一种微生物的固定化方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN200910251725.7

申请日:

2009.12.31

公开号:

CN101748111A

公开日:

2010.06.23

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 11/02申请日:20091231|||公开

IPC分类号:

C12N11/02

主分类号:

C12N11/02

申请人:

安徽工程科技学院

发明人:

蔡昌凤; 孙菲

地址:

241000 安徽省芜湖市鸠江区赭山东路8号

优先权:

专利代理机构:

芜湖安汇知识产权代理有限公司 34107

代理人:

徐晖

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内容摘要

本发明公开了一种微生物的固定方法,包括以下工序:(1)准备工序;(2)固体发酵;(3)中止发酵:采用天然干燥、或60烘箱鼓风干燥至恒重;(4)保存。本发明与现有技术相比,使用廉价、无污染、可生物降解的天然有机材料稻谷壳、豆皮作为载体,采用固体发酵制备固定化产品。材料廉价易得、制作与保存方法简单、微生物固定化效果显著、菌种投放方便、有效缩短工程操作中固定化产品启动周期,对快速启动和恢复生化处理系统、解决事故性污水排放的不良影响有积极意义。

权利要求书

1.  一种微生物的固定方法,包括以下工序:
(1)准备工序:将相应菌种的扩大培养基调节pH值后,与粒度大于80目的黄豆皮或稻谷壳进行混合,放入高压蒸汽锅中于115℃,灭菌30分钟,形成湿基;
(2)固体发酵:接种液态培养处于对数生长期的相应的菌株原菌液,接种量为湿基重量的2%;含水率控制在75-85%,进行发酵;
(3)中止发酵:采用干燥脱除外水中止发酵,采用天然干燥、或鼓风干燥至恒重;
(4)保存:储存在阴凉、干燥、通风、避光处、避免和有毒物品一起储运。

2.
  根据权利要求1所述的一种微生物的固定方法,其特征在于:将黄豆皮或稻谷壳用80目筛子过筛,收取筛上产品为微生物固体发酵固定化载体,筛上产品中小于80目的细粒物含量<1.5%(重量)。

3.
  根据权利要求1所述的一种微生物的固定方法,其特征在于:(1)准备工序中,用目的污水配置培养基。

4.
  根据权利要求1所述的一种微生物的固定方法,其特征在于:(1)准备工序中,黄豆皮或稻谷壳与扩大培养基的重量体积比(g/m1)为1∶5-8。

5.
  根据权利要求1所述的一种微生物的固定方法,其特征在于:用0.1mol/LNaOH调节pH值,包括按菌株液态培养确定的最佳pH值调节扩大培养基初始pH值、及发酵过程监测pH值后的调整。

