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1、(10)授权公告号 CN 101597585 B (45)授权公告日 2013.04.10 CN 101597585 B *CN101597585B* (21)申请号 200910136516.8 (22)申请日 2009.05.06 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 任发政 地址 100083 北京市海淀区清华东路 17 号 中国农业大学食品科学与营养工程学 院 (72)发明人 田寒友 任发政 蒋菁莉 刘爱萍 杨海莺 赵亮 张丁丁 刘松玲 CN 1400304 A,2003.03.05, 全文 . 孙纪录等 . 菊芋汁双歧杆菌培养基。
2、的筛选优 化. 食品科学 .2003,第24卷(第11期),76-79. 田寒友等 . 双歧杆菌 BBMN02 培养基优化及 发酵罐补料分批培养 .中国乳业 .2008,( 第 10 期 ),50-53. (54) 发明名称 一种适合工业化生产双歧杆菌的培养基及其 配制方法 (57) 摘要 本发明公开了一种适合工业化生产双歧杆菌 的培养基及其配制方法。所述培养基由以下成分 组成 ： 玉米浆干粉 ( 蛋白含量 40 )， 55 63g/ L ； 葡萄糖， 5 10g/L ； 吐温 -80， 0 1g/L ； 初始 pH6.5 7.2。长双歧杆菌 BBMN68 及 BB12 在该 培养基中生长良好。
3、， 最大生长量达到 109cfu/ml， 优于经典双歧杆菌培养基 MRS 及 NPNL。该培养基 成本低廉 ( 相比 NPNL 培养基价格下降 95， 相比 MRS 培养基价格下降 80 )， 制作过程简单， 适合 双歧杆菌的工业化规模生产。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 高欣 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种适合工业化生产双歧杆菌的培养基， 其特征在于由以下成分组成 ： 以玉米浆干粉为氮源使培养基蛋白质含量为 22 25g/。
4、L ； 葡萄糖， 10 20g/L ； 吐 温 -80， 0 1g/L ； 初始 pH 6.5 7.2， 余量为水。 2. 如权利要求 1 所述的培养基， 其特征在于其中玉米浆干粉的蛋白质重量含量为 40。 3. 根据权利要求书 1 或 2 所述的适合工业化生产双歧杆菌培养基， 其特征在于所述玉 米浆干粉是经过喷雾干燥加工的精制玉米浆干粉。 4. 根据权利要求书 1 或 2 所述的适合工业化生产双歧杆菌培养基， 其特征在于所述葡 萄糖是分析纯葡萄糖。 5. 根据权利要求书 1 或 2 所述的适合工业化生产双歧杆菌培养基， 其特征在于所述吐 温 80 是分析纯吐温 80。 6. 用于制备权利要求。
5、 1-5 中任一项所述的适合工业化生产双歧杆菌培养基的方法， 其 特征在于包括以下步骤 ： (1) 制备玉米浆 ： 称重玉米浆干粉后， 补足水至规定浓度， 纱布过滤后， 备用 ； (2) 在步骤 (1) 的玉米浆中添加规定量的葡萄糖和 / 或吐温 80 ； (3) 调节 pH 值至 6.5 7.2 ； (4)110 121， 灭菌 10 15min 即得。 权 利 要 求 书 CN 101597585 B 2 1/4 页 3 一种适合工业化生产双歧杆菌的培养基及其配制方法 技术领域 0001 本发明涉及一种双歧杆菌的培养基及其制备方法， 特别涉及一种适合工业化的双 歧杆菌培养基。 。 背景技术。
