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1、10申请公布号CN104151140A43申请公布日20141119CN104151140A21申请号201410330343422申请日20140711C07C33/02200601C07D401/04200601C07C69/732200601C07C29/76200601C07C67/48200601C07H1/08200601C07K1/3020060171申请人武汉工程大学地址430074湖北省武汉市洪山区雄楚大街693号72发明人刘治田张旗郑乐驰74专利代理机构湖北武汉永嘉专利代理有限公司42102代理人崔友明54发明名称一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法57摘要本发明公开了一。
2、种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，该方法通过对烟叶进行两次超声循环提取，分别得到含茄尼醇、烟碱、绿原酸的粗膏和含蛋白质、糖的提取液，并结合液液两相萃取、柱层析、重结晶、水蒸气蒸馏和沉淀等分离或纯化手段，将烟叶中五种有效成分茄尼醇、烟碱、绿原酸、蛋白质和糖逐一分离出来。本方法实现了烟叶中多种有效成分的连续提取与分离，大大提高了烟叶原料的利用率，具有提取效率高，分离产物多，废弃物排放少的优点，是一种高效且环境友好型的烟叶多成分综合提取技术。51INTCL权利要求书2页说明书7页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页附图1页10申请公布号CN104151。
3、140ACN104151140A1/2页21一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，包括以下步骤1乙醇溶液超声循环提取茄尼醇、烟碱和绿原酸将烟叶进行烘干粉碎后，得烟叶碎片，并置于循环式超声提取器中，加入乙醇溶液，进行超声循环提取，过滤得乙醇提取液和烟叶滤渣，将乙醇提取液进行浓缩，得含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏；2碱性水溶液超声循环提取蛋白质和糖将步骤1得到的烟叶滤渣置于循环式超声提取器中，加入碱性水溶液，进行超声循环提取，过滤得含蛋白质和糖的提取液；3茄尼醇、烟碱和绿原酸的分离向含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏中加入石油醚和酸性水溶液，进行液液两相萃取，取上层石油醚层进行浓缩得茄尼醇粗。
4、膏，再进行柱层析分离、重结晶得茄尼醇；下层水相用乙酸乙酯萃取后，取上层乙酸乙酯层进行浓缩得绿原酸粗膏，再配成绿原酸水溶液通过柱层析分离得绿原酸；将经乙酸乙酯萃取所得的下层水相进行浓缩，加入碱调节PH值，然后进行水蒸气蒸馏，用装有酸性水溶液的收集瓶收集馏分，得烟碱盐水溶液，将烟碱盐水溶液进行浓缩，加入碱调节PH值，然后用二氯甲烷进行萃取，取二氯甲烷层进行浓缩得烟碱；4蛋白质和糖的分离将步骤2中所得的含蛋白质和糖的提取液进行浓缩，加入蛋白质沉淀剂，静置后，离心分离上层清液和蛋白质沉淀，蛋白质沉淀用无水乙醇洗涤后，进行低温真空干燥，得所述蛋白质；上层清液加入乙醇进行醇沉，静置后进行过滤，得糖滤饼，将。
5、糖滤饼用无水乙醇洗涤后，进行低温真空干燥，得所述糖。2根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，所述步骤1中烟叶经烘干粉碎后所得烟叶碎片的尺寸为20目；所述乙醇溶液为乙醇体积分数为8095的酸性乙醇水溶液，PH值为34，PH值通过磷酸或柠檬酸进行调节。3根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，所述步骤1的乙醇溶液超声循环提取过程中，超声波功率为100300W，超声提取温度为5060，提取时间为3060MIN；烟叶碎片与乙醇溶液的料液比为1520，料液比单位为G/ML。4根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特。