6.
  根据权利要求1所述的一种微生物的固定方法,其特征在于:在(2)固体发酵过程中,好氧微生物采用通风、兼性微生物采用间歇翻料,保证微生物的需氧量。

7.
  根据权利要求1所述的一种微生物的固定方法,其特征在于:所用的菌种为好氧的硝化菌和兼性的反硝化菌。

8.
  根据权利要求1所述的一种微生物的固定方法,其特征在于:在(3)中止发酵过程中,干燥温度小于60℃。

说明书

一种微生物的固定化方法
技术领域
本发明涉及微生物的固定化,具体地说是采用可生物降解的天然有机材料为载体,采用固体发酵法进行微生物固定化产品的制备。
背景技术
微生物被固定化后具有密度高、反应速度快、耐毒害能力强、产物分离容易、能实现连续操作、可以大大提高生产能力等优势,因此近年来在医药、化工和环保等领域得到广泛地应用。
现有的微生物固定化技术按制备方法总体上可分为吸附法、包埋法、共价结合法和交联法四大类。吸附法多将基材如陶粒、活性炭,多孔玻璃、硅藻土、高岭土、沸石、高分子有机填料等投加到反应器中,微生物吸附生长形成生物膜,工程操作中挂膜启动周期长(1-2个月),所固定的微生物数量受所用的载体的数量及其表面积的限制,反应稳定性和反复使用性差,结合强度低,细胞容易脱落。共价结合法、交联固定化、包埋固定化方法处理效果相对稳定,细胞不易流失,但是交联剂大多比较昂贵,制作方法复杂。已有的微生物固定化技术为实验室液态制备方法,不利于大规模的应用推广。
传统活性污泥生物处理污水系统运行过程中,菌株易流失,不易固定,耐冲击性差,恢复慢,一次事故性污水排放有可能造成系统20多天不能正常运行。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单的处理工业污水微生物的固定方法。
本发明解决技术问题的技术方案为:一种微生物的固定方法,包括以下工序:
(1)准备工序:将相应菌种的扩大培养基,调节pH值后,与粒度大于80目的黄豆皮或稻谷壳进行混合,放入高压蒸汽锅中于115℃,灭菌30分钟,形成湿基。
菌种的扩大培养基需根据菌种对所处理工业污水中有毒污染物的耐受浓度添加目的污水,保持固定化微生物对所处理工业污水中有毒污染物的耐受性。
检查筛分筛上产品细粒物含量应<1.5%。因筛下产品多为豆粉与米粉,含量过高,使固定化产品的营养物质过多,保存期易生虫;并且固定化产品投加到污水处理系统,易使出水COD值短期升高。
(2)固体发酵:接种液态培养处于对数生长期的相应的菌株原菌液,接种量为湿基重量的2%;含水率控制在75-85%,进行发酵。
固体发酵主要控制参数:
1、pH:按菌株液态培养确定的最佳pH值,用0.1mol/LNaOH调节pH值;包括调节扩大培养基初始pH值,及发酵过程实测pH值后的调整。
2、需氧量:好氧微生物采用通风曝气:厚度h=3~5cm湿基的通风速率保证在5~7cm/s范围内。兼性微生物采用间歇翻料保证微生物的需氧量。
3、培养时间:由于豆皮和稻谷壳上面含有丰富的营养物质,利于细菌的生长繁殖,接种后生长迅速,能明显的观察到微生物的附着生长。曝气5天后Ag(稻谷壳好氧菌固定化产品)中产生明显的菌胶团,Ad(豆皮好氧菌固定化产品)上面也附着一层明显的生物膜。兼性厌氧菌固定化产品Fg(稻谷壳兼性厌氧菌固定化产品)和Fd(豆皮兼性厌氧菌固定化产品)虽没有好氧菌菌量增值明显,但是稻谷壳和豆皮显现菌落的颜色。
(3)中止发酵:采用干燥脱除外水中止发酵,利用天然干燥、或鼓风干燥至恒重;
固定化产品因产品含水率很高(稻谷壳含水率为68%,豆皮含水率为73%)、营养物质丰富,不脱水,存放期易继续发酵;
由于豆皮固定化产品成团,持水量高,以60℃烘箱干燥后保存为佳;稻谷壳固定化产品松散,持水量低,天然干燥与烘箱干燥均可。
4.保存:储存在阴凉、干燥、通风、避光处,避免和有毒物品一起储运。
5.本固体发酵固定化方法适用的菌种包括好氧的硝化菌和兼性的反硝化菌及其它由活性污泥接种筛选培养的菌液。
本发明具有以下的特点:
1.以天然有机材料黄豆皮与稻谷壳为固定化载体,材料为粮食加工副产品廉价易得;黄豆皮与稻谷壳含有粗纤维及淀粉、蛋白质、和微量元素,营养丰富,与微生物有很好的生物相容性,易于微生物的附着生长;稻谷壳密度适中,耐浸泡、不易降解或流失;黄豆皮比稻谷壳易降解、比重轻,好氧曝气均匀。
2.本次发明的微生物固定化产品制备方法简单可行,易于操作,产量可控,易于放大,能实现规模化生产,适合于微生物细胞的高密度、规模化培养。
3.本次发明的固定化产品制备条件温和,能高效固定微生物,适合好氧菌和兼性厌氧菌多种微生物的固定化培养;用目的污水配置培养基,保持固定化微生物对处理污水中有毒污染物的耐受性。
4.固定化产品保存对环境要求宽松,常温下室内保存三个月微生物的活性下降小于12%。可作为高效菌株“微生物种子”的推广、新建系统快速启动、某些难降解有毒有害工业污水(如焦化废水)事故排放造成的生化处理系统失活后快速恢复的有效技术。
5.使用方便,产品可生物降解,避免二次污染,对于焦化废水、化工废水等生物可利用碳源不足的生化处理系统,可作为外加营养物质,以降低工艺成本。
