棉籽壳栽培料常压灭菌效果指示菌的获得及利用方法.pdf

本发明公开了一种棉籽壳栽培料常压灭菌效果指示菌的获得及利用方法。属于食用菌生产的技术领域。其用于解决对食用菌栽培料的常压灭菌效果监测的生物监测手段问题。棉籽壳栽培料常压灭菌效果指示菌的获得及利用方法是将棉籽壳栽培料中的杂菌分散到处于封闭体系的细菌培养基中，按照常压灭菌程序进行不同时长的灭菌处理，较低常温下恢复培养，选择杂菌全部杀死前最后残留的菌，再经过棉籽壳栽培料上生长能力检验和常压灭菌效果指示能力检验后所获得的菌即为指示菌。这种棉籽壳栽培料常压灭菌效果指示菌的获得及利用方法可广泛地应用于食用菌的生产。

1、  一种棉籽壳栽培料常压灭菌效果指示菌的获得，其特征在于：
(1)杂菌分散细菌培养基：其配方为栽培料1～50％、蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.2％、琼脂粉1.5～2％，制作时先用部分水冷浸提栽培料中杂菌，然后与预溶的其它组分混合煮沸，即可分装成试管，试管封口，将杂菌分散到处于封闭体系的细菌培养基中；
(2)不同时长的常压蒸汽灭菌处理：处理含杂菌分散细菌培养基时间按等差时长排列，时长的最大取值长于全部杀死杂菌所需的时间；
(3)较低常温恢复培养：选用20～24℃温度培养，此温度是栽培菌类发菌阶段所处环境偏低的温度，也是细菌类杂菌生长繁殖需要偏低的温度，从而保证所选择的是与栽培菌类生长所需温度一致的菌类；
(4)最抗常压灭菌条件的残留菌拣出：在达到完全杀菌状态前最后出现的单孢菌落；
(5)棉籽壳栽培料上生长能力检验：检验残留菌在纯栽培料上的生长能力，选用的是低麸皮含量(麸皮∶棉籽壳为0～5∶100～95)的纯栽培料培养基，配方为栽培料5～50％、琼脂粉1.5～2％，制作时取栽培料煮汁，接种后20～24℃培养，从而保证所选择的是与栽培菌类生长所需营养一致的菌类；
(6)常压灭菌指示能力检验：检验残留菌指示灭菌效果的能力，是用等重量的栽培料和残留菌麸皮制剂，分别按干料、湿料、水浸料三种状态，同时进行不同时长常压灭菌处理，灌注常规细菌培养基后在较低室温下(20～24℃)培养，比较细菌恢复生长情况，从而保证所选择的是具有指示栽培料内处于各种水分状态下的杂菌被常压蒸汽杀灭效果能力的菌类；

2、  如权利要求1所述的棉籽壳栽培料常压灭菌效果指示菌的利用方法，其特征在于：
(1)直观型指示剂：含有指示菌芽孢、增色剂的灭菌固体粉状细菌培养基，分装在透明耐高温瓶内，每个指示剂单元(每瓶)含有一定数量的指示菌芽孢。
(2)灭菌固体粉状细菌培养基：常规细菌培养基，其加水凝结成块后，本身即具有或添加增色剂后而具有与菌落颜色反差大的颜色，能够直接观察出指示菌的生长情况；
(3)增色剂：一种水溶性颜料物质，添加在固体粉状细菌培养基内，加水后凝成的琼脂块与菌落颜色具有大的反差，能够直接观察出指示菌的生长情况。

3、  如权利要求1所述的棉籽壳栽培料常压灭菌效果指示菌的的获得，其特征在于：所述的试管封口采用棉花或透气胶塞塞封。

棉籽壳栽培料常压灭菌效果指示菌的获得及利用方法
技术领域
本发明涉及一种棉籽壳栽培料常压灭菌效果指示菌的获得及利用方法，其属食用菌生产技术领域。
背景技术