6、 0002 双歧杆菌 (Bifidobacterium) 是人畜等温血动物肠道内重要的生理性细菌之一， 是人体健康的重要指标菌之一， 它在肠道菌群中所占比例直接影响着宿主的健康状况， 与 其它正常菌群一起构成了阻止外来菌入侵的定植阻力， 具有一定的生物拮抗作用， 同时双 歧杆菌体内含有大量的消化酶， 能消化一些机体内依靠本身的酶系不能消化的营养物质， 促进体内营养物质的吸收， 双歧杆菌及其表面结构成分可作为生物应答剂经口服或非胃肠 途径增强宿主的免疫监视功能， 可增强各种细胞因子和抗体的产生， 提高 NK 和巨噬细胞活 性， 提高局部或全身的防御功能， 发挥自稳调节、 抗感染、 抗肿瘤效应。 。
7、目前双歧杆菌多作为 益生菌添加在乳品中， 在欧美、 日本等国家的功能性食品市场占统治地位， 仅 2005 年就有 379 种益生菌产品上市。 0003 目前， 双歧杆菌较常用的培养基有 MRS、 NPNL、 TPY、 PTYG 等。TPY 和 PTYG 培养基 缓冲能力较弱， 不适合大规模使用 ； MRS 和 NPNL 营养成分丰富， 缓冲能力强， 但目前 MRS 和 NPNL 培养基存在如下问题 ： 价格较高 (NPNL 13 元 /L、 MRS 3 元 /L ； 缓冲体系中磷酸盐易造 成乳酸杆菌由耐冻的短棒变成不耐冻的纤棒状 ； 较多无机盐成分对人体和动物健康具有潜 在有害影响 ； L- 。
8、半胱氨酸盐酸盐经高温灭菌产生不愉快气味等问题限制其在工业上的应 用。 为了降低成本研究人员所筛选双歧杆菌培养基多是在生化培养基的基础上添加一定比 例的具有双歧增长因子的天然物质， 如番茄汁、 菊芋汁、 胡萝卜汁等， 也达到了提高活菌数 的目的， 但是此类培养基配制步骤较多， 操作繁琐， 不适宜用于工业化。 发明内容 0004 为克服现有技术中的上述不足， 本发明提供了一种以玉米浆干粉为主要原料的双 歧杆菌培养基。其具有成本经济和易于配制的特点。 0005 1 双歧杆菌模板培养基筛选 0006 为了对双歧杆菌的生长特性有一个初步的了解， 选择了耐酸耐胆盐等性能较好的 长双歧杆菌为实验菌株， 测定。
9、了长双歧杆菌在四种不同培养基下的生长曲线。采用 25mL 厌 氧螺口试管， NPNL、 MRS、 TPY、 PTYG 培养基， 接种量 1， 37静置培养， 每三小时取样， 测定 活菌数， 对比菌株在不同培养基中的生长速度和活菌数量。实验结果如附图 1 所示。 0007 由 SAS 统计分析可知， 长双歧杆菌在 NPNL 培养基中的培养 12h 进入稳定期以后活 菌数与其他培养基相比均有显著性差异， 因此选择 NPNL 为模板进行工业化培养基筛选。 0008 NPNL 培养基成分为 ： 蛋白胨 10g， 胰蛋白胨 5g， 大豆蛋白胨 3g， 酵母浸粉 10g， 葡萄糖 10g， 牛肝粉 15g。
10、， 半胱氨酸盐酸盐 0.5g， 吐温 -80 1ml， 可溶性淀粉 0.5g， 牛肉膏 3g， 溶液 A10ml， 溶液 B5ml。( 其中， A 液 ： K2HPO425g， KH2PO4 25g， 蒸馏水 250ml ； B 液 ： 说 明 书 CN 101597585 B 3 2/4 页 4 MgSO47H2O5g， FeSO47H2O 0.5g， NaCl 0.5g， MnSO4H2O 0.337g， 蒸馏水 250ml)pH7.2。 0009 2 限制 NPNL 培养基工业化应用的因素 0010 NPNL 培养基组成成分包括碳源 ( 葡萄糖 )、 氮源 ( 蛋白胨、 胰蛋白胨、 大豆。
11、蛋白胨、 酵母浸粉、 牛肝粉 )、 缓冲体系 (K2HPO4， KH2PO4)、 抗氧化剂 (L- 半胱氨酸盐酸盐 )、 微量元 素 (MgSO47H2O、 FeSO47H2O、 NaCl、 MnSO4H2O)。 0011 NPNL 培养基中不同种类的营养素所占比例差别较大， 如附图 2。氮源成本占到 全部成本的 93， 碳源占到 2.5， 抗氧化剂占 4.0， 缓冲体系、 微量元素、 乳化剂共占 0.5。由附图 2 可知， 氮源成本较高影响了 NLNL 培养基工业化应用。此外， 磷酸盐缓冲液 对菌体、 较多无机盐成分对人和动物健康的有害影响， 以及 L- 半胱氨酸盐酸盐灭菌产生的 不良风味均。
