检测慢性粒细胞白血病的单链DNA适配子及其制备方法.pdf

本发明提供了一种检测慢性粒细胞白血病的单链DNA适配子及其制备方法，体外合成长度为88个碱基的随机单链DNA文库，采用生物素-链霉亲和素磁珠法制备次级文库，以正常人中性粒细胞为反筛细胞，利用SELEX技术筛选出与慢性粒细胞白血病K562细胞特异结合的适配子。将筛选得到的适配子回收纯化后连接pGEM-T质粒载体，经蓝白筛选后，随机挑选24个克隆子进行序列测定。采用荧光标记引物法检测亲和力，并用DNAMAN软件对适配子序列进行一级结构同源性分析和二级结构预测。一级结构分析发现无同源序列，但可分为6个家族(family)。二级结构分析表明：适配子形成的茎环、凸环结构可能是与K562细胞特异性结合的结构基础。24个克隆适配子中，第5、10、21、22、24号适配子与慢性粒细胞白血病K562细胞的结合率较高，分别为40.6％、45.2％、40.8％、42.2％、41.6％。

1.  一种检测慢性粒细胞白血病的单链DNA适配子，其特征在于：该适配子具有序列表中SEQ ID No.1至SEQ ID No.5所述的核苷酸序列的任意一种。

2.  根据权利要求1所述的一种检测慢性粒细胞白血病的单链DNA适配子，其特征在于：
所述SEQ ID No.1所述的核苷酸序列的二级结构为：

所述SEQ ID No.2所述的核苷酸序列的二级结构为：

所述SEQ ID No.3所述的核苷酸序列的二级结构为：

所述SEQ ID No.4所述的核苷酸序列的二级结构为：

所述SEQ ID No.5所述的核苷酸序列的二级结构为：


3.  一种如权利要求1所述的检测慢性粒细胞白血病的单链DNA适配子的制备方法，其特征在于：该方法按照下列步骤进行：
①将慢性粒细胞白血病K562细胞接种于含10％小牛血清的RPMI-1640培养液中，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂的培养箱内培养，隔天传代一次；
②构建单链DNA文库：
5’-ATACCAGCTTATTCAATT-N52-AGA TAGTAAGTGCAATCT-3’，
其中N代表碱基A、G、C、T中的任意一个，构建5条引物，分别为：
P1    5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’
P2    5’-FITC-ATACCAGCTTATTCAATT-3’
P3    5’-Dig-ATACCAGCTTATTCAATT-3’
P4    5’-Bio-AGATTGCACTTACTATCT-3’
P5    5’-AGATTGCACTTACTA TCT-3’
③将10μg的随机ssDNA文库加到400μl 2×结合缓冲液中，于99℃变性5min，然后立即置于0℃冰上10min；加入3％BSA 13.5μl降低背景；再将1×106个人慢性粒细胞性白血病K562细胞加到上述溶液中混匀，37℃水浴30min；3000rpm离心5min，去上清，加入400μl结合缓冲液混匀再3000rpm离心5min，反复6次；最后所得沉淀加入100μl ddH₂O，100℃加热10min；10000rpm离心5min，取上清，经酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，将ssDNA溶解于20μl TE缓冲液中；
④将上述筛选过程得到的ssDNA，用上游引物P1和下游生物素标记的引物P4经PCR扩增成一端带生物素的dsDNA，PCR反应体系为：模板mμl，10×PCR Butter 5μl，MgCl₂3μl，dNTPs 5μl，Taq DNA多聚酶2U，上游引物、下游5’端生物素标记的引物各25pmol，加去离子水至50μl；PCR反应条件为：94℃预变性2min，然后进行n个循环94℃的变性30s，45℃退火1min，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min；在开始几轮筛选过程中，ssDNA文库和细胞量投放很多；在随后的几轮筛选中，由于高特异性的适配子已经富集，为了提高筛选的严谨性，结合时间由30min减少到20min；模板量也由2μl减少到0.5μl；然而PCR循环数却由原来的11个循环增加到16个循环；
