一种现场快速定性定量检测铜绿微囊藻的方法 【技术领域】
本发明涉及一种现场快速定性定量检测水华微藻的方法，特别涉及一种用于水华预警预报方面的全细胞荧光原位杂交技术(Whole-cell Fluorescence insitu Hybridization，FISH)检测铜绿微囊藻的方法。
背景技术
荧光原位杂交技术是细胞生物学和分子生物学技术(主要是分子杂交技术)相结合的产物，主要是选择一个已知序列中特异的DNA片段，用荧光标记后作为荧光原位杂交技术的探针与中期细胞的染色体或细胞核的DNA杂交(结合)，在染色体上显示与荧光探针同源的DNA片段的位置，从而将这个已知序列的DNA片段定位在细胞中。荧光原位杂交技术不仅准确、快速、灵敏，而且简单方便，目前已经在细胞遗传学、产前诊断及肿瘤生物学上广泛应用。
目前水华微藻的分类与识别方法主要有三种：(1)根据细胞的形态进行分类。但是，这些产生水华的微藻形态有时很难区分，并且有些形态的细微差别是由于环境条件的不同而产生的，以这些形态上的差别作为分类的标准会造成水华微藻分类上的混乱；同时，以形态上的差异作为分类的依据，分类学家之间有不同的标准，从而给分类带来一定的主观性。(2)采用分子生物学技术。如：序列测定、限制性片段长度多态性RFLP(Restricted Fragment LengthPolymorphism)、随机扩增多态性RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)等。应用这些方法均可以有效地鉴定某株藻并通过构建进化树确定该株藻的分类位置。但上述分子生物学方法都有着无法避免的缺点：操作时间长，检测样品少以及不能定性检测自然水体样品等。同时应用分子生物学方法鉴定水华微藻的前提条件是水华微藻必须经过分离纯化以及实验室单种培养。有些水华微藻难以分离，实验室单种培养更为困难，这些因素无疑限制了用分子生物学方法鉴别水华微藻。(3)将在医学领域广泛使用的免疫荧光技术应用到水华微藻检测上。应用免疫荧光技术首先要制备合适的抗体(单抗或多抗)，如果制备的抗体合适，则免疫荧光技术表现出优越性。应用免疫荧光技术不仅灵敏、简单，而且可以对水体中同种水华微藻细胞进行定量，比水华微藻的分子生物学鉴定更为优越。然而，水华微藻抗体的获得基于藻细胞的外部形态特征，藻细胞的外部形态又极易受环境的影响，并且有些水华微囊细胞有共同的胶质鞘，使得抗体与细胞的结合受到阻碍，因而其准确性受到怀疑。同时，在自然水体中某些微生物往往会和水华微藻的抗体发生非特异性免疫交叉反应，在进行自然水体水华微藻细胞定量分析时出现严重偏差。因此，用免疫荧光方法对自然水体中的水华微藻细胞进行定性和定量分析时，可信度并不高。
以上水华微藻鉴定方法具有局限性和对水华微藻鉴定的不准确性，到目前为止，在国内还未检索到水华微藻快速现场检测的报道。
【发明内容】
本发明提供一种现场快速定性定量检测铜绿微囊藻的方法，目的是解决现有的分子生物学技术检测铜绿微囊藻时需要纯化藻细胞、检测时间长的问题。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：所述试剂盒包括碱基序列如下的核酸探针：
5’-AGCCAATTTCGCCTCGCTCC-3’；
该核酸探针的5’端腺嘌呤(A)添加有异硫氰酸荧光素标记。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：采用下列试剂盒按照检测方法进行检测：
A、试剂盒
(1)核酸探针：
5’-AGCCAATTTCGCCTCGCTCC-3’；
该核酸探针的5’端腺嘌呤(A)添加有异硫氰酸荧光素标记。
(2)固定液：
所述固定液是将多聚甲醛溶于pH7.5的磷酸缓冲液得到，其中多聚甲醛的浓度是每100ml的固定液中含有4g的多聚甲醛；
(3)清洗液：1倍的SSC缓冲液(20倍的SSC缓冲液(pH7.0)稀释而成)；
(4)杂交缓冲液：每100ml杂交缓冲液由20ml20倍的SSC缓冲液(pH7.0)、40ml甲酰胺和40ml双蒸水组成；
B、检测方法
第一步：固定藻细胞
将收集地铜绿微囊藻藻细胞液体采用离心分离的方法得到铜绿微囊藻藻细胞，于冰上用所述固定液将所述铜绿微囊藻藻细胞在培养皿固定完全后，吸去固定液；
第二步：脱水
向固定于培养皿中的铜绿微囊藻藻细胞滴加乙醇溶液，然后吸去乙醇溶液使铜绿微囊藻藻细胞脱水，共进行两次，依次用体积浓度80％乙醇溶液和体积浓度90％的乙醇溶液；
第二步：杂交