12、是限制 NPNL 培养基工业化应用的因素。 0012 3 工业化培养基选择 0013 针对 NPNL 的缺点进行工业培养基的筛选， 在不降低双歧杆菌生物发酵量的前提 下对模板 NPNL 培养基进行适当修改。 0014 3.1 氮源的确定 0015 NPNL 中氮源的成本占总成本的 90以上， 因此降低培养基成本主要是降低氮源 的成本。 0016 选用较为常见且成本较低的脱脂奶粉、 乳清蛋白、 玉米浆等氮源进行研究， 其他营 养成分及用量均按照模板 NPNL 培养基中的成分及用量进行添加。脱脂奶粉、 乳清蛋白、 玉 米浆干粉等氮源的添加量为模板 NPNL 培养基中粗蛋白质含量 (25g/L)， 。
13、测定长双歧杆菌在 各种培养基中的活菌数， 结果如附图 3 所示 ： 0017 在蛋白质含量均为 25g/L 的条件下， 长双歧杆菌在 9h 进入稳定期， 在玉米浆干粉 中的活菌数比脱脂奶粉和乳清蛋白中的活菌数有显著性差异， 和模板培养基 NPNL 没有显 著性差异， 因此选用玉米浆干粉作为氮源。 0018 在碳源、 抗氧化剂、 乳化剂等其他条件都不变的情况下， 选用不同玉米浆干粉蛋白 质含量的培养基， 1接种， 12h 进行活菌数测定， 结果如附图 4 所示。 0019 由 SAS 统计分析可知， 长双歧杆菌在蛋白质含量为 22g/L 和 25g/L 的培养基中活 菌数均比其他含量的培养基中活。
14、菌数有显著性差异， 这两者没有显著性差异， 因此在以玉 米桨干粉作为培养基氮源时， 优选培养基的蛋白质含量为 22 25g/L。 0020 可选择不同蛋白含量的玉米桨干粉作为氮源， 并根据所需的培养基蛋白含量调节 玉米桨干粉的添加量。 玉米浆干粉的蛋白含量优选为40重量， 其添加量可以为5563g/ L。 0021 3.2 缓冲体系的确定 0022 玉米浆干粉培养基中具有较多的固形物， 是一种良好的缓冲体系。设想可以取代 磷酸盐缓冲体系起到缓冲作用， 并进行验证。在 3.1 筛选的培养基基础上分别添加和不添 加磷酸盐缓冲体系， 1接种， 在 12h 达到稳定期时分别取样， 测定活菌数， 添加磷。
15、酸盐缓冲 体系的培养基活菌数对数值为 9.610.03， 不添加磷酸盐缓冲体系的培养基活菌数对数值 为 9.650.05， 经 SAS 统计分析可知两者没有显著性差异。 0023 由结果可知， 添加或者不添加磷酸盐缓冲体系对玉米浆培养基的 pH 及活菌数变 化没有显著影响， 能起到缓冲的作用。因此可以剔除模板 NPNL 培养基中磷酸盐缓冲液， 以 说 明 书 CN 101597585 B 4 3/4 页 5 避免其对菌体冻干存活率的影响。 0024 3.3 无机盐溶液的确定 0025 有研究表明， 在含有玉米浆成分的培养基中添加或者不添加外来无机盐成分对鼠 李糖乳杆菌产乳酸能力没有显著性差异，。
16、 表明玉米浆中的无机盐含量可以满足乳酸菌对矿 物盐的需求， 可以略去 NPNL 培养基中的无机盐溶液， 并进行实验验证是否对双歧杆菌的生 长有影响。在 3.2 筛选的培养基基础上分别添加和不添加 NPNL 中的无机盐溶液， 1接 种， 12h 达到稳定期是取样测定活菌数， 添加 NPNL 中无机盐溶液的培养基活菌数对数值为 9.730.03， 不添加 NPNL 中无机盐溶液的培养基活菌数为 9.600.07。 0026 经 SAS 统计分析可知两者没有显著性差异， 即玉米浆中的无机盐成分已经能够满 足双歧杆菌的生长， 因此在所选的玉米浆培养基中不必添加 NPNL 中的无机盐溶液。 0027 3。
17、.4 抗氧化剂的确定 0028 有研究表明， 抗坏血酸作为一种抗氧化剂也具有消除氧对双歧杆菌的胁迫作用且 其在膜过滤除菌和双歧杆菌培养过程中没有不良气味产生， 因此可以考虑取代 L- 半胱氨 酸盐酸盐， 选用抗坏血酸作为抗氧化剂添加到 3.3 所筛选的培养基中， 1接种， 12h 时取样 测定活菌数， 结果如附图 5 所示 ： 0029 其中， 0 表示不添加任何抗氧化剂。结果表明， 添加不同量的抗坏血酸对双歧杆菌 在玉米浆培养基中的生长没有显著性影响， 因此可以不添加任何抗氧化剂 . 究其原因可能 为， 玉米浆中含有约 0.39 ( 干物质含量 ) 的胱氨酸， 而胱氨酸可以与半胱氨酸相互转化。