⑤PCR扩增产物电泳鉴定及纯化：用含有浓度0.25μl EB的3％的琼脂糖凝胶，将每轮筛选产物的PCR产物中，取5-10μl上样于80V，进行电泳，30min后取出凝胶，用凝胶图像分析系统观察并照相，PCR产物用UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒纯化；
⑥磁珠分离制备次级文库：取100μl磁珠于1.5ml微量离心管中置磁力架1～2min，吸弃上清；拿下微量离心管，加入100ul 2×洗涤缓冲液重悬磁珠；重置磁力架1～2min，吸弃洗涤缓冲液，加入200μl 2×洗涤缓冲液，再加入200μl生物素化的dsDNA 37℃水浴15min；上磁力架1～2min，吸弃上清；用200μl 1×洗涤缓冲液冲洗2～3次；加入50μl 150mM NaOH于37℃水浴15min，使dsDNA解链；上磁力架，含生物素的一条ssDNA仍留在链霉亲和素磁珠上并吸附于管壁，而另一条不含生物素的ssDNA则存在于上清中，分离出上清中的ssDNA并测定A值，此即为下一轮筛选的ssDNA库；
⑦中性粒细胞进行反筛：用中性粒细胞提取液从正常查体人群血液中提取中性粒细胞，将磁珠分离得到的ssDNA库99℃加热5min进行变性，然后立即置于0℃ 10min；将1×106个中性粒细胞上清后加入上述溶液，加入选择缓冲液400μl 37℃水浴30min；将混合液3000rpm离心2min，取上清，用于下一轮SELEX筛选；
⑧适配子克隆测序及一级、二级结构的分析：重复筛选13轮后，将筛选得到的适配子回收纯化后连接pGEM-T质粒载体，经蓝白筛选后，随机挑选24个克隆子进行序列测定；并用DNAMAN软件对适配子序列进行一级结构同源性分析和二级结构预测；
⑨克隆适配子与靶细胞亲和力的测定：将标准品5’-FITC-88nt-3’用选择缓冲液稀释为不同浓度的溶液，测定各管的荧光强度，绘出荧光强度-ssDNA浓度标准曲线；取测序之转化菌，经质粒抽提试剂盒抽提后，用标记荧光素和生物素的引物进行PCR扩增，然后再用生物素-链霉亲和素磁珠分离，得到标记有荧光素的单链DNA，测定其荧光强度；按荧光素标记的ssDNA∶慢性粒细胞性白血病K562细胞＝50pmol∶1×106个慢性粒细胞性白血病K562细胞的比例进行结合反应，将二者在选择缓冲液中结合30min，更换离心管，离心，吸取上清测定荧光强度；用选择缓冲液重悬慢性粒细胞性白血病K562细胞后离心，吸取上清，测定荧光强度，重复洗涤2次，洗去未与慢性粒细胞性白血病K562细胞结合的荧光素-ssDNA；根据各管洗涤上清的荧光强度从标准曲线查得其对应的浓度，乘体积得到ssDNA的量，再将各管的量相加，即为未结合到慢性粒细胞性白血病K562细胞上的ssDNA的总量；将投入总量减去未结合的量即为结合到慢性粒细胞性白血病K562细胞上的ssDNA的量，用结合的量除以总量，计算出结合率；用同样的方法测定适配子与人正常中性粒细胞的结合率；与慢性粒细胞性白血病K562细胞结合率较高，而与人正常中性粒细胞结合率低的就是能与慢性粒细胞性白血病细胞特异性结合的DNA适配子。

检测慢性粒细胞白血病的单链DNA适配子及其制备方法
技术领域
本发明属生物医学领域，特别是生物检测技术。具体涉及一种利用分子生物学SELEX技术设计的能够特异性检测人慢性粒细胞白血病的高亲和力单链DNA适配子及其制备方法。
背景技术