向脱水后的铜绿微囊藻藻细胞滴加所述杂交缓冲液，使藻细胞适应杂交环境，然后吸去杂交缓冲液加入所述杂交缓冲液和核酸探针的混合液，于避光条件下进行杂交，所述杂交缓冲液和核酸探针的混合液中核酸探针的浓度为0.5μmol/L；
第三步：冲洗
用所述清洗液在40℃条件下洗涤，将未反应的核酸探针去除；
第四步：荧光显微镜下观察
在荧光显微镜下观察到绿色荧光时，证明有铜绿微囊藻存在。
上述技术方案中的有关内容解释如下：
1、上述方案中，所述试剂盒还包括下列试剂：
(1)固定液：
所述固定液是将多聚甲醛溶于pH7.5的磷酸缓冲液得到，其中多聚甲醛的浓度是每100ml的固定液中含有4g的多聚甲醛；
(2)清洗液：1倍的SSC缓冲液[20倍SSC母液(pH7.0)稀释而成]；
(3)杂交缓冲液：每100ml杂交缓冲液由20ml20倍SSC母液(pH7.0)、40ml甲酰胺和40ml水组成。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
1、本发明是将FISH技术改良后应用到水华微藻检测上，改良的FISH技术在定性定量检测水华微藻方面显示了无可比拟的优越性；本发明简单易行，且准确性也较高；细胞固定后不变形，这对于检测自然水体样品打下良好的基础。
2、本发明鉴定水华微藻的方法——全细胞荧光原位杂交技术不仅具有准确、快速、简单的优点，整个检测过程所需时间少于20小时，而且操作简单；更重要的是该法能进行现场检测，即可以在自然水体中进行藻细胞的定性分析，这是目前其它鉴定水华微藻的方法所不能达到的。因此本发明将会在水华微藻检测方面显示良好的应用前景。
3、本发明的全细胞杂交是一种基于细胞核基因、表面抗原和细胞壁糖类物质等来标记藻细胞，以鉴定和检测铜绿微囊藻的方法。它通常运用特异性标记的探针，如寡核酸探针、肽核酸探针、抗体或凝集素等，与整个藻细胞进行杂交，由于探针荧光素异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记，被探针标记的藻细胞可用荧光显微镜观察。与基于核酸提取的检测技术相比，全细胞杂交技术具有如下特点：1)无需核酸的提取，能保证细胞的自然形态，观察直观；2)方法简单、易行和快速，并且容易掌握，所用的检测设备简单。
【附图说明】
附图1为铜绿微囊藻(自然光条件下的照片)；
附图2为铜绿微囊藻(荧光条件下的照片)；
附图3为丝状蓝藻(自然光条件下的照片)；
附图4为丝状蓝藻(荧光条件下的照片)；
附图5为绿藻浒苔(自然光条件下的照片)；
附图6为绿藻浒苔(荧光条件下的照片)。
【具体实施方式】
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：一种现场快速定性定量检测铜绿微囊藻用试剂盒
本发明采用铜绿微囊藻核糖体大小亚基之间的转录单元间隔区ITS(Internal Transcribed Spacer)作为目的序列，在此目的片段中寻找高度特异的DNA序列作为探针。应用全细胞荧光原位杂交技术对自然水体水华微藻进行定性分析的关键是要在铜绿微囊藻的藻细胞基因组中找到合适的DNA片段作为探针。这个DNA片段必须高度变异，也就是说，不同种之间甚至同种不同地理株之间的序列表现不同。ITS序列因高度变异，可以考虑作为FISH探针。
铜绿微囊藻(自然光条件下的照片如附图1所示)是我国水华微藻的主要物种，该物种经单种分离培养后，提取该种藻细胞的总DNA。经PCR扩增得到含16S rDNA到23SrDNA之间的ITS序列。该序列在国际基因数据库(GenBank)中比对后，证实该ITS序列为该藻所特有，因此在该区域构建探针。铜绿微囊藻碱基序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还用丝状蓝藻(自然光条件下的照片如附图3所示)和绿藻浒苔(自然光条件下的照片如附图5所示)作为对照组进行实验。
本发明的试剂盒具体采用碱基序列如下的核酸探针(如SEQ ID No.1所示)：
5’-AGCCAATTTCGCCTCGCTCC-3’；
该核酸探针的5’端腺嘌呤(A)添加有异硫氰酸荧光素标记。上海生工生物工程技术服务有限公司合成并于5’端腺嘌呤(A)添加有异硫氰酸荧光素标记。
标记方法也可以采用随机引物法、缺口平移法、PCR扩增法或末端标记法。
该试剂盒中还含有
(1)固定液：
所述固定液是将多聚甲醛溶于pH7.5的磷酸缓冲液得到，其中多聚甲醛的浓度是每100ml的固定液中含有4g的多聚甲醛；
pH7.5的磷酸缓冲液(PBS缓冲液)：685mmol·L-1NaCl，14mmol·L-1KCl，40.5mmol·L-1Na2HPO4·12H2O，715mmol·L-1KH2PO4用双蒸水定容至1升，并调pH至7.5。