18、， 在双歧杆菌发酵的过程中可以起到去除氧对菌体的化学胁迫作用。 0030 本发明以玉米桨作为双歧杆菌培养基的氮源。具有以下优势 ： 0031 玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、 氨基酸、 维生素、 无机盐等， 含大约 70同体物 质， 蛋白质含量约 40， 氨基酸含量约 20， 其营养结构很适合乳酸菌生长繁殖的需要。 0032 其来源广泛， 且经喷雾干燥制得的玉米浆干粉， 储运方便， 适应工业化大规模生产 的需要。 0033 近年玉米淀粉生产增长较快， 玉米浆的出路也成了问题， 特别是玉米淀粉厂比较 集中的产区， 很多小厂均将玉米浸泡水直接排放， 浪费资源， 且造成环境的污染。本发明开 拓了玉米浆。
19、的使用范围。 0034 其成本低廉， 显著地降低了培养基的成分， 相比 NPNL 培养基价格下降 95， 相比 MRS 培养基价格下降 80。 0035 其制作过程简单， 适合双歧杆菌的工业化规模生产。 附图说明 0036 附图 1 ： 双歧杆菌在四种双歧培养基中的生长曲线。 0037 附图 2 ： NPNL 培养基中个营养成分的成本。 0038 附图 3 ： 替换的三种氮源培养基培养双歧杆菌的结果。 0039 附图 4 ： 不同玉米浆干粉蛋白质浓度培养基培养双歧杆菌的结果。 0040 附图 5 ： 添加不同抗氧化剂的玉米浆干粉培养基中培养双歧杆菌的对比。 具体实施方式 说 明 书 CN 10。
20、1597585 B 5 4/4 页 6 0041 实施例 1 ： 0042 (1) 制备玉米浆 ： 称重玉米浆干粉后， 补足水至 55 63g/L， 纱布过滤， 备用 ； 0043 (2) 添加葡萄糖， 10 20g/L ； 吐温 -80， 0 1g/L ； 0044 (3) 调节 pH 值至 6.5 7.2 ； 0045 (4)110 121， 10 15min 灭菌备用。 0046 实施例 2 ： 0047 (1) 制备玉米浆 ： 选择经过喷雾干燥加工的精制玉米浆干粉， 称重后， 补足水至 63g/L， 调节 pH 值到 7.2， 8 层纱布过滤， 备用 ； 0048 (2) 添加葡萄糖，。
21、 10g/L ； 0049 (3) 调节 pH 值至 6.5 ； 0050 (4) 分装， 110 121， 10 15min 灭菌备用。 0051 实施例 3 ： 0052 (1) 制备玉米浆 ： 选择经过喷雾干燥加工的精制玉米浆干粉， 称重后， 补足水至 58g/L， 调节 pH 值到 7.2， 8 层纱布过滤， 备用 ； 0053 (2) 添加葡萄糖， 15g/L ； 吐温 -80， 0.5g/L ； 0054 (3) 调节 pH 值至 7.0 ； 0055 (4) 分装， 110 121， 10 15min 灭菌备用。 0056 实施例 4 ： 0057 (1) 制备玉米浆 ： 选择经过喷雾干燥加工的精制玉米浆干粉， 称重后， 补足水至 55g/L， 调节 pH 值到 7.2， 8 层纱布过滤， 备用 ； 0058 (2) 添加葡萄糖， 20g/L ； 吐温 -80， 1g/L ； 0059 (3) 调节 pH 值至 7.2 ； 0060 (4) 分装， 110 121， 10 15min 灭菌备用。 说 明 书 CN 101597585 B 6 1/2 页 7 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101597585 B 7 2/2 页 8 图 5 说 明 书 附 图 CN 101597585 B 8 。