白血病(Leukemia)是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病。在我国，白血病被列为十大高发性肿瘤之一，约占肿瘤总发病率的5％左右。其死亡率占我国肿瘤男性第6位、女性第8位，在儿童及青少年中占第1位。慢性粒细胞性白血病，简称慢粒(chronicmyelognous leukemia，CML)，是临床上一种起病及发展相对缓慢的白血病，表现为髓系祖细胞池扩展，髓细胞系及其祖细胞过度生长。我国的CML发病率调查结果为年发病率36/10万，在我国CML约占各类白血病的20％，占慢性白血病的95％。发病年龄分布较广，但发病率随年龄的增长有逐步上升的趋势。临床上白血病的诊断主要依靠血象、骨髓象、细胞化学染色以及用流式细胞仪检测白血病细胞抗原，但是血象检查无特异性，骨髓穿刺具有一定的风险性，且技术要求较高，细胞化学染色结果受影响的因素较多，如试剂、每个实验人员判断标准等，使结果相差很大，流式细胞仪检测价格昂贵，不能作为常规体检的项目对白血病进行人群普查。临床上现有的检测手段诊断出的白血病均已属晚期，如能早期诊断，无论化疗或放疗，治疗效果非常显著，症状、体征可完全消失，血象、骨髓象恢复正常或接近正常。因此白血病的早期诊断成为亟待解决的问题。利用SELEX技术筛选出靶细胞特异性适配子，从而建立白血病的早期特异性检测技术方法。
SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment指数富集的配基系统进化技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组织化学技术，其基本思想是体外构建一个大容量单链寡核苷酸文库，并与靶物质混合，形成靶物质与核酸的复合物，洗掉未与靶物质结合的核酸，分离与靶物质结合的核酸，并以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下一轮的筛选过程。通过重复的筛选与扩增，最后得到特异性强、亲和力高的寡核苷酸适配子(aptamers)，具有库容量大、靶物质范围广、亲和力高、特异性强等优点，已成功应用于多种靶物质的筛选，除用于核苷酸序列、蛋白质、氨基酸(L-精氨酸)外，还可用于染料、金属离子、药物小分子(如茶碱)、生长因子、肽链、类固醇、糖类，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子和朊病毒等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲和力和特异性，具有良好的应用前景。目前通过此技术筛选到的靶物质有200多种，筛选出的适配子在疾病的诊断、治疗与药物的快速开发等方面起着重要作用。
目前，在国内利用SELEX技术筛选特异性适配子方面的研究很多，但是在白血病适配子的开发上还是空白，而且在国外发表的文献仅报道了以急性粒细胞白血病细胞、急性T细胞型淋巴母细胞白血病为材料筛选适配子的方法，然而在慢性粒细胞白血病适配子的制备上没有任何报道。因此本实验筛选出的DNA适配子可以填充空白，而且为慢性粒细胞白血病的诊断、治疗等提供科学依据和实验基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够特异性结合慢性粒细胞白血病细胞的DNA适配子，该DNA适配子为诊断和治疗慢性粒细胞白血病提供了新的方法，为克服临床上现在不能做到早期诊断、早期治疗的问题，提供了新的解决途径。
本发明的另一目的是提供一种制备能够和慢性粒细胞白血病细胞高亲和力特异性结合的DNA适配子的方法，该方法包括随机单链DNA文库和引物的构建、PCR扩增、生物素-链霉亲和素磁珠分离制备次级文库、SELEX筛选、人中性粒细胞反筛、一级二级结构的分析、适配子亲和力特异性的测定。
本发明的有益效果是：能特异性的结合慢性白血病K562细胞上，而与其他细胞的结合率很低，因此该DNA适配子经修饰可检测和治疗慢性粒细胞性白血病。因为采用了新的组合化学技术-SELEX技术进行慢性粒细胞性白血病的DNA适配子的筛选，确保了获得的DNA适配子可特异性结合在慢性粒细胞性白血病细胞上，从而检测和治疗慢性粒细胞性白血病。另外，本发明制备的DNA适配子为小分子核酸，其分子结构不同于任何使用的检测物质，且只高亲和力结合慢性粒细胞，对其他细胞并无危害；该DNA适配子也有别于传统的抗体，其分子量小，可快速渗入，经修饰后作为治疗药物携带体，无抗原性，不引起副作用。