6、征在于，所述步骤2的碱性水溶液超声循环提取过程中，超声波功率为100300W，超声提取温度为5060，提取时间为3060MIN；所述碱性水溶液为NAOH或KOH的碱性水溶液，PH值为78；烟叶滤渣与碱性水溶液的料液比为11020，料液比单位为G/ML。5根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，所述茄尼醇的分离步骤中，步骤3中液液两相萃取所用酸性水溶液为磷酸水溶液，PH值为23，石油醚与酸性水溶液的体积比为23，萃取次数为23次；茄尼醇的柱层析分离所用吸附材料为100200目的硅胶，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶剂，石油醚与乙酸乙酯的体积比为91；所述茄尼醇的重结。
7、晶溶剂为乙醇，重结晶温度为15。6根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，所述绿原酸的分离步骤中，柱层析分离采用聚酰胺柱作为层析分离柱，聚酰胺柱尺寸为80100目，绿原酸水溶液的上样浓度为9MG/ML，上样量为5倍柱体积，上样流速为每小时4倍柱体积，洗脱剂为体积分数为30的乙醇水溶液，洗脱流速为每小时4倍柱体积。7根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，所述烟碱的分离步骤包括将步骤3中经乙酸乙酯萃取后的下层水相进行浓缩至初始体权利要求书CN104151140A2/2页3积的1/3，然后加入NAOH或KOH调节PH值至1113；进行。
8、水蒸气蒸馏烟碱时用柠檬酸溶液吸收烟碱馏出液，并控制接收液PH小于3，当溜出液用质量分数为1的硅钨酸检测无沉淀物产生时停止蒸馏，然后将烟碱盐水溶液浓缩到原体积的1/31/2，加NAOH或KOH调节PH值至1113，用二氯甲烷萃取12次，蒸发除去二氯甲烷即得烟碱。8根据权利要求1所述的一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，其特征在于，所述步骤4中所得的含蛋白质和糖的提取液浓缩至初始体积的1/81/3；所述蛋白质沉淀剂为羧甲基壳聚糖，分子量为50000100000，用量为001005WT；沉淀温度为4，时间为25H；所得蛋白质沉淀用无水乙醇洗涤23次；所得上层清液加入乙醇量为滤液体积的34倍；醇沉。
9、静置时间为12H，温度为420；所得糖滤饼用无水乙醇洗涤23次。权利要求书CN104151140A1/7页4一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法技术领域0001本发明属于烟叶深加工技术领域，具体涉及一种从烟叶中逐步提取并分离有效成分茄尼醇、烟碱、绿原酸、蛋白质和糖的方法。背景技术0002烟叶中含有多种具有药用或食用价值的有效成分，如茄尼醇、烟碱、绿原酸、蛋白质和糖类等。茄尼醇是一种高附加值的药用成分，具有抗菌、消炎和止血等药理作用，同时也是合成维生素K2和辅酶Q10的必要原料。烟碱是烟叶中一种生物碱，应用非常广泛，其用途主要包括农药和医药两大方面。烟碱系列农药属植物杀虫剂，具有蒸薰、胃毒、触。