食用菌生产是在栽培料上繁殖特定菌类并获得子实体的过程，由于菌类无处不在，食用菌栽培原料上也一样，含有大量的杂菌，这些菌类的存在对栽培菌类具有很大影响，因此在正常菌类播种前，需要对这些菌类进行技术处理，达到的最高目标是栽培料的无菌化，最低目标是既便存有一些菌类，对正常菌类的生长也不产生大的负面影响。处理料内杂菌的方法是高压、常压蒸汽灭菌、发酵控菌和药物抑杀菌，究竟选用何种处理方法与菇类的适应性和料的种类等因素密切相关。以棉籽壳作主料栽培不同的食用菌种类为例，栽培平菇时的处理方法常选用的是药物抑杀菌；栽培双孢菇时的料处理方法常选用的是一次或二次发酵控菌；栽培金针菇、杏鲍菇、白灵菇、灵芝、猴头、黑木耳等大多数种类时的灭菌处理方法则是蒸汽灭菌，在蒸汽灭菌当中应用最广泛的又是常压蒸汽灭菌。
棉籽壳是人工代料栽培食用菌最常用的大宗原料，俗称主料，为提高栽培效果，需拌加10～30％的麸皮，少量的玉米面、豆粉，以及微量的石膏、石灰等辅料。主辅料与1～1.1(-1.7)倍重(w/w)的水混合拌匀，就形成了种植食用菌的栽培料。棉籽壳、麸皮等主辅料均含有杂菌，二者相比，麸皮的杂菌含量为高，所以，栽培料配方中麸皮比例越高，杂菌总量就越高。
对于需要应用常压蒸汽灭菌来处理栽培料的食用菌种类讲，灭菌处理的效果直接影响栽培菌类菌丝在料内的生长势和生长量，进而决定生物转化率(产量)的高低，其间的关系是食用菌在灭菌效果好的料内生长势好和生长量大，将来出菇时产量高。因此，在栽培料配方一定的前提下，达到好的灭菌效果是实现高产的根本出路。
1、食用菌常压蒸汽灭菌技术现状
(1)设施类型常压灭菌设施常见的有灭菌灶、灭菌槽、灭菌包三种样式，均为自行建造或组配的非标设施。其中，灭菌灶是蒸料仓与蒸汽发生装置(大铁锅)一体的灭菌设施，蒸汽由直接加热铁锅内的水而产生；灭菌包是蒸料仓与蒸汽发生装置分离的灭菌设施，蒸汽由蒸汽锅炉或加热水桶产生，通过管道输入到蒸料仓。
灭菌灶是在灶上安放大铁锅，然后在锅台上用水泥、砖和钢筋砌建蒸料仓而成。
灭菌槽是用水泥、砖砌成的长方形或方形蒸仓，蒸料仓的顶部或一侧开口作装出料口用。
灭菌包是在平整的地面上直接码放待灭菌的、已装填有栽培料的塑料袋，然后加盖塑料薄膜、苫布，将料袋堆临时包裹而成的蒸料仓。
(2)常压灭菌过程包括如下步骤：①往蒸料仓内摆放待灭菌的料袋；②用木板塑料布等堵严或苫严料仓口；③点火产汽升温或往蒸料仓里通蒸汽，见冒大气时开始计时，维持一段时间停止加热或供气；④自然冷却出锅，灭菌结束。
从上述常压灭菌的设施和操作来看，其灭菌效果与蒸汽量、待灭菌的料量、作用时间及物料排列疏密程度等多种因素有关，不是一个规范的工艺。由于常压蒸汽的穿透力有限，加上蒸料仓内的栽培料所处的位置不同，栽培料的干湿状态含水量不同，所以其受热的方式存在很大的不同，有的是被蒸汽直接穿透加热，但绝大部分是蒸汽加热栽培袋内的湿料，再产生的次级蒸汽用于灭菌。
2、食用菌常压蒸汽灭菌效果检验的现状
(1)灭菌料袋直接培养法该法是被推荐用来检测的方法，其是将灭菌后的料袋，放到培养箱内培养，3～7天后观察有无杂菌菌落出现。实际生产中种菇户不可能添置专门的培养箱用于灭菌检验，由于灭菌量大袋多，培养箱容积也不能满足检验需要；再者从原理上分析，这种培养方法较适合霉菌的检验，霉菌具有丝状的菌丝和大的菌落，容易观察到，而细菌在棉籽壳上不易形成肉眼可见的菌落，加上流动性差，处于料袋里层的细菌极不可能扩散到表面形成菌落；所以直接培养料袋法来进行杂菌检验不实用也不可靠，实际生产中未被采用。
(2)依靠灭菌时长来判定生产上对常压灭菌如何达标，最明确的指标是灭菌时间，且差别很大，从6小时到16小时或更多的都有，都是从各自的经验来说的，使生产者无所适从。另外，仅有灭菌时间指标，又误导了生产者，使其认为只要灭菌耗时长就能达到好的灭菌效果，而从不顾及灭菌料的多寡等因素，甚至把长的灭菌时间当成了优良灭菌效果的代名词。生产实际中，灭菌时间长的栽培料同样出现问题，所以，用灭菌时间判定灭菌效果不可靠。