附图说明
图1表示不同循环的PCR产物3％琼脂糖电泳图；
图1中1-5分别代表9、12、15、18、21个循环PCR产物；M代表100bp DNA Marker；箭头指示为目的条带。
图2表示部分SELEX筛选的PCR产物3％琼脂糖电泳图；
图2中1-5分别代表第1、4、7、10、13轮筛选的PCR产物；M代表100bp DNA Marker；箭头指示为目的条带。
图3表示部分SELEX筛选的产物结合率所测吸光度A值图；
图3中横坐标为筛选轮数，纵坐标为吸光度A值。
图4为感受态DH5α转化率的测定图；
图5为重组体转化大肠杆菌DH5αα互补筛选图；
图6为DNA适配子的二级结构预测图。
具体实施方式
材料与方法
一、实验材料
1.2  细胞和菌株
慢性粒细胞白血病K562细胞株；大肠杆菌DH5α。
1.3  克隆载体
克隆载体pGEM-T购自Promega公司，
1.4  主要试剂及试剂盒
1.4.1  PCR试剂盒：购自上海生工生物技术有限公司；
1.4.2  PCR产物纯化试剂盒：购自上海生工生物技术有限公司；
1.4.3  UNIQ-10柱式DNA胶回收纯化试剂盒：购自上海生工生物技术有限公司；
1.4.4  100bp DNAmarker：购自西安舟鼎国生物技术有限公司；
1.4.5  人中性粒细胞提取液：购自西安舟鼎国生物技术有限公司；
1.4.6  生物素-链霉亲合素磁珠及磁力架：购自Promega公司；
1.4.7  pGEM-T载体和T4DNA连接酶：购自Promega公司；
1.4.8  小牛血清：购自杭州四季青公司；
1.4.9  氨苄青霉素(Amp)：购自华美生物工程公司；
1.4.10  溴化乙锭(EB)：购自华美生物工程公司；
1.4.11  Agarose(琼脂糖)：德国进口分装；
1.4.12  IPTG：Promega产品分装；
1.4.13  X-gal：美国进口分装；
1.4.14  胰蛋白胨：英国Oxoid公司产品；
1.4.15  酵母提取物：英国Oxoid公司产品；
1.4.16  Agar(琼脂)：日本进口分装；
1.4.17  ATP：购自华美生物工程公司；
1.4.18  CaCl2：购自北京化学试剂公司；
1.4.19  Tris：购自上海新兴化工试剂研究所；
1.4.20  EDTA：购自北京化学试剂公司；
1.4.21  BSA(牛血清蛋白)：购自西安舟鼎国生物技术有限公司公司；
1.4.22  酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)：购自上海生工生物技术有限公司；
1.4.23  质粒小提试剂盒：天根生化科技有限公司；
1.5  主要试剂及配制
1.5.1  RPMI-1640的制备：
取10.4g 1640干粉溶于800ml新鲜三蒸水，磁力搅拌2h，加2g NaHCO₃再搅拌4h，加青、链霉素各10万U，定容至1L，过滤除菌并分装到若干个小瓶，4℃冰箱保存备用。
1.5.2  血清的灭活：
1瓶小牛血清在56℃水浴中灭活35min，消除补体活性，分装到数个小瓶，-20℃保存备用。
1.5.3  谷氨酰胺贮存液：
谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
1.5.4  完全培养基的制备：
90ml RPMI-1640液体培养基中加入10ml灭活的小牛血清，制成含10％小牛血清的RPMI-1640完全培养基。
1.5.5  D-hank’s液的配制：
称取NaCl 8.00g，KCl 0.4g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.134g，KH₂PO₄ 0.06g，NaHCO₃ 0.35g，酚红0.02g溶于900ml三蒸水中，7.4％NaHCO₃pH值到7.2-7.4，容量烧瓶定容到1L，在1.034×10⁵Pa高压下蒸汽灭菌20min，4℃冰箱保存备用。