10、杀功能和迅速降解无残留的特点，是理想的高效绿色杀虫剂和生物性农药。同时，高纯度烟碱是医药工业上研制治疗心血管、皮肤、蛇虫咬伤等疾患药物的特种原料。绿原酸是一种重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利胆、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用。烟叶蛋白含18种氨基酸，包括8种人体必需氨基酸，与联合国粮农组织推荐的成人氨基酸模式基本相符，特别是赖氨酸含量较高。烟叶中所含水溶性糖90以上为还原性糖，还原性糖的作用和用途十分广泛，可以用于食品加工和医药化工。0003为开发烟叶，特别是低次烟叶在非卷烟方面的用途，国内外研究人员已对烟叶中有效成分的提取进行了大量研究，目。
11、前有多项专利公开了烟叶中茄尼醇、烟碱等成分的提取工艺，但这些工艺均存在提取成分少，原料利用率不高的缺陷。近年来，人们对烟叶的综合提取利用较为关注。专利CN2006100698466公开了一种清洁化同步高效提取高纯度茄尼醇和烟碱的方法，其特征在于采用渗漉回流法制备粗浸膏，粗浸膏经分离后得茄尼醇浸膏和烟碱水溶液，茄尼醇浸膏经纯化分离得到高纯茄尼醇，烟碱水溶液经纯化萃取得高纯度烟碱。专利CN2007100349421公开了一种从废次烟草中同时提取高纯天然烟碱和茄尼醇的方法，具体是采用乙醇和水的混合液加热回流提取、过滤，分别得烟碱提取液和滤渣，将烟碱提取液浓缩得烟碱浸膏，水溶后加入分相剂分相得烟碱产品。
12、，滤渣经处理后得茄尼醇产品；专利CN2011101133435公开了一种从烟叶中提取茄尼醇和烟碱的方法，其工艺流程是将烟叶粉碎后用碱液与用正己烷的混合溶剂萃取，萃取完毕过滤，分液，取上层正己烷再用盐酸水溶液萃取，上层正己烷层浓缩至膏状即为茄尼醇粗提物，下层水相为粗盐酸烟碱溶液。专利CN2011102485041公开了一种烟草连续提取的方法，具体涉及到利用超声波碱化预处理从烟草中依次提取烟碱、半纤维素、木质素、纤维素的方法。0004目前关于同时提取烟草中多种成分的报道，大多是针对茄尼醇和烟碱这两种物质，而烟草中其他有效成分，如蛋白质、多酚和糖类没有得到充分利用，造成了资源的浪费。发明内容0005。
13、本发明的目的在于提供一种从烟叶中综合提取并分离多种有效成分的方法，该方法提取效率高，且废弃物排放少，是一种高效且环境友好型的烟叶综合提取技术。说明书CN104151140A2/7页50006为实现上述目的，本发明采用的技术方案是一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，包括如下步骤00071乙醇溶液超声循环提取茄尼醇、烟碱和绿原酸将烟叶进行烘干粉碎后，得烟叶碎片，并置于循环式超声提取器中，加入乙醇溶液，进行超声循环提取，过滤得乙醇提取液和烟叶滤渣，将乙醇提取液进行浓缩，得含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏；00082碱性水溶液超声循环提取蛋白质和糖将步骤1得到的烟叶滤渣置于循环式超声提取器中，加入碱性。
14、水溶液，进行超声循环提取，过滤得含蛋白质和糖的提取液；00093茄尼醇、烟碱和绿原酸的分离向含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏中加入石油醚和酸性水溶液，进行液液两相萃取，取上层石油醚层进行浓缩得茄尼醇粗膏，再进行柱层析分离、重结晶得茄尼醇；下层水相用乙酸乙酯萃取后，取上层乙酸乙酯层进行浓缩得绿原酸粗膏，再配成绿原酸水溶液通过柱层析分离得绿原酸；将经乙酸乙酯萃取所得的下层水相进行浓缩，加入碱调节PH值，然后进行水蒸气蒸馏，用装有酸性水溶液的收集瓶收集馏分，得烟碱盐水溶液，将烟碱盐水溶液进行浓缩，加入碱调节PH值，然后用二氯甲烷进行萃取，取二氯甲烷层进行浓缩得烟碱；00104蛋白质和糖的分离将步骤2中所。