(3)应用高压蒸汽灭菌监测法检验栽培料常压蒸汽灭菌效果的可能性
①高压灭菌化学指示卡检测法高压灭菌化学指示卡与特定灭菌参数紧密相关，指示的是高于100℃时某温度(普遍的是121℃和134℃)的受热温度和受热时间，食用菌栽培料常压灭菌的温度一般均低于100℃，密闭好、火力猛的情况下，短时间可高于100℃，但极少能升至103℃，所以不能用来指示食用菌栽培料的常压灭菌效果。
②高压灭菌生物指示剂监测法高压蒸汽灭菌生物指示剂是由嗜热脂肪杆菌(ATCC 7953)芽孢菌片、恢复培养基和外管组成。适用于121℃下排气式压力蒸汽灭菌器、132℃～134℃预真空或脉动真空压力蒸汽灭菌器、134℃～136℃台式或卡式压力蒸汽灭菌器灭菌效果的监测和制药工业、医院制剂生产等各行业使用的压力蒸汽灭菌器灭菌效果的监测。应用范围不包括蒸汽常压灭菌。若直接用于栽培料的常压灭菌检测，表面存在以下障碍：①操作复杂，灭菌后还需在无菌条件下将被灭的菌载体转移至液体培养基内。②菌培养条件严格，需要50～60℃恒温培养设施。③成本高，一个测试管就需要20元，首先限制了在食用菌栽培料常压灭菌监测上的应用。另一方面，在将脂肪杆菌(ATCC 7953)芽孢菌片用于栽培料常压灭菌监测的实验表明，按相同的处理方法和程序进行常压灭菌，常温培养表现为不能生长或死亡，但还有残留细菌类杂菌存在，该残留菌类在栽培料的营养条件下，在栽培菌类菌丝正常发菌阶段所处的20～35℃范围内，能正常生长，进而危害正常菌的生长。所以现有高压灭菌生物指示菌及其剂型均不适于进行食用菌栽培料的常压蒸汽灭菌效果监测。
综上所述，目前对食用菌栽培料的常压灭菌效果监测还没有可靠适用的生物监测手段，而该技术的核心是有关指示菌的获得方法及其利用技术，这些均是要进行常压灭菌效果监测需解决的技术难题。
发明内容
本发明研究出一种从棉籽壳栽培料中获得与栽培料内常压灭菌残留菌危害发生条件相一致，且能够指示常压灭菌效果的菌类的方法，再把获得的菌类制成了一种简易直观的剂型，用于判定棉籽壳栽培料常压蒸汽灭菌的效果。
为了解决上述技术的问题，本发明棉籽壳栽培料常压灭菌效果指示菌的获得，是通过以下技术方案实现的：
(1)杂菌分散细菌培养基：其配方为栽培料1～50％、蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.2％、琼脂粉1.5～2％，制作时先用部分水冷浸提栽培料中杂菌，然后与预溶的其它组分混合煮沸，即可分装成试管，试管封口，将杂菌分散到处于封闭体系的细菌培养基中；
(2)不同时长的常压蒸汽灭菌处理：处理含杂菌分散细菌培养基时间按等差时长排列，时长的最大取值长于全部杀死杂菌所需的时间；
(3)较低常温恢复培养：选用20～24℃温度培养，此温度是栽培菌类发菌阶段所处环境偏低的温度，也是细菌类杂菌生长繁殖需要偏低的温度，从而保证所选择的是与栽培菌类生长所需温度一致的菌类；
(4)最抗常压灭菌条件的残留菌拣出：在达到完全杀菌状态前最后出现的单孢菌落；
(5)棉籽壳栽培料上生长能力检验：检验残留菌在纯栽培料上的生长能力，选用的是低麸皮含量(麸皮∶棉籽壳为0～5∶100～95)的纯栽培料培养基，配方为栽培料5～50％、琼脂粉1.5～2％，制作时取栽培料煮汁，接种后20～24℃培养，从而保证所选择的是与栽培菌类生长所需营养一致的菌类；
(6)常压灭菌指示能力检验：检验残留菌指示灭菌效果的能力，是用等重量的栽培料和残留菌麸皮制剂，分别按干料、湿料、水浸料三种状态，同时进行不同时长常压灭菌处理，灌注常规细菌培养基后在较低室温下(20～24℃)培养，比较细菌恢复生长情况，从而保证所选择的是具有指示栽培料内处于各种水分状态下的杂菌被常压蒸汽杀灭效果能力的菌类；