1.5.6  0.01mol/L，pH 7.4PBS的配制：
称取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.628g，KH₂PO₄ 0.24g溶于900ml三蒸水中，容量烧瓶定容到1L，在1.034×10⁵Pa高压下蒸气灭菌20min，4℃冰箱保存备用。
1.5.7  0.5mol/L的EDTA(pH8.0)的配制：
在800ml双蒸水中加入EDTA-Na₂·2H₂O 186.1g，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用1mol/LNaOH调节溶液的pH值至8.0，然后定容至1L，分装后高压灭菌放于4℃冰箱保存备用。
1.5.8  pH 8.0的TE缓冲液的配制：
吸取1mol/L的Tris-Cl(pH 8.0)10ml，0.5mol/L的EDTA(pH8.0)2ml，加入800ml的双蒸水，调节pH至8.0，定容至1000ml，分装后高压灭菌，4℃冰箱保存备用。
1.5.9  溴化乙锭(EB)的配制：
在10ml双蒸水中溶解0.1g的溴化乙锭，磁力搅拌3h使其溶解，分装后用铝箔包裹容器，4℃冰箱保存备用。
1.5.10  5×TBE的配制：
称取54g Tris碱加入27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，加入双蒸水定容至1L，4℃冰箱保存备用。
1.5.11  6×上样缓冲液的配制：
称取2.5mg的溴酚蓝和4g的蔗糖用双蒸水溶解后定容至10ml，4℃冰箱保存备用。
1.5.12  3％琼脂糖凝胶的配制：
1.5g琼脂糖+50ml电泳缓冲液，在微波炉中加热30s至沸腾，熔化的琼脂物冷却至50℃时加入10mg/ml溴化乙锭1.25ul，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后使用。
1.5.13  3％BSA的配制：
3g牛血清蛋白(BSA)溶于100ml PBS中，4℃冰箱保存备用。
1.5.14  2×结合缓冲液的配制：
50mM TrisHCl，5mM KCl，100mM NaCl，1mM MgCl₂，调节pH 7.4。
1.5.15  2×洗涤缓冲液的配制：
将0.1ml Tween 20溶液加入100ml灭菌pH 7.4的PBS缓冲液中，充分混匀，4℃冰箱保存备用。
二、实验方法
2.1  慢性粒细胞白血病K562细胞的培养
用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液置于37℃、饱和湿度、5％CO₂的培养箱内培养。隔天传代一次。
2.2  随机单链DNA(ssDNA)文库及引物
以下随机ssDNA文库和引物均委托上海生工生物技术有限公司合成。
2.2.1  随机ssDNA文库
构建了长度为88nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间52个核苷酸为随机序列，库容量大约为10¹⁶，合成量为2OD₂₆₀。将合成库加入22μl的三蒸水配制成100μM贮存液-20℃储存备用。
合成的序列如下：
5’-ATACCAGCTTATTCAATT-52-nt-AGA TAGTAAGTGCAATCT-3’
此外还合成了一个标准品(5’-FITC-88nt-3’)，测定结合率时用。
2.2.2  引物
合成以下5种引物，无任何二级结构形成，与核酸序列中已有的核酸序列无同源性。引物序列如下：
P1    5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’
P2    5’-FITC-ATACCAGCTTATTCAATT-3’
