 集落吸出， 在 PBS 中洗涤 2 次 ； 再移到 TrypLE 细胞消化液或质量分数 0.05的胰蛋白酶中 消化 2 3min， 并吹吸 5 20 次 ； 将离散开的单细胞或小细胞团转移到经 Matrigel 4包 被 1 小时的塑料的培养皿培养， 培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液 ； 37、 5 CO2饱 和湿度条件下培养 ； 0021 培养 3 7 天后， 。
21、开始出现致密胚胎干细胞样集落， 即为山羊雄性生殖干细胞。 0022 进一步， 本发明还公开了分离得到的山羊雄性生殖干细胞的体外培养方法 ： 0023 将山羊雄性生殖干细胞接种到MEF饲养层上， 培养液以DMEM高糖培养基为基础培 养基， 还包括以下组分 ： 体积分数 10的胎牛血清、 体积分数 10的血清替代品、 2mM 谷氨 酰胺、 0.1mM -巯基乙醇、 100IU/ml青霉素、 100mg/mL链霉素、 质量分数的1非必需氨基 酸、 1000IU/ml 白血病抑制因子、 5 10ng/ml 碱性成纤维生长因子、 质量分数 1的 ITS ； 2 天更换一次培养液 ； 0024 或者将山羊。
22、雄性生殖干细胞接种到 Matrigel 4包被 1 小时的塑料培养皿无饲 养层培养， 培养液为人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液， 2 天更换一次培养液。 0025 与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果 ： 0026 1、 分离克隆的山羊雄性生殖干细胞形成典型的致密胚胎干细胞样集落， 具有 ES 细胞特性， 其碱性磷酸酶 (AP) 呈阳性， OCT4、 SSEA1、 SSEA 3、 SSEA 4、 1-INTEGRIN、 NANOG、 CD49f、 CD133、 C-MYC、 SOX2、 KLF4 也呈阳性 ； 0027 2、 分离克隆的山羊雄性生殖干细胞具有三胚层的分化潜能， 能分化。
23、形成神经细 胞、 心肌细胞和精子样细胞 ； 尤其是具有精子样细胞的分化潜能对于山羊优质种质资源的 获得、 保持、 改良具有重要的意义 ； 0028 3、 分离培养的山羊雄性生殖干细胞较大， 细胞透亮、 遮光性强、 核大， 培养后 3 7 天形成典型的致密细胞克隆， 类似 ES 细胞克隆。 附图说明 0029 图1为山羊雄性生殖干细胞的生物学特性和染色检测结果 ； 其中， 图A为单个山羊 雄性生殖干细胞， 较大， 细胞透亮、 遮光性强、 核大 ； 图 B、 C 为山羊雄性生殖干细胞集落， 致 密 ； 图 D、 E 为碱性磷酸酶染色显示山羊雄性生殖干细胞呈红色， 为 AP 阳性 ； 图 F 为山羊。
24、雄 说 明 书 CN 101638633 B4/6 页 6 性生殖干细胞集落的 Gimesa 染色， 核大 ； Bar 100m。 0030 图2为山羊雄性生殖干细胞表面标记的免疫荧光化学检测结果 ； 其中， 图A表示为 OCT4 阳性 ； 图 B 表示为 SSEA1 阳性 ； 图 C 表示为 SSEA 3 弱阳性 ； 图 D 表示为 SSEA 4 阳性 ； 图 E 表示为 1-INTEGRIN 阳性 ； 图 F 表示为 NANOG 阳性 ； 图 G 表示为 CD49f 阳性 ； 图 H 表 示为 CD133 阳性 ； 图 I 表示为 VASA 弱阳性 ； 图 J 表示 C-MYC 阳性、 图。