本发明棉籽壳栽培料常压灭菌效果指示菌的利用方法，通过以下技术方案实现：
(1)直观型指示剂：含有指示菌芽孢、增色剂的灭菌固体粉状细菌培养基，分装在透明耐高温瓶内，每个指示剂单元(每瓶)含有一定数量的指示菌芽孢。
(2)灭菌固体粉状细菌培养基：常规细菌培养基，其加水凝结成块后，本身即具有或添加增色剂后而具有与菌落颜色反差大的颜色，能够直接观察出指示菌的生长情况；
(3)增色剂：一种水溶性颜料物质，添加在固体粉状细菌培养基内，加水后凝成的琼脂块与菌落颜色具有大的反差，能够直接观察出指示菌的生长情况。
本发明棉籽壳栽培料常压灭菌效果指示菌的获得，还可以通过以下技术方案实现：以上所述的试管封口采用棉花或透气胶塞塞封。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：为研发棉籽壳栽培料常压灭菌效果的生物检测技术奠定了指示菌获得及其指示菌制作方法基础。应用本方法，能使棉籽壳栽培料的灭菌效果由不易评价转变成能够被快速直观监测，促使杀菌效率获得稳定提升，进而提高生物转化率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述：
1、指示菌的获得方法
获得指示菌流程：确定高杂菌含量栽培料配方→栽培料杂菌浸提→含杂菌细菌培养基制备→常压蒸汽处理含杂菌的细菌培养基→室温(20～24℃)恢复培养→最抗常压条件残留菌(单孢)捡出→残留菌扩繁→栽培料生长能力检验→灭菌效果指示能力检验→指示菌获得。具体过程如下：
(1)确定栽培料配方  选定陈旧棉籽壳∶麸皮为7∶3的栽培料配方。
(2)栽培料预处理  按(1)所述配方确定的比例称好棉籽壳和麸皮，混合均匀，35℃烘箱内烘干，粉碎至过40目筛，高速搅拌器混合均匀。
(3)含杂菌细菌培养基制备  含杂菌细菌培养基配方为：栽培料10％、蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.2％、琼脂粉1.5％。具体制作是：
①浸提栽培料中杂菌  称取栽培料后，放入三角瓶或烧杯内，常压灭菌前1小时，加入欲制作培基所需蒸馏水总量的70％，振荡器振荡25分钟，双层纱布过滤并挤压滤渣，滤液即为杂菌悬液。
②含杂菌细菌培养基制备  用欲制作培基所需蒸馏水总量的30％预溶化琼脂后，倒入杂菌浸提液，再加入预湿或预溶的蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、磷酸氢二钾，沸腾后定容，分装试管，每试管装10毫升培养基。这样每支试管将各包含1克栽培料所含的杂菌。
(4)常压蒸汽处理含细菌培养基试管  将已装在铁丝筐内的含菌试管迅速放入常压灭菌锅内，封闭锅盖，开始计时，调大火力使温度迅速达到100℃，然后调小火力，保持住100℃，到时间后关火，迅速出锅，摆放斜面。
设定的常压灭菌最短灭菌时长为1小时，最长灭菌时长初定为14小时，时间间隔为1小时，同一个灭菌锅完成所有各时间段的灭菌处理。处理顺序为先长时间后短时间，若初定的最长时长试管培养后有细菌恢复生长，则由此往延长时长方向做起，增加的时间间隔仍为1小时，直至连续两个时长处理没有细菌恢复生长时止。
从用水浸提栽培料杂菌，到含杂菌培养基试管的制备，均应在1小时内完成，到1小时时，对含菌试管进行常压灭菌处理。
(5)残留菌的室温恢复培养  摆放试管的培养室温度应控制在20～24℃。