P3    5’-Dig-ATACCAGCTTATTCAATT-3’
P4    5’-Bio-AGATTGCACTTACTATCT-3’
P5    5’-AGATTGCA CTTACTA TCT-3’
引物P1和P5分别对应于随机ssDNA库的两端固定序列，利于在PCR反应时退火延伸；引物P4用生物素标记，在用生物素-链霉亲和素磁珠分离DNA双链为单链时使用；引物P2、P3分别用荧光素和地高辛标记，在测定结合率时使用。以上5种引物合成量均为5OD₂₆₀，每OD的引物加57μl的三蒸水配制成100μM贮存液-20℃储存备用。
2.3  SELEX技术筛选K562细胞的适配子
2.3.1  SELEX筛选过程
(1)10μg的随机ssDNA文库加到400μl 2×结合缓冲液中，于1.5ml微量离心管中99℃变性5min，然后立即置于0℃冰上10min；
(2)加入3％BSA 13.5μl降低背景；
(3)将1×10⁶个人慢性粒细胞性白血病K562细胞加到上述溶液中混匀，37℃水浴30min；
(4)更换离心管，去除与管壁结合的ssDNA；
(5)3000rpm离心5min，去上清，加入400μl结合缓冲液混匀再3000rpm离心5min，反复6次；
(6)最后所得沉淀加入100μl ddH₂O，100℃加热10min；
(7)10000rpm离心5min，取上清，经酚∶氯仿抽提，乙醇沉淀，将ssDNA溶解于20μlTE缓冲液中。
2.3.2  PCR扩增
将上述筛选过程得到的ssDNA用上游引物P1和下游生物素标记的引物P4经PCR扩增成一端带生物素的dsDNA。
PCR反应体系为：模板m μl，10×PCRButter 5μl，MgCl₂ 3μl，dNTPs 5μl，Taq DNA多聚酶2U，上游引物、下游5’端生物素标记的引物各25pmol，加去离子水至50μl；
PCR反应条件为：94℃预变性2min，然后进行n个循环94℃的变性30s，45℃退火1min，72℃延伸30s，最后72℃延伸5min。
PCR反应体系如下：

m为模板量，随着筛选轮数的增加而不断变化，具体数值见表1；
n为循环次数，随着筛选轮数的增加而不断变化，具体数值表1。
为了尽可能多地捕获适配子，在开始几轮筛选过程中，ssDNA文库和细胞量投放很多；在随后的几轮筛选中，由于高特异性的适配子已经富集，为了提高筛选的严谨性，结合时间由30min减少到20min；模板量也由2μl减少到0.5μl；然而PCR循环数却由原来的11个循环增加到16个循环；具体数值见表1。
表113轮筛选所加细胞、ssDNA文库、结合时间、PCR循环数和模板量表

2.3.3  PCR扩增产物电泳鉴定
用含有浓度0.25μl EB的3％的琼脂糖凝胶，将每轮筛选产物的PCR产物中，取5-10μl上样于80V，进行电泳，30min后取出凝胶，用凝胶图像分析系统(Syngene ChemiGenius 2)观察并照相。
2.3.4  PCR扩增产物纯化
PCR产物用UNIQ-10柱式PCR产物回收试剂盒纯化。
实验过程中，我们发现退火温度对PCR反应结果影响很大：本实验最佳退火温度为45℃；当退火温度在40-65℃时，3％琼脂糖凝胶电泳有目的条带；退火温度低于40℃时，有大于目的条带的片段出现；退火温度高于65℃时，无任何PCR反应产物。
另外，模板含量和循环次数对反应结果影响也很大：每轮SELEX筛选的模板含量和循环次数都各不相同。模板含量一定，循环次数过少，无目的条带，循环次数过多，则出现梯状条带且有拖尾现象，结果如图1所示；模板含量过少，适当增加循环也可获得目的条带；模板含量过多反而无目的条带。其他因素如引物浓度、dNTP浓度、Mg²⁺离子浓度等在扩增过程中也有一定的影响。
电泳条带随SELEX筛选轮数的增加逐渐变细变致密，结果如图2所示。
2.3.5  磁珠分离制备次级文库