15、得的含蛋白质和糖的提取液进行浓缩，加入蛋白质沉淀剂，静置后，离心分离上层清液和蛋白质沉淀，蛋白质沉淀用无水乙醇洗涤后，进行低温真空干燥，得所述蛋白质；上层清液加入乙醇进行醇沉，静置后进行过滤，得糖滤饼，将糖滤饼用无水乙醇洗涤后，进行低温真空干燥，得所述糖。0011根据上述方案，所述步骤1中烟叶经烘干粉碎后所得烟叶碎片的尺寸为20目；所述乙醇溶液为乙醇体积分数为8095的酸性乙醇水溶液，PH值为34，PH值通过磷酸或柠檬酸进行调节。0012根据上述方案，所述步骤1的乙醇溶液超声循环提取过程中，超声波功率为100300W，超声提取温度为5060，提取时间为3060MIN；烟叶碎片与乙醇溶液的料液比。
16、为1520，料液比单位为G/ML。0013根据上述方案，所述步骤2的碱性水溶液超声循环提取过程中，超声波功率为100300W，超声提取温度为5060，提取时间为3060MIN；所述碱性水溶液为NAOH或KOH的碱性水溶液，PH值为78；烟叶滤渣与碱性水溶液的料液比为11020，料液比单位为G/ML。0014根据上述方案，所述茄尼醇的分离步骤中，步骤3中液液两相萃取所用酸性水溶液为磷酸水溶液，PH值为23，石油醚与酸性水溶液的体积比为23，萃取次数为23次；所述茄尼醇的柱层析分离所用吸附材料为100200目的硅胶，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶剂，石油醚与乙酸乙酯的体积比为91；所述茄尼醇的重结。
17、晶溶剂为乙醇，重结晶温度为15。0015根据上述方案，所述绿原酸的分离步骤中，柱层析分离采用聚酰胺柱作为层析分离柱，聚酰胺柱尺寸为80100目，绿原酸水溶液的上样浓度为9MG/ML，上样量为5倍柱体积，上样流速为每小时4倍柱体积，洗脱剂为体积分数为30的乙醇水溶液，洗脱流速为每小时4倍柱体积。0016根据上述方案，所述烟碱的分离步骤包括将步骤3中经乙酸乙酯萃取后的下层水相进行浓缩至初始体积的1/3，然后加入NAOH或KOH调节PH值至1113；进行水说明书CN104151140A3/7页6蒸气蒸馏烟碱时用柠檬酸溶液吸收烟碱馏出液，并控制接收液PH小于3，当溜出液用质量分数为1的硅钨酸检测无沉淀。
18、物产生时停止蒸馏，然后将烟碱盐水溶液浓缩到原体积的1/31/2，加NAOH或KOH调节PH值至1113，用二氯甲烷萃取12次，蒸发除去二氯甲烷即得烟碱。0017根据上述方案，所述步骤4中所得的含蛋白质和糖的提取液浓缩至初始体积的1/81/3；所述蛋白质沉淀剂为羧甲基壳聚糖，分子量为50000100000，用量为001005WT；沉淀温度为4，时间为25H；所得蛋白质沉淀用无水乙醇洗涤23次；所得上层清液中加入的乙醇量为其体积的34倍；醇沉静置时间为12H，温度为420；所得糖滤饼用无水乙醇洗涤23次。0018与现有技术相比，本发明的有益效果是00191通过两次超声循环提取实现对烟叶多种有效成分。
19、的同步提取，并结合液液两相萃取、柱层析、重结晶、水蒸气蒸馏、沉淀等分离或纯化手段，将烟叶中五种有效成分茄尼醇、烟碱、绿原酸、蛋白质和糖逐一分离出来，大大提高了烟草原料的利用率。00202本方法具有提取效率高，分离产物多，废弃物排放少的优点，属于一种高效且环境友好型的烟叶多成分综合连续提取技术。附图说明0021下面结合附图对本发明作进一步说明，附图中0022图1为本发明的工艺流程图。具体实施方式0023为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。0024以下实施例中所使用的材料、试剂等。
20、如无特别说明，均可从商业途径中得到。0025以下实施例中茄尼醇、烟碱和绿原酸均采用高效液相色谱法测定最终产品纯度，蛋白质纯度用微量凯式定氮法测定，糖用苯酚硫酸法测定其纯度。0026茄尼醇的高效液相色谱测试参数包括0027色谱柱AGILENTZORBAXECLIPSEPLUSC18反相柱250MM46MM，5M；0028流动相异丙醇乙腈5050体积比；0029流速1ML/MIN；0030紫外检测波长210NM；0031柱温25；0032进样量10L。0033烟碱的高效液相色谱测试参数包括0034色谱柱AGILENTZORBAXECLIPSEPLUSC18反相柱250MM46MM，5M；0035流。