25、 K 表示 SOX2 阳性、 图 L 表示 KLF4 阳性 ； Bar 20m。 0031 图3为山羊雄性生殖干细胞的分化潜能检测， 其中， 图A为山羊雄性生殖干细胞悬 浮培养形成的类胚体 (EB) ； 图 B 为 EB 贴壁培养后周边分化出神经样细胞 ； 图 C 为山羊雄性 生殖干细胞分化出神经样细胞 ； 图D为EB贴壁培养后分化出的心肌样细胞融合的肌管样结 构 ； 图 E 为 EB 贴壁培养后分化出的心肌样细胞呈心肌 -actin 阳性 ； 图 F 为 EB 贴壁培养 后分化出的心肌样细胞呈心肌特异性肌钙蛋白T阳性 ； 图G为EB贴壁培养后分化出的脂肪 样细胞呈油红O阳性 ； 图H为EB贴。
26、壁培养后分化出的精子样细胞 ； 图I为EB贴壁培养后分 化出的精子样细胞呈Analine Blue阳性 ； 图J为山羊雄性生殖干细胞分化出的细胞呈VASA 阳性 ； 图K为山羊雄性生殖干细胞分化出的细胞呈FE-J1阳性 ； 图L为山羊雄性生殖干细胞 分化出的细胞呈 EMA1 阳性。 0032 图 4 为无饲层体外培养的山羊雄性生殖干细胞呈现较典型的致密胚胎干细胞样 集落。 具体实施方式 0033 本发明提供一种高效分离克隆山羊雄性生殖干细胞的培养体系， 包括山羊雄性生 殖干细胞的分离、 山羊雄性生殖干细胞的检测和体外培养。 0034 以 2 月龄以上胎羊、 新生羊或成年羊睾丸作为原始材料来源 。
27、； 山羊雄性生殖干细 胞的分离纯化方法采用 0.2明胶和 Matrigel 差速贴壁结合克隆法， 将未贴壁的山羊雄性 生殖干细胞与贴壁培养的其他细胞区分、 分离。 0035 a、 山羊雄性生殖干细胞的体外分离方法， 具体包括以下步骤 ： 0036 1) 分离山羊睾丸细胞 0037 用无菌含双抗 (500IU/ml 青霉素、 500mg/mL 链霉素 ) 的生理盐水将无菌采集的山 羊睾丸洗涤 3 遍， 再用含双抗的 PBS( 磷酸盐缓冲液 ) 洗涤 3 遍， 在无菌培养皿内剥去睾丸 外膜， 分离开曲细精管与睾丸梁， 去除小梁， 得到曲细精管 ； 0038 将 曲 细 精 管 剪 碎 至 1mm3。
28、 的 小 碎 块，用 包 含 体 积 分 数 10 FBS 的 DMEM(Dulbeccos Modified Eagle Media)培养液重悬(500转以下离心)曲细精管碎块， 重复 2 3 次， 静置 2 5 分钟之后， 得到下层曲细精管细胞团 ； 0039 然后用包含质量分数0.1的Collagenase、 10g/ml DNase和质量分数0.1透 明质酸酶的混合液消化处理 2 3 次， 每次 20 30 分钟， 再用 DMEM+10 FBS 重悬培养液 (500 转以下离心 )， 分离得到精原细胞 ； 0040 如果细胞团仍较大， 则用质量分数为0.25的胰蛋白酶处理35分钟， 用。
29、包含体 积分数 10 FBS 的 DMEM 培养液重悬， 细胞计数 ； 0041 2) 雄性生殖干细胞的原代培养 0042 将得到的精原细胞以5105个/mL的密度接种在经质量分数为0.2的明胶37 说 明 书 CN 101638633 B5/6 页 7 包被 30min 的塑料培养皿， 添加山羊雄性生殖干细胞分离培养液 ； 0043 所述山羊雄性生殖干细胞分离培养液以 DMEM 高糖培养基为基础培养基， 还包括 以下组分 ： 体积分数 20的胎牛血清、 2mmol/L L- 谷氨酰胺、 1mmol/L 丙酮酸钠、 0.1mmol/ L - 巯基乙醇、 0.1mmol/L 非必需氨基酸 (NE。
30、AA， 美国 Invitrogen 公司产品 )、 5 10ng/ ml 的碱性成纤维生长因子 (bFGF)、 1000U/ml 的白血病抑制因子 (mLIF)、 100IU/ml 青霉素、 100mg/mL 链霉素 ； 0044 培养 12h 后将未贴壁的细胞转到经 Matrigel 基质膜 (BD 公司 )4包被 1 小时的 塑料培养皿培养， 培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培养液或人胚胎干细胞无血清无饲养 层培养液 (mTeSR 培养液， 商品化的人类胚胎干细胞培养液， Stemcell 技术公司生产 ) ； 0045 未贴壁的细胞第一次转移培养 2h 后， 将转移培养后再次未贴壁的细胞转。