本发明与现有技术相比,使用廉价、无污染、可生物降解的天然有机材料稻谷壳、豆皮作为载体制备固定化产品。材料廉价易得、制作与保存方法简单、微生物固定化效果显著、菌种投放方便、有效缩短工程操作中固定化产品启动周期,对快速启动和恢复生化处理系统、解决事故性污水排放的不良影响有积极意义。
附图说明
图1未进行微生物固定化的原始稻谷壳电镜扫描图(×1000倍)。图2未进
行微生物固定化的原始豆皮电镜扫描图(×1000倍)
图3实施例1好氧硝化菌稻谷壳固定化产品(Ag)电镜扫描图(×5000倍)。
图4实施例2好氧硝化菌豆皮固定化产品(Ad)电镜扫描图(×5000倍)。
图5实施例3兼性反硝化菌稻谷壳固定化产品(Fg)电镜扫描图(×5000倍)。
图6实施例4兼性反硝化菌豆皮固定化产品(Fd)电镜扫描图(×2000倍)。
图7保存时间对硝化菌固定化产品的NH4+-N去除率的影响
图8保存时间对反硝化菌固定化产品的NO3--N去除率的影响。
图9缺氧池出水NO3--N降解效果图。
图10缺氧池出水NO2--N降解效果图。
图11Ad和Ag的NH4+-N降解效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的说明。
实施例1:
好氧硝化菌的固体发酵固定化(稻谷壳)
1.培养基与载体:
硝化菌培养基:白糖14.1g.L-1,NH4Cl 1.34g.L-1,KH2PO40.7g.L-1,MgSO40.5g.L-1,CaCl2·2H2O 0.5g.L-1,添加10%的焦化废水,培养基苯酚浓度为86mg/L,氰化物为16mg/L,用0.1mol/L氢氧化钠调节pH到8.0。
有机载体:用80目的筛子粗略的筛去稻谷壳的粉末状营养物质,收取筛上产品为微生物固体发酵固定化载体,筛上产品中小于80目的细粒物含量<1.5%(重量)。
固体发酵湿基:稻谷壳与扩大培养基的重量体积比(g/ml)为1∶8,放入高压蒸汽锅115℃,灭菌30分钟。
2.菌种来源:从焦化厂A2/O污水处理工艺二沉池活性污泥中以焦化废水配制的牛肉膏蛋白胨固体培养基(DM100)分离纯化出硝化细菌,并通过梯度添加焦化废水的平板驯化和液体驯化,在DO>2mg/L的条件下复筛出具有抗逆性的优势硝化细菌。
菌种的筛选方法可参见《安徽工程学院学报,2009.6》。
3.好氧硝化菌的固体发酵条件:接种量为湿基重的2%(混合菌液浓度2.5~3.8×107个/mL);含水率控制在85%以下;最适固体发酵温度为30℃(水浴锅恒温),曝气机曝气培养,每平方米通风量为180m3/h;初始pH=8.0,硝化菌为产酸细菌,进入对数生长期后pH值变化速度很快,每2h检测一次pH,补加0.1mol/LNaOH调节pH控制在7.5-8.5;培养时间t:5-6天。
4.干燥中止发酵:稻谷壳固定化产品水分低松散,天然干燥或烘箱干燥脱除外水。生成硝化菌稻谷壳固定化产品Ag(图3)。
5.保存:常温常压下保存。
实施例2:
好氧硝化菌的固体发酵固定化(黄豆皮)
1.培养基与载体:
硝化菌培养基:白糖14.1g.L-1,NH4Cl 1.34g.L-1,KH2PO40.7g.L-1,MgSO40.5g.L-1,CaCl2·2H2O 0.5g.L-1,添加10%的焦化废水,培养基苯酚浓度为86mg/L,氰化物为16mg/L,用0.1mol/L NaOH氢氧化钠调节pH到8.0。
有机载体:用80目的筛子粗略的筛去黄豆皮的粉末状营养物质后备用,收取筛上产品为微生物固体发酵固定化载体,筛上产品中小于80目的细粒物含量<1.5%(重量)。
固体发酵湿基黄豆皮与扩大培养基的重量体积比(g/ml)为1∶6,放入高压蒸汽锅115℃,灭菌30分钟。
2.菌种来源:从焦化厂A2/O污水处理工艺二沉池活性污泥中以焦化废水配制的牛肉膏蛋白胨固体培养基(DM100)分离纯化出硝化细菌,并通过梯度添加焦化废水的平板驯化和液体驯化,在DO>2mg/L的条件下复筛出具有抗逆性的优势硝化细菌。
菌种的筛选方法可参见《安徽工程学院学报,2009.6》。
3.好氧硝化菌的固体发酵条件:接种量为湿基重的2%(混合菌液浓度2.5~3.8×107个/mL);含水率控制在75%以下;最适固体发酵温度为30℃(水浴锅恒温),曝气机曝气培养,每平方米通风量为240m3/h;初始pH=8.0,硝化菌为产酸细菌,一天后进入对数生长期pH值变化速度很快,每2h检测一次pH,补加0.1mol/LNaOH调节pH控制在7.5-8.5;培养时间t:5-6天。
4.干燥中止发酵:黄豆皮固定化产品水分高易成团,使用恒温鼓风干燥箱,60℃干燥8小时,干燥时隔1小时固定化产品恒重,视为外水已脱除,硝化菌豆皮固定化产品Ad(图4)。
5.保存:常温常压下保存。
实施例3:
兼性反硝化菌的固体发酵固定化(稻谷壳)
1.培养基与载体:
反硝化菌培养基:白糖13.2g.L-1,KNO32g.L-1,K2HPO40.5g.L-1,MgSO4·7H2O0.2g.L-1,FeSO4·7H2O 0.05g.L-1,CaCl2 0.02g.L-1,添加10%的焦化废水,培养基苯酚浓度为86mg/L,氰化物为16mg/L,调节pH至7.5-8.0。