(6)最抗常压灭菌的残留菌(单孢)捡出  在培养阶段不断观察，会发现试管有菌恢复的比例随着灭菌时长的延长越来越小，若最后连续2个灭菌时长处理均不出现细菌恢复，表明已达到完全杀菌状态。在达到完全杀菌状态前出现的单孢菌落就是最耐常压灭菌的菌类，将该菌转接到LB细菌培养基斜面试管上，培养留存。
LB细菌斜面试管培养基配方为：蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠0.5％、琼脂粉1.5～2％、pH7.4～7.6。分装试管，121℃下灭菌50分钟，摆放斜面。
(7)残留菌在栽培料上生长能力检验  检验用培养基配方：纯棉籽壳栽培料10％、琼脂粉1.5％。制作过程是用沸水煮栽培料25分钟，双层纱布过滤，滤液溶化琼脂，分装试管，121℃高压灭菌1小时，出锅摆放斜面。
具体检验过程：将残留菌划线接种在检验用培养基上，20～24℃温度下培养。若在24～36小时内能形成明显大片菌落，表示该菌能在栽培料所提供的营养水平上，和在栽培菌类正常发菌所处环境温度(20～35℃)下生长活动，然后将其制成麸皮菌剂进入常压灭菌效果指示能力检验程序。
(8)制备残留菌麸皮菌剂
①培养斜面菌种  斜面培养基为LB细菌培养基，配方及制作同上述。划线接种步骤(7)获得的残留菌，36℃下培养48小时。
②制备残留菌麸皮菌剂  选用固体发酵法。发酵料配方中麸皮(10～60目粒度)、豆粉、磷酸氢二钾、水的配比为500∶100∶1∶440。发酵料各组分混合均匀后，121℃灭菌2小时。接入用无菌水洗脱的斜面试管残留菌菌苔，发酵料麸皮、豆粉总干重与所用液体菌种体积的比例为6∶1。36℃下培养48小时，24℃下培养48小时，35℃下干燥48小时，80℃下20分钟杀死营养体，35℃下烘干至恒重，无菌条件下研磨或粉碎开干结的麸皮块。
平板计数，平板计数用培养基为LB细菌培养基，配方及制作同上述。用无菌麸皮把残留菌麸皮菌剂的残留菌孢子数调整到10⁹cfu/克。
(9)指示常压蒸汽灭菌效果的能力检验
①常压蒸汽灭菌效果能力检验用培养基配方  为LB细菌培养基，但根据验证需要，有的制成斜面试管，有的先分装在500毫升输液瓶内，灭菌后再无菌分装在经常压灭菌处理，已经含有残留菌麸皮菌剂或栽培料的试管内。
②验证用材料及预处理  验证用材料为残留菌麸皮菌剂和栽培料，样品重以干重计均为0.23克。根据验证材料拌加水情况，分设干料、湿料和水浸料三种情形作常压灭菌处理。
干料处理  将残留菌麸皮菌剂和栽培料分装在无菌的试管内。
湿料处理  在进入100℃蒸锅前2小时用无菌水拌湿，在按折干料重0.23克量的湿料分装在无菌的试管内。栽培料拌加的水量是干重的1.25倍，麸皮菌剂拌加的水量是其干重的1倍。
水浸料处理将残留菌麸皮菌剂和栽培料在进入100℃蒸锅前0.5小时无菌分装在LB斜面试管的底部。
③指示灭菌效果能力的检验  残留菌麸皮菌剂和栽培料以干料、湿料、水浸料三种状态同时进入100℃常压灭菌程序。灭菌时长分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个小时。含有干料和湿料的试管灭菌后，无菌条件下倒入LB细菌培养基，每支管装量10毫升，摆放斜面，含有水浸料的试管灭菌后直接摆放斜面。20～24℃培养。根据残留菌麸皮菌剂和栽培料同一料处理状态的出菌情况，判定残留菌对常压灭菌效果的指示能力，标准是：当含残留菌的试管没有细菌菌落出现时，同一常压灭菌时间的栽培料试管已经且均没有细菌菌落产生。通过本实验的残留菌，表明其具有指示灭菌效果的能力，即成为所要获得的指示菌。