31、移培养 到经 Matrigel 基质膜 4包被 1 小时的培养皿培养， 培养液为山羊雄性生殖干细胞分离培 养液或人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液 ； 0046 未贴壁细胞第二次转移培养后， 2 天更换一次培养液 ； 细胞生长 5 7 天后， 开始 出现较典型的致密胚胎干细胞样集落 ； 0047 3) 雄性生殖干细胞的传代培养 0048 待致密胚胎干细胞样集落生长至周边开始出现分化细胞， 即周边细胞变大， 界限 明显时， 将致密胚胎干细胞样集落吸出， 在 100l PBS 中洗涤 2 次 ； 再移到 100l TrypLE 细胞消化液 ( 商品化的细胞消化液， Invitrogen 公司的 Tr。
32、ypLETM Express) 或质量分数 0.05的胰蛋白酶中消化 2 3min， 并用 10l 移液枪吹吸 5 20 次离散细胞 ； 将离散开 的单细胞或小细胞团移到经 Matrigel4包被 1 小时的塑料培养皿培养， 培养液为山羊雄 性生殖干细胞分离培养液 ； 37、 5 CO2饱和湿度条件下培养 ； 0049 细胞生长37天后， 开始出现较典型的致密胚胎干细胞样集落， 即为分离得到的 山羊雄性生殖干细胞。 0050 b、 分离到的山羊雄性生殖干细胞的细胞检测 0051 1) 碱性磷酸酶检测 0052 将传代培养分离到的致密胚胎干细胞样集落的山羊雄性生殖干细胞用 4多聚甲 醛固定35m。
33、in后， 用无钙镁的PBS洗两遍， 用碱性磷酸酶染液(2mg-萘酚磷酸盐和10mg 坚固红溶于 10ml PH 8.2 8.4 的 Tris-C1 溶液中 ) 染色 8min， 吸出染色液， PBS 洗 2 次， 照相记录 ； 0053 分离克隆的山羊雄性生殖干细胞具有 ES 细胞特性和生殖干细胞的生物学特性， 形成典型的集落， 如图 1B F 所示 ； 山羊雄性生殖干细胞的碱性磷酸酶染色呈红色， 如图 D E 所示， 为碱性磷酸酶 (AP) 阳性， 即具有多能性干细胞的特性 (Hua 等， 2009 ； Ko 等， 2009)。 0054 2) 免疫组化或免疫荧光检测 0055 将培养的山羊。
34、雄性生殖干细胞用 4多聚甲醛固定 15min， 用 PBS 洗两遍， 3 H2O2室温孵育 10min， PBS 洗两遍， 10胎牛血清 (PBS 稀释 ) 封闭， 室温孵育 30min， 倾 去血清， 分别滴加 OCT4(1 500)、 SSEA1(1 200)、 SSEA3(1 200)、 SSEA4(1 200)、 1-INTEGRIN(1 200)、 NANOG(1 200)、 CD49f(1 200)、 CD133(1 500)、 VASA(1 1000)、 C-MYC(1 200)、 SOX2(1 200)、 KLF4(1 200) 一抗工作液， 4过夜， 说 明 书 CN 101。
35、638633 B6/6 页 8 PBS 洗两遍， 滴加二抗 ( 羊抗兔 FITC 或羊抗鼠 FITC， 1 500) 工作液， 室温孵育 1h， PBS 洗 两遍， 每次 5min， 荧光显微镜下观察照相记录结果 ； 0056 上述免疫荧光的一抗标志均为 ES 细胞和生殖干细胞的标记， 检测结果分别如图 2 所示， OCT4(A)、 SSEA1(B)、 SSEA4(D)、 1-INTEGRIN(E)、 NANOG(F)、 CD49f(G)、 CD133(H)、 C-MYC(J)、 SOX2(K)、 KLF4(L) 检测呈阳性， SSEA3(C)、 VASA(I) 检测弱阳性， 表明山羊雄性生 。