有机载体:用80目的筛子粗略的筛去稻谷壳中粉末状营养物质,收取筛上产品为微生物固体发酵固定化载体,筛上产品中小于80目的细粒物含量<1.5%(重量)。
固体发酵湿基中稻谷壳与扩大培养基的重量体积比(g/ml)为1∶7,放入高压蒸汽锅115℃,灭菌30分钟。
2.菌种来源:从焦化厂A2/O(厌氧-缺氧-好氧)污水处理工艺的缺氧池活性污泥中,采用焦化废水配制的牛肉膏蛋白胨固体培养基(DM100)分离纯化出反硝化细菌,并通过梯度添加焦化废水的平板驯化和液体驯化,在有氧的条件下复筛出的具有抗逆性的优势兼性反硝化细菌。
反硝化细菌基础分离培养基(DM100):牛肉膏10g/L,蛋白胨10g/L,NaCl5g/L,琼脂15~20g/L,以焦化废水代替蒸馏水,调节pH到7.4-7.6,121℃灭菌20分钟。
3.固体发酵条件:接种量为湿基重的2%(混合菌液浓度2~3×107个/mL);含水率控制在85%以下;最适固体发酵温度为35℃(水浴锅恒温),每天搅拌翻动一至二次,pH=7.5-8.0,培养时间t:5-6天。
4.干燥中止发酵:因发酵后稻谷壳含水率为68.4%,使用恒温鼓风干燥箱,60℃干燥8小时,干燥时隔1小时固定化产品恒重或失重小于0.1%,视为外水已脱除,停止干燥,生成反硝化菌稻谷壳固定化产品Fg(图5)。
5.保存:常温常压下保存。
实施例4:
兼性反硝化菌的固体发酵固定化(黄豆皮)
1.培养基与载体:
反硝化菌培养基:白糖13.2g.L-1,KNO32g.L-1,K2HPO40.5g.L-1,MgSO4·7H2O0.2g.L-1,FeSO4·7H2O 0.05g.L-1,CaCl20.02g.L-1,添加10%的焦化废水,培养基苯酚浓度为86mg/L,氰化物为16mg/L,调节pH至7.5-8.0。
有机载体:用80目的筛子粗略的筛去黄豆皮中粉末状营养物质,收取筛上产品为微生物固体发酵固定化载体,筛上产品中小于80目的细粒物含量<1.5%(重量)。
固体发酵湿基中黄豆皮与扩大培养基的重量体积比(g/ml)为1∶6,放入高压蒸汽锅115℃,灭菌30分钟。
2.菌种来源:从焦化厂A2/O(厌氧-缺氧-好氧)污水处理工艺的缺氧池活性污泥中,采用焦化废水配制的牛肉膏蛋白胨固体培养基(DM100)分离纯化出反硝化细菌,并通过梯度添加焦化废水的平板驯化和液体驯化,在有氧的条件下复筛出具有抗逆性的优势兼性反硝化细菌。
反硝化细菌基础分离培养基(DM100):牛肉膏10g/L,蛋白胨10g/L,NaCl5g/L,琼脂15~20g/L,以焦化废水代替蒸馏水,调节pH到7.4-7.6,121℃灭菌20分钟。
3.固体发酵条件:接种量为湿基重的2%(混合菌液浓度2~3×107个/mL);含水率控制在75%;最适固体发酵温度为35℃(水浴锅恒温),每天搅拌翻动一至二次,pH=7.5-8.0,培养时间t:5-6天。
4.干燥中止发酵:黄豆皮固定化产品水分高易成团,使用恒温鼓风干燥箱,60℃干燥8小时,干燥时隔1小时固定化产品恒重,视为外水已脱除,生成反硝化菌豆皮固定化产品Fd(图6)。
5.保存:常温常压下保存。
实施例5:
Ad和Ag稳定性试验:
称取干燥后保存时间为一周、一个月、一个半月、三个月的固定化产品Ad和Ag 5g,加入150mL培养液,NH4+-N初始浓度390mg/L,160r/min恒温摇床培养,30℃培养24h后,测定其NH4+-N的去除率;NH4+-N检测采用纳氏试剂比色法。
保存时间对硝化菌固定化产品的NH4+-N去除率的影响结果如图7所示:常温常压下保存三个月后菌种硝化能力稳定。随着保存时间的延长,硝化菌稻谷壳固定化产品Ag的反硝化能力几乎不变,保存三个月后Ag的硝化能力仅下降了2.67%;硝化菌豆皮固定化产品Ad的硝化能力下降了11.02%。
实施例6:
Fd和Fg稳定性试验:
称取干燥后保存时间为一周、一个月、一个半月、三个月的固定化产品Fd和Fg5g,加入150mL培养液,NO3--N初始浓度300mg/L,35℃培养24h后,测定其NO3--N的去除率。NO3--N检测采用酚二磺酸分光光度法。
保存时间对反硝化菌固定化产品的NO3--N去除率的影响结果如图8所示:随着保存时间的延长,反硝化菌稻谷壳固定化产品Fg的反硝化能力几乎不变,保存三个月后Fg的反硝化能力仅下降了1.63%;反硝化菌豆皮固定化产品Fd的反硝化能力下降了12.52%。
实施例7:
固定化产品处理焦化废水的效果:
将制备的固定化产品和湿菌体投加到实验室A2/O废水处理系统平行试验,考察产品处理焦化废水的效果。焦化废水:取自某焦化废水生化处理站经过气浮除油除渣的焦化废水,其COD为4829.3mg/L,NH4+-N为156.47mg/L,NO3--N为7.87mg/L,苯酚为862mg/L,氰化物为157mg/L,pH在9.0左右。初始菌量:湿菌体为固定化产品的10倍,系统运行参数见表1所示。
表1 A2/O废水处理系统运行参数