(2)清洗液：1倍的SSC缓冲液(20倍的SSC缓冲液50ml用灭菌的ddH2O(双蒸水)定容至1L)。
(3)杂交缓冲液：每100ml杂交缓冲液由20ml20倍SSC母液(pH7.0)、40ml甲酰胺和40ml水组成。
20倍的SSC缓冲液(20倍SSC母液，20×SSC)：氯化钠175.3g、柠檬酸钠88.2g、用ddH2O(双蒸水)定容至1L，并调pH至7.0，灭菌。
B、检测方法
第一步：固定藻细胞
将收集的铜绿微囊藻藻细胞液体5ml，采用离心分离的方法在4℃，转速6000rpm运行2min，取表面藻层得到藻细胞，于冰上用所述固定液500微升将得到的藻细胞在培养皿固定完全后，吸去固定液；
第二步：脱水
向固定于培养皿中的藻细胞依次加入500ul乙醇溶液(体积浓度80％、90％)进行脱水，冰上放置10min，放通风橱内风干；
第二步：杂交
向脱水后的藻细胞滴加所述杂交缓冲液500ul，使藻细胞适应杂交环境，然后吸去杂交缓冲液加入杂交缓冲液和所述核酸探针的混合液，所述杂交缓冲液和核酸探针的混合液中核酸探针的浓度为0.5μmol/L；沸水浴3min，取出后冰浴，40℃杂交1小时以上(或过夜)于避光条件下进行杂交。
第三步：冲洗
用所述清洗液在40℃条件下洗涤5min，吸去上清夜，重复一次，将未反应的核酸探针去除；
第四步：荧光显微镜下观察
在荧光显微镜下观察到绿色荧光(如附图1所示)，证明含有目标序列存在，从而证明有铜绿微囊藻存在。
而在对照组中，附图4为丝状蓝藻、附图6为绿藻浒苔，均没有荧光出现，因此可以证明丝状蓝藻和绿藻浒苔中不含有目标序列序列。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【序列表】
Organization Applicant
----------------------
Street：十梓街1号
City：苏州市
State：江苏省
Country：中国
PostalCode：215006
PhoneNumber：
FaxNumber：
EmailAddress：
<110>OrganizationName：苏州大学
Application Project
-------------------
<120>Title：一种现场快速定性定量检测水华微藻的方法
<130>AppFileReference：
<140>CurrentAppNumber：
<141>CurrentFilingDate：2009-06-05
<170>Patent-In版本3.5
Sequence
--------
<210>SEQ ID No.1
<213>OrganismName：铜绿微囊藻(Microcystic aeruginosa)
<400>PreSequenceString：
AGCCAATTTC GCCTCGCTCC 20
<212>Type：DNA
<211>Length：20
SequenceName：核酸探针
SequenceDescription：
Sequence
--------
<210>SEQ ID No.2
<213>OrganismName：铜绿微囊藻(Microcystic aeruginosa)
<400>PreSequenceString：
CCTTAAAGGG AGACCTAATT CAGGTATAAG ACGAAAAAAA AGTAGTCCCT ACCAAGAATC 60
AATCCCAAAA GGTCGGAACG AGGTATGAGG CTTTCAAACT AGGTTCTGGG TTCATAAAAG 120
ACCTGAATCA GGAACAAGGG CTATTAGCTC AGGTGGTTAG AGCGCACCCC TGATAAGGGT 180
GAGGTCCCTG GTTCGAGTCC AGGATGGCCC ACCTGCACAG GTGGCAAAAA CAAGAGAAGC 240
GAGGAATCAG CACCTTATCT TATATACATA TATAAGAGAG AATGCTGGCT CTGAGTACAG 300
AGTCCAGAGG AACCTTGAAA ACTGCATAGA GCTAGGTGAA AAAGCCAAAA AAGAAGACCG 360
CAAGG 365
<212>Type：DNA
<211>Length：365
SequenceName：转录单元间隔区
SequenceDescription：