36、殖干细胞具有生殖干细胞和 ES 细胞特性 (Hua 等， 2009 ； Ko 等， 2009)。 0057 3) 细胞体外分化潜能 0058 以 600 个细胞 /25l 的小滴悬滴培养制作类胚体 (EB， Hua 等， 2009)， 3 天后体视 显微镜下检查类胚体形成情况， 山羊雄性生殖干细胞悬浮培养形成的类胚体 (EB)， 如图 3A 所示 ； 收集 EB， 培养在 0.1明胶贴附的 48 空培养板上 ( 培养基为去除 bFGF 和 LIF 的山羊 雄性生殖干细胞分离液， 即以 DMEM 高糖培养基为基础培养基， 添加体积分数 20的胎牛血 清、 2mmol/LL-谷氨酰胺、 1mmol。
37、/L丙酮酸钠、 0.1mmol/L -巯基乙醇、 0.1mmol/L非必需氨 基酸、 100IU/ml 青霉素和 100mg/mL 链霉素 )， 1 3 周检查 EB 脱落出的细胞类型 ； 0059 分离克隆的山羊雄性生殖干细胞具有三胚层的分化潜能， 能够分化形成 EB( 图 3A 所示 )、 神经细胞 ( 图 3B、 C 所示 )、 心肌细胞 ( 图 3D、 E、 F 所示 )、 脂肪样细胞 ( 图 3G 所示， 油红 O 阳性 ) 和精子样细胞 ( 图 3H、 I 所示 ) ； 图 3J、 K、 L 分别为分化细胞呈精子及生殖细 胞特异性标记 VASA( 图 3J)、 FE-J1( 图 3。
38、K) 和 EMA1( 图 3L)， 表明分离克隆的山羊雄性生殖 干细胞具有分化为精子样的潜能 (Toyooka 等， 2003 ； Hua 等， 2009)， 这对于山羊优质种质资 源的筛选研究尤其重要。 0060 c、 对于分离得到的山羊雄性生殖干细胞， 其体外离体培养方法为 ： 0061 1) 有饲养层培养 0062 将山羊雄性生殖干细胞接种到 MEF 饲养层上 ( 即小鼠胚胎成纤维细胞饲养层， 用 怀孕 12-16 天的昆白小鼠胚胎成纤维细胞经 10g/mL 丝裂霉素处理 2-3 小时， 以 50000 个 /cm2的密度铺附在经 0.1明胶处理的塑料培养板上 )， 培养液以 DMEM 。
39、高糖培养基为基础 培养基， 还包括以下组分 ： 体积分数 10的胎牛血清 (FBS)、 体积分数 10的血清替代品 (KSR， Invitrogen)、 2mM 谷氨酰胺、 0.1mM - 巯基乙醇、 100IU/ml 青霉素、 100mg/mL 链霉 素、 1非必需氨基酸 (NEAA)、 1000IU/ml 白血病抑制因子 (LIF)、 5 10ng/ml 碱性成纤维 生长因子 (bFGF)、 1 ITS( 胰岛素 + 转铁蛋白 + 亚硒酸钠， Sigma 公司 ) ； 0063 培养 2 天更换一次培养液， 细胞生长 3 7 天后， 开始出现的较典型的致密生殖干 细胞集落， 如图 1B 所。
40、示。 0064 2) 无饲养层培养 0065 或者将山羊雄性生殖干细胞接种到 Matrigel(BD 公司 )4包被 1 小时的塑料培 养皿无饲养层培养， 培养液为人胚胎干细胞无血清无饲养层培养液 (mTeSR 培养液， Stem cells 公司 ) ； 0066 培养 2 天更换一次培养液， 细胞生长 3 7 天后， 开始出现的较典型的致密生殖干 细胞集落， 如图4A所示的无饲养层培养的山羊雄性生殖干细胞集落， 图4B无饲养层培养的 山羊雄性生殖干细胞集落免疫染色呈 AP 阳性。 说 明 书 CN 101638633 B1/3 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 101638633 B2/3 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 101638633 B3/3 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 。