Fd和Fg的NO3--N和NO2--N降解效果:
如图9、10所示,系统缺氧池中几乎没有NO3--N和NO2--N的积累,Fg和Fd反硝化能力显著,说明兼性厌氧菌的固体发酵固定化效果好。同时由于稻谷壳、豆皮固定化产品自身营养物质的消耗,体积是下降状态,系统无需排泥,同时节省了某些异养菌外加营养物质的投加。
Ad和Ag的NH4+-N降解效果:
由图11可知,湿菌体的硝化能力明显低于Ad和Ag,湿菌体初始菌量为固定化产品的10倍,其NH4+-N的降解效率最高仅为38%,Ad和Ag NH4+-N的降解效率分别可达到75.46%和62.55%。分析认为好养硝化菌的固体发酵固定化产品脱氮效果显著,可改善传统活性污泥生物处理污水系统运行过程中菌株易流失,耐冲击性差,系统恢复慢等问题;同时固体发酵固定化产品具有微生物活性高、保存条件对环境要求宽松、使用方便,产品可生物降解,避免二次污染等优点,可作为高效菌株“微生物种子”的推广、新建系统快速启动的有效技术。
Ag、Ad对苯酚、氰化物污染物降解情况
如表2所示:Ag、Ad产品对苯酚和氰化物处理效果明显,第四个HRT(水力停留时间)好氧池出水中的氰化物浓度达到国家二级排放标准(≤1mg/L);Ad和Ag对苯酚的降解率分别为79.58%和99.13%。说明稻谷壳、豆皮固体发酵固定化产品对苯酚和氰化物具有很好的耐受性和处理效果,可解决含苯酚和氰化物等难降解有毒有害污染物的污水(如焦化废水)事故排放造成的生化处理系统失活后系统快速恢复的问题。
表2 A2/O废水处理系统对苯酚和氰化物处理效果

  污染物名称  原水  Ag出水  Ad出水  湿菌体出水  苯酚(mg/L)  862  7.5  176  9  氰化物(mg/L)  157  1  0.2  0.4

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本发明公开了一种微生物的固定方法,包括以下工序:(1)准备工序;(2)固体发酵;(3)中止发酵:采用天然干燥、或60烘箱鼓风干燥至恒重;(4)保存。本发明与现有技术相比,使用廉价、无污染、可生物降解的天然有机材料稻谷壳、豆皮作为载体,采用固体发酵制备固定化产品。材料廉价易得、制作与保存方法简单、微生物固定化效果显著、菌种投放方便、有效缩短工程操作中固定化产品启动周期,对快速启动和恢复生化处理系统、。

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