21、动相甲醇磷酸缓冲溶液6040体积比；0036磷酸缓冲溶液配制2420G磷酸氢二钠，35ML磷酸和65ML三乙胺，加水定容至1000ML；说明书CN104151140A4/7页70037流速1ML/MIM；0038紫外检测波长259NM；0039柱温30；0040进样量10L。0041绿原酸的高效液相色谱测试参数包括0042色谱柱AGILENTZORBAXECLIPSEPLUSC18反相柱250MM46MM，5M；0043流动相乙腈2乙酸1387体积比；0044流速1ML/MIN；0045紫外检测波长328NM；0046柱温25；0047进样量10L。0048实施例一0049一种从烟叶中综合提取。
22、多种有效成分的方法，包括以下步骤00501乙醇溶液超声循环提取烟叶中茄尼醇、烟碱和绿原酸将云南烟叶烘干粉碎至20目后，称取100G烟叶碎片，置于超声循环提取器中，然后加入500ML乙醇体积分数为80的酸性乙醇水溶液，溶液的PH值为3，通过磷酸进行调节。在温度为50，超声波功率为100W的条件下超声循环提取30MIN，过滤得到酸性乙醇提取液和烟叶滤渣。将乙醇提取液进行浓缩得含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏182G，其中茄尼醇提取率482，烟碱提取率594，绿原酸提取率627。00512碱性水溶液超声循环提取烟叶滤渣中的水溶性蛋白质和糖将步骤1得到的烟叶滤渣置于循环式超声提取器中，加入1000MLPH。
23、值为7的NAOH水溶液，在温度为50，超声波功率为100W的条件下超声循环提取30MIN，过滤得二次滤渣和含水溶性蛋白质和糖的提取液，水溶性蛋白质提取率为524，水溶性糖提取率为78。00523茄尼醇、烟碱和绿原酸的分离向182G含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏中分别加入石油醚100ML和PH值为2磷酸水溶液150ML，进行液液两相萃取，取上层石油醚层，下层水相继续用100ML石油醚萃取第2次，合并两次石油醚层并进行浓缩得茄尼醇粗膏17G，再通过100200目的硅胶进行柱层析分离，洗脱剂为石油醚乙酸乙酯91体积比的混合溶剂，收集洗脱液中茄尼醇富集段，浓缩得042G茄尼醇纯化物，然后加入5ML乙醇，。
24、在15下重结晶，过滤所得晶体在室温真空干燥20，即得精制茄尼醇029G，纯度测定为91。0053两次石油醚萃取过的下层水相继续用乙酸乙酯萃取两次，每次乙酸乙酯的用量为100ML，合并得到的乙酸乙酯层并进行浓缩得绿原酸粗膏142G，然后加入蒸馏水配成9MG/ML的绿原酸水溶液进行聚酰胺柱层析分离，聚酰胺柱尺寸为80100目，上样量为5倍柱体积，上样流速为每小时4倍柱体积，洗脱剂为体积分数为30的乙醇水溶液，洗脱流速为每小时4倍柱体积，总共洗脱6倍柱体积，以1/2倍柱体积为接收单位，收集绿原酸含量较高的洗脱液，减压浓缩并进行真空低温干燥温度低于20即得绿原酸058G，纯度47。0054将乙酸乙酯萃。
25、取得到的150ML下层水相浓缩到50ML后加入NAOH调节PH值至11，然后进行水蒸气蒸馏，用事先装有柠檬酸水溶液的接收瓶收集馏分，并控制接收瓶内PH小说明书CN104151140A5/7页8于3，当馏出液用质量分数为1的硅钨酸检测无沉淀物产生时停止蒸馏，此时接收瓶内溶液体积约200ML，然后将接收瓶内的柠檬酸烟碱溶液真空浓缩到100ML，加入NAOH调节PH值至11左右，用二氯甲烷萃取两次，每次二氯甲烷萃的用量为80ML，合并二氯甲烷层并用无水硫酸钠进行干燥，最后减压蒸馏除去二氯甲烷即得烟碱163G，纯度测定为98。00554蛋白质和糖的分离将步骤2中水溶液超声循环提取所得的含蛋白质和糖的水。
