茶氨酸的酶法生产 【技术领域】
本发明是关于茶氨酸的酶法生产，属于生物技术领域。
背景技术
中国历史上有很长的饮茶纪录，在世界上的很多地方饮茶的习惯是从中国传过去的。中国名茶在国际上享有很高的声誉。茶的最早发现与利用，是从药用开始的。茶在英国人是：健康之液，灵魂之饮；在我国被誉为“国饮”。现代科学大量研究证实，茶叶确实含有与人体健康密切相关的生化成份，茶叶不仅具有提神清心、清热解暑、消食化痰、去腻减肥、清心除烦、解毒醒酒、生津止渴、降火明目、止痢除湿等药理作用，还对现代疾病，如辐射病、心脑血管病、癌症等疾病，有一定的药理功效。可见，茶叶药理功效之多，作用之广，是其他饮料无可替代的。
茶叶具有药理作用的主要成份是茶多酚、咖啡碱、脂多糖等。具体作用有：1.有助于延缓衰老。2、有助于抑制心血管疾病。3、有助于预防和抗癌。4、有助于预防和治疗辐射伤害。5、有助于抑制和抵抗病毒菌。6、有助于美容护肤。7、有助于醒脑提神。8、有助于利尿解乏。9、有助于降脂助消化。10、有助于护齿明目。茶具有如此多的功效，所以茶叶提取物一直是研究者重点研究和关注的对象。
茶氨酸(L-Theanine)系统命名为：N-乙基-L谷氨酰胺，是1950年酒户弥二郎博士在研究玉露茶鲜爽滋味成分的过程中，从新梢中分离鉴定出的不参与组成蛋白质的一种氨基酸，为茶叶的特征氨基酸。它在绿茶中占游离氨基酸的40％～60％，是茶叶中含量最多的氨基酸，在高级绿茶、新茶中含量丰富，占干茶含量的1％～2％左右。
虽然我国在茶叶的生产与消费上居于世界前列，但对茶氨酸的研究相对滞后。日本在这方面的研究起步较早且贡献突出。茶氨酸之所以能在食品中得到广泛应用，其原因主要是由于茶氨酸具有良好的安全性、稳定性以及茶氨酸生产技术的改进。目前，茶氨酸的制备方法主要是通过化学合成、细胞组培、微生物发酵，以及单纯地从茶叶或其富集液中提取茶氨酸的方法。
利用低档绿茶提取茶叶中的儿茶素，其废弃物用于生产茶氨酸是当前直接提取分离茶氨酸的主要方法.目前层析技术富集茶氨酸已经完全取代传统的试剂沉淀法.离子交换吸附法富集茶氨酸是利用茶氨酸在酸性条件下能与酸性阳离子交换树脂交换吸附这一基本特性进行分离纯化.
目前茶氨酸的化学合成法主要是谷氨酸-乙胺合成法：将谷氨酸在室温下脱水转化为环状内酰胺结构，然后控制一定条件，使乙胺与转化成环状结构的谷氨酸结合形成茶氨酸。采用化学合成手段制备茶氨酸具有价格低、成本低、适合于工业化的特点。但是化学合成制造的都是DL-型消旋体，需要进行拆分才能得到L-型产品。
近年来，随着生物技术的发展和应用，利用微生物发酵来生产酶，进而利用酶的提取物来进行目的物的生产越来越被广泛地应用。与化学合成法相比，生产茶氨酸的微生物发酵法具有完全不同的特色。由于酶促反应所具有的高度专一性，能将反应底物快速的转化为所需要的产品，并且转化率高，副产物少，对环境的污染也小，是一种值得推广和研究的方法。
【发明内容】
本发明的目的之一是提供了一种茶氨酸的酶法生产方法。
本发明的目的之二是从筛选得到了一种高产氨基酰化酶的霉菌，即刺孢小克银汉霉菌。该细菌所产的氨基酰化酶可广泛的用于去乙酰化反应之中。
本发明的技术解决方案如下：
1.刺孢小克银汉霉菌菌株的筛选培养
将采自于土壤中的样品自然风干后，用研钵碾碎，按照梯度稀释法和涂布平板法进行分离操作。涂布好的平板置于培养箱中培养，待菌落长出后，用紫外分析仪进行观察，分析鉴定出刺孢小克银汉菌。
挑取该菌落接至新鲜固体平板，将平板上地菌株用无菌水洗脱，接至培养液中振摇培养。取稀释至10ml的上述种子液分为2ml装入小试管，在黑暗条件下进行紫外线照射处理，28℃-30℃倒置培养1-3天至有单菌落出现。挑取长势较好的单菌落反复进行摇瓶发酵复筛。经过发酵复筛，我们将得到的产酶量高的菌株转接到试管斜面培养基，于28℃恒温培养箱中培养28h-36h至试管斜面长满菌丝。然后再将其制成孢子悬浮液摇床培养，收集得到的菌丝球。
2.DL-茶氨酸的乙酰化
在碱性溶液中加入DL-茶氨酸，搅拌溶解，滴加乙酐，同时加碱控制溶液的PH为弱碱性，反应时用冰浴控制温度，用茚三酮显色反应控制反应终点。然后调节PH为强酸性，减压、脱盐，再加入丙酮析出N-乙酰-DL-茶氨酸。
3.酶法拆分DL-茶氨酸及拆分产物的分离纯化
配制N-乙酰-DL-茶氨酸溶液，调节PH值为中性，加入湿菌体放置恒温振荡器中进行转化。过滤，调节PH，脱色。将JK008的阳离子交换树脂柱处理成碱性然后用蒸馏水洗柱为中性，料液上柱，收集L-茶氨酸的流出液，调节PH为酸性，浓缩结晶，得到L-茶氨酸。未转化的N-乙酰-DL-茶氨酸用蒸馏水洗脱下来，经处理后继续进行拆分。
本发明以化工合成的原料DL-茶氨酸为原料，经过乙酰化后，利用从土壤中筛选到的刺孢小克银汉霉菌经过紫外线诱变得到的高产氨基酰化酶菌株立体专一性地去乙酰化，从而拆分DL-氨酸制备L-茶氨酸。与其它方法相比，该方法具有生产成本低、反应条件温和、光学纯度较高、生产工艺简单、成本低廉等优点，极易于操作，具有良好的工业应用前景。