氨基酸诊断/测定试剂盒及氨基酸的浓度测定方法.pdf

本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的氨基酸诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定氨基酸浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂(盒)主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、乙醛酸、氨基酸氧化酶、甘氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。

1.  一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的氨基酸浓度测定方法，其方法如下：
氨基酸+水+氧  氨基酸氧化酶  氧代酸+氨+过氧化氢
氨+乙醛酸+还原型辅酶  甘氨酸脱氢酶  甘氨酸+水+辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，测算出氨基酸的浓度大小测定结果。

2.  一种氨基酸诊断/测定试剂(盒)，主要成分包括：
缓冲液            20——500mmol/L
稳定剂            1——4000mmol/L
还原型辅酶        0.1——0.35mmol/L
氨基酸氧化酶      1000——80000U/L
甘氨酸脱氢酶      1000——80000U/L
乙醛酸            1——50mmol/L
试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。
其特征在于：试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

3.  根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸脱氢酶、乙醛酸组成单剂试剂。

4.  根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸脱氢酶、乙醛酸组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乙醛酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、甘氨酸脱氢酶组成。还原型辅酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸脱氢酶、乙醛酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。

5.  根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸脱氢酶、乙醛酸组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乙醛酸组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甘氨酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶组成。还原型辅酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸脱氢酶、乙醛酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。

6.  根据权利要求2所述氨基酸诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。

氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种氨基酸诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定氨基酸浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术
氨基酸含量的测定在医学/食品/工业/农业/环境中都是比较重要的测定项目。现有的测定方法有色谱法、电化学法、仪器分析法(氨基酸分析仪)、分光光度计等方法，这些方法或是操作方法较为繁杂、特异性差、或仪器设备成本较高等缺点。
氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸(仪器价格昂贵，不能普遍使用)，对于医学/食品/工业/农业/环境中来说，多数情况下，都是很多种氨基酸同时存在，所以需要测定总的氨基酸含量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。
大量食肉或饥饿时尿中氨基酸氮增加，孕妇及新生儿尿液氨基酸氮也增加。氨基酸代谢异常，造成某些氨基酸在体内积累过多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎缩、肝功能衰竭、Reye综合征、或某些因素造成蛋白质分解加速的疾病，遗传性疾病所导致的代谢异常均可使尿中氨基酸氮增加。
酶法测定血、尿、体液、食品、土壤、工业产品中氨基酸氮含量具有特异性高、方法简便、成本低的特点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶循环扩增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨基酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的氨基酸诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨基酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明氨基酸浓度测定方法如下：
氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨+过氧化氢
氨+乙醛酸+还原型辅酶甘氨酸脱氢酶甘氨酸+水+辅酶
这种方法应用氨基酸氧化酶(amino-acid oxidase；EC 1.4.3.2；EC 1.4.3.3)酶(偶)联甘氨酸脱氢酶(glycine dehydrogenase；EC 1.4.1.10)酶促反应连续监测法。氨基酸氧化酶作为作用酶，功能为将氨基酸酶解产生氨。甘氨酸脱氢酶作为循环酶：甘氨酸脱氢酶的酶促作用使氨变回甘氨酸(一种氨基酸)，使甘氨酸(氨基酸)不断地被重复循环利用。甘氨酸脱氢酶又作为显色酶，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为氧化型辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算氨基酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明氨基酸诊断/测定试剂(盒)较为理想：
缓冲液          100mmol/L
稳定剂          500mmol/L
还原型辅酶      0.25mmol/L
氨基酸氧化酶    6000U/L
甘氨酸脱氢酶    8000U/L
乙醛酸    12mmol/L
本发明的氨基酸诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸脱氢酶、乙醛酸。
试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乙醛酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、甘氨酸脱氢酶。
还原型辅酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸脱氢酶、乙醛酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、乙醛酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、甘氨酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶。
还原型辅酶、氨基酸氧化酶、甘氨酸脱氢酶、乙醛酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定氨基酸浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
还原型辅酶                       0.25mmol/L
氨基酸氧化酶                     6000U/L
甘氨酸脱氢酶                     8000U/L
乙醛酸                           12mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。
实施例二
本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
还原型辅酶                       0.25mmol/L
乙醛酸                           12mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
氨基酸氧化酶                     6000U/L
甘氨酸脱氢酶                     8000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。
实施例三
本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
还原型辅酶                       0.25mmol/L
乙醛酸                           12mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
甘氨酸脱氢酶                     8000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
氨基酸氧化酶                     6000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定氨基酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0009；吸光度时间反应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达40mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±3％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2％；试剂的灵敏度可达0.08±0.04ΔA/mmol/L；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。