26、溶液1000ML浓缩到250ML，然后缓慢搅拌加入5ML羧甲基壳聚糖分子量为50000浓度为05WT的溶液，在4下静置2H后，离心取上层清液230ML，所得蛋白质沉淀用无水乙醇洗涤两次后，进行低温真空干燥温度低于20即得水溶性蛋白质41G，纯度70。0056所得上层清液继续加入800ML乙醇进行醇沉，在4下静置1H时间后过滤，得糖滤饼用无水乙醇洗涤两次后，进行低温真空干燥温度低于20即得水溶性糖82G，纯度80。0057实施例二0058一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，包括以下步骤00591乙醇溶液超声循环提取烟叶中茄尼醇、烟碱和绿原酸将云南烟叶烘干粉碎至20目后，称取100G烟叶碎片，。
27、置于超声循环提取器中，然后加入1000ML乙醇体积分数为90的酸性乙醇水溶液，溶液的PH值为4，通过磷酸进行调节。在温度为55，超声波功率为200W的条件下超声循环提取45MIN，过滤得到酸性乙醇提取液和烟叶滤渣。将乙醇提取液进行浓缩得含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏203G，其中茄尼醇提取率682，烟碱提取率723，绿原酸提取率747。00602碱性水溶液超声循环提取烟叶滤渣中的水溶性蛋白质和糖将步骤1得到的烟叶滤渣置于循环式超声提取器中，然后加入1500ML的PH值为8的NAOH水溶液，在温度为55，超声波功率为200W的条件下超声循环提取45MIN，过滤得二次滤渣和含水溶性蛋白质和糖的提取液。
28、，水溶性蛋白质提取率为724，水溶性糖提取率为82。00613茄尼醇、烟碱和绿原酸的分离向203G含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏中分别加入石油醚100ML和PH值为2磷酸水溶液150ML，进行液液两相萃取，取上层石油醚层，下层水相继续用100ML石油醚萃取第2次，合并两次石油醚层并进行浓缩得茄尼醇粗膏22G，再通过100200目的硅胶进行柱层析分离，洗脱剂为石油醚乙酸乙酯91体积比的混合溶剂，收集洗脱液中茄尼醇富集段，浓缩得054G茄尼醇纯化物，然后加入5ML乙醇，在15下重结晶，过滤所得晶体在室温真空干燥20，即得精制茄尼醇035G，纯度测定为90。0062两次石油醚萃取过的下层水相继续用乙酸。
29、乙酯萃取两次，每次乙酸乙酯的用量为100ML，合并得到的乙酸乙酯层进行浓缩得绿原酸粗膏172G，然后加入蒸馏水配成9MG/ML的绿原酸水溶液进行聚酰胺柱层析分离，聚酰胺柱尺寸为80100目，上样量为5倍柱体积，上样流速为每小时4倍柱体积，洗脱剂为体积分数为30的乙醇水溶液，洗脱流速为每小时4倍柱体积，总共洗脱6倍柱体积，以1/2倍柱体积为接收单位，收集绿原酸含量较高的洗脱液，减压浓缩并进行真空低温干燥温度低于20即得绿原酸07G，纯度46。0063乙酸乙酯萃取得到的255ML下层水相浓缩到85ML后加入NAOH调节PH值至12，然后进行水蒸气蒸馏，用事先装有柠檬酸水溶液的接收瓶收集馏分，并控制。
30、接收瓶内PH小于3，当馏出液用质量分数为1的硅钨酸检测无沉淀物产生时停止蒸馏，此时接收瓶内溶说明书CN104151140A6/7页9液体积约为200ML，然后将接收瓶内的柠檬酸烟碱溶液真空浓缩到100ML，加入NAOH调节PH值至11左右，用二氯甲烷萃取两次，每次二氯甲烷的用量为80ML，合并二氯甲烷并用无水硫酸钠进行干燥，最后减压蒸馏除去二氯甲烷即得烟碱21G，纯度测定为97。00644蛋白质和糖的分离将步骤2中水溶液超声循环提取所得的含蛋白质和糖的水溶液1500ML浓缩到300ML，然后缓慢搅拌加入10ML含量为05WT的羧甲基壳聚糖分子量为50000溶液，在4下静置5H后，离心取上层清液。