2、指示菌的利用方法
指示菌的利用即是把其制作成生物指示剂瓶，其制作过程是：指示菌繁殖→制作指示菌麸皮干粉菌剂→干粉菌剂的稀释→计算指示剂的配比→指示剂的混匀→分装→应用。以下为具体做法。
(1)指示菌繁殖  指示菌繁殖即培养斜面菌种，所用斜面试管培养基为LB细菌培养基，配方及制作同上述。划线接种获得的指示菌，36℃下培养48小时。
(2)制作指示菌麸皮干粉菌剂  选用固体发酵法。发酵料配方中麸皮(10～60目粒度)、豆粉、磷酸氢二钾、水的配比为500∶100∶1∶440。发酵料各组分混合均匀后，121℃灭菌2小时。接入用无菌水洗脱的斜面试管残留菌菌苔。发酵料麸皮、豆粉总干重与所用液体菌种体积的比例为6∶1。36℃下培养48小时，24℃下培养48小时，35℃下干燥48小时，80℃下20分钟杀死营养体，35℃下烘干至恒重，无菌条件下研磨开干结的麸皮块。平板计数。平板计数用培养基为LB细菌培养基。
(3)干粉菌剂的稀释  用灭菌的10～60目粒度的麸皮稀释所获得的指示菌麸皮干粉菌剂，使指示菌孢子浓度为10^9～10cfu/克。
(4)指示剂的组成和配比计算  指示剂由指示菌、灭菌粉状固体细菌培养基、增色剂组成。指示菌为孢子浓度为10^9～10cfu/克的麸皮菌剂；灭菌粉状固体细菌培养基配方为蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化钠0.5％、磷酸氢二钾0.2％、琼脂粉2％；增色剂为焦糖色。1个指示剂单元包含的指示菌量是固定的，为0.23克；所需灭菌粉状固体细菌培养基的量与分装容器大小有关，焦糖色的量则与固体细菌培养基的量有关，其为该固体细菌培养基形成琼脂平板所加水重量的0.5％。若以拟装40毫升琼脂培养基的100毫升输液瓶为分装容器，麸皮菌剂、灭菌粉状固体细菌培养基、焦糖色的比例关系为23∶168∶20。这样1个指示剂单元则含有0.23克麸皮菌剂、1.68克灭菌粉状固体细菌培养基和0.2克焦糖色。
(5)指示剂的混匀  若以拟装40毫升琼脂培养基的100毫升输液瓶为分装容器，则按23∶168∶20的比例分别称取麸皮菌剂、灭菌粉状固体细菌培养基和焦糖色，用混匀器混匀。
(6)分装  若以拟装40毫升琼脂培养基的100毫升输液瓶为分装容器，需将麸皮菌剂、固体培养基、增色剂按23∶168∶20的比例混匀，然后称取2.11克混合物倒入输液瓶内。分装后胶塞封口，干燥处存放。输液瓶具有透明、结实、廉价易得的特点。
(7)指示剂的应用
①瓶内注水  临灭菌前两个小时内，用一次性注射器分次吸取共40毫升自来水，注入指示瓶内。摇晃均匀。
②伴随灭菌  将指示瓶装入料袋内的中间位置，或者挤在料袋中间，含指示剂瓶的料袋或指示瓶应放在距蒸汽管道出口较远、位置偏低，蒸汽最不宜达到的地方，伴随栽培料袋一同灭菌。一吨栽培料(干重)建议用2～3个指示瓶。
③出锅培养  出锅后将指示瓶趁热放置在常温下温度最高、遮阴的地方培养。若出锅时瓶内培养基已经凝固，摆放时则随凝固的形状摆放，使凝固的培养基平面朝上。
④灭菌效果判定  培养1～2天后，若培养基表面出现大面积近白色不透明的菌苔，表明该批次料灭菌不达标；若培养基表面出现单个白色或近白色不透明的菌落，表明该批次料灭菌基本达标；若不出现菌落表示灭菌达标。对灭菌不达标的料，如已接种应加强通风管理，特别是降低发菌温度，防止杂菌爆发产生危害，未接种的建议重新灭菌；对基本达标的料，也应加强通风管理，降低发菌温度，防止杂菌过快恢复生长。另一方面，再灭菌时，应延长灭菌时间，降低料袋排列紧密程度，增加火力。