31、280ML，所得蛋白质沉淀用无水乙醇洗涤两次后，进行低温真空干燥温度低于20即得水溶性蛋白质58G，纯度71。0065所得上层清液继续加入900ML乙醇进行醇沉，在20下静置1H时间后过滤，得糖滤饼用无水乙醇洗涤三次后，进行低温真空干燥温度低于20即得水溶性糖89G，纯度81。0066实施例三0067一种从烟叶中综合提取多种有效成分的方法，包括以下步骤00681乙醇溶液超声循环提取烟叶中茄尼醇、烟碱和绿原酸将云南烟叶烘干粉碎至20目后，称取100G烟叶碎片，置于超声循环提取器中，然后加入2000ML乙醇体积分数为95的酸性乙醇水溶液，溶液的PH值为4，通过磷酸进行调节。在温度为60，超声波功率。
32、为300W的条件下超声循环提取60MIN，过滤得到酸性乙醇提取液和烟叶滤渣。将乙醇提取液进行浓缩得含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏216G，其中茄尼醇提取率812，烟碱提取率943，绿原酸提取率937。00692碱性水溶液超声循环提取烟叶滤渣中的水溶性蛋白质和糖将步骤1中得到的烟叶滤渣置于超声循环提取器中，然后加入2000ML的PH值为8的NAOH水溶液，在温度为60，超声波功率为300W的条件下超声循环提取60MIN，过滤得二次滤渣和含水溶性蛋白质和糖的提取液，水溶性蛋白质提取率为812，水溶性糖提取率为84。00703茄尼醇、烟碱和绿原酸的分离向216G含茄尼醇、烟碱和绿原酸的粗膏中分别加入石。
33、油醚100ML和PH值为3磷酸水溶液150ML，进行液液两相萃取，取上层石油醚层，下层水相继续用100ML石油醚萃取第2次，合并两次石油醚层浓缩得茄尼醇粗膏24G，再通过100200目的硅胶进行柱层析分离，洗脱剂为石油醚乙酸乙酯91体积比的混合溶剂，收集洗脱液中茄尼醇富集段，进行浓缩得061G茄尼醇纯化物，然后加入5ML乙醇，在15下重结晶，过滤所得晶体在室温真空干燥20，即得精制茄尼醇04G，纯度测定为91。0071经两次石油醚萃取过的下层水相继续用乙酸乙酯萃取两次，每次乙酸乙酯的用量为100ML，合并得到的乙酸乙酯层进行浓缩得绿原酸粗膏178G，然后加入蒸馏水配成9MG/ML的绿原酸水溶液。
34、进行聚酰胺柱层析分离，聚酰胺柱尺寸为80100目，上样量为5倍柱体积，上样流速为每小时4倍柱体积，洗脱剂为体积分数为30的乙醇水溶液，洗脱流速为每小时4倍柱体积，总共洗脱6倍柱体积，以1/2倍柱体积为接收单位，收集绿原酸含量较高的洗脱液，减压浓缩并进行真空低温干燥温度低于20即得绿原酸073G，纯度46。0072乙酸乙酯萃取得到的255ML下层水相浓缩到85ML后加入NAOH调节PH值至12，然后进行水蒸气蒸馏，用事先装有柠檬酸水溶液的接收瓶收集馏分，并控制接收瓶内PH小于说明书CN104151140A7/7页103，当馏出液用质量分数为1硅钨酸检测无沉淀物产生时停止蒸馏，此时接收瓶内溶液体积。
35、约为300ML，然后将接收瓶内的柠檬酸烟碱溶液真空浓缩到100ML，加入NAOH调节PH值至12左右，用二氯甲烷萃取两次，每次二氯甲烷萃的用量为80ML，合并二氯甲烷并用无水硫酸钠进行干燥，最后减压蒸馏除去二氯甲烷即得烟碱28G，纯度测定为97。00734蛋白质和糖的分离将步骤2中水溶液超声循环提取所得的含蛋白质和糖的水溶液2000ML浓缩到300ML，然后缓慢搅拌加入15ML含量为05WT的羧甲基壳聚糖分子量为50000溶液，在4下静置2H后，离心取上层清液270ML，所得蛋白质沉淀用无水乙醇洗涤两次后，进行低温干燥温度低于20即得水溶性蛋白质65G，纯度74。0074所得上层清液继续加入950ML乙醇进行醇沉，在4下静置2H时间后过滤，得糖滤饼用无水乙醇洗涤两次后，进行低温真空干燥温度低于20即得水溶性糖93G，纯度81。0075在不违背本发明实质及精神的情况下，熟悉本领域的技术人员可能根据本发明做出各种各样的改变或变形，但这些相应的改变或变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。说明书CN104151140A101/1页11图1说明书附图CN104151140A11。