取100μl磁珠于1.5ml微量离心管中置磁力架1～2min，吸弃上清；拿下微量离心管，加入100ul 2×洗涤缓冲液重悬磁珠；重置磁力架1～2min，吸弃洗涤缓冲液，加入200μl 2×洗涤缓冲液，再加入200μl生物素化的dsDNA 37℃水浴15min；上磁力架1～2min，吸弃上清；用200μl1×洗涤缓冲液冲洗2～3次；加入50μl150mM NaOH于37℃水浴15min，使dsDNA解链；上磁力架，含生物素的一条ssDNA仍留在链霉亲和素磁珠上并吸附于管壁，而另一条不含生物素的ssDNA则存在于上清中，分离出上清中的ssDNA并测定A值，此即为下一轮筛选的ssDNA库。
2.3.6  正常人中性粒细胞的提取
本实验材料均取自兰州大学第一医院健康查体人群，与所有实验对象签署知情同意书后，抽取空腹静脉血2ml，并用人中性粒细胞提取液(购自西安舟鼎国生物技术有限公司)从血液中提取中性粒细胞，按照说明书步骤进行。
2.3.7  用中性粒细胞进行反筛
为了加快筛选的速度，并有效地提高适配子的特异性，本实验用中性粒细胞做反筛，步骤如下：
(1)将磁珠分离得到的ssDNA库99℃加热5min进行变性，然后立即置于0℃10min；
(2)将1×10⁶个从血液中提取的中性粒细胞，去上清后加入上述溶液，加入选择缓冲液400μl 37℃水浴30min；
(3)将混合液3000rpm离心2min，取上清，用于下一轮SELEX筛选。
2.3.8  ssDNA文库与K562细胞亲和力的测定
1-13轮SELEX筛选的产物，用标记地高辛的引物P3和标记生物素的引物P4进行PCR扩增，电泳鉴定目的条带清楚的PCR产物用试剂盒纯化，然后与K562细胞充分反应并用150mM NaOH解链，地高辛标记的ssDNA游离在上清中，测定ssDNA含量。
按ssDNA∶K562细胞＝500pmol∶1×106个在400μl 2×结合缓冲液中结合，离心，弃上清，加入100μl 1∶15000稀释的抗地高辛抗体标记的碱性磷酸酶，反应10min，离心，弃上清，用500μl1×结合缓冲液悬浮K562细胞后，离心，弃上清，重复洗涤3次，洗去未与抗地高辛抗体结合的碱性磷酸酶，以底物显色，终止反应后用酶联仪于405nm测定A值(三次试验取平均值)。结果如图3表示。
2.4  克隆、测序及结构分析
2.4.1  制备感受态大肠杆菌DH5α细胞
(1)从大肠杆菌DH 5α平板上挑选单个菌落接种于含2ml LB液体培养基的试管中，37℃摇床振摇培养过夜；
(2)次日，取0.5ml浑浊菌液转移到一个含有50ml LB液体培养基的锥形瓶中，37℃摇床振摇2～3h，使菌液的OD₆₀₀≤0.4～0.5；
(3)将菌液转移到50ml的离心管中，立即冰上放置10min；
(4)0～4℃，4000rmp离心10min，使细胞沉淀，回收细胞；
(5)倒出离心管中的培养液，将离心管倒置于一灭菌的滤纸上1min，以尽量流尽培养液；
(6)用冰冷的0.1M的CaCl₂10ml悬浮沉淀，立即放冰上保温30min；
(7)0～4℃，4000rmp离心10min，使细胞沉淀，回收细胞；
(8)倒出离心管中的液体，将离心管倒置于一灭菌的滤纸上1min，以尽量流尽残留液体；
(9)用冰预冷的0.1M的CaCl₂2ml悬浮细胞，制成感受态细胞；
(10)迅速将悬液分装到无菌的Eppendorf管中，每管200μl。
2.4.2  感受态大肠杆菌DH5α转化率的测定
(1)将0.5μg/μl的pGEM-T质粒1∶100稀释后待用(pGEM-T质粒浓度稀释为5ng/μl)；
(2)向上述分装好感受态细胞的Eppendorf管加入稀释的pGEM-T质粒1μl，吹打混匀，置冰上30min；；
(3)将Eppendorf管放到42℃水浴90s；
(4)将Eppendorf管冰上放置2min；
(5)加入800μl的LB液体培养基，37℃慢摇培养1h；
(6)将管中的转化反应用培养液作1∶10的稀释(其中的pGEM-T质粒浓度为2.5ng/ml)，取其中100μl的稀释液加到已含有适当Amp的LB固体培养基的培养皿中，用无菌的玻璃涂布器将转化菌均匀铺在琼脂板表面；
(7)将平板置于室温0.5h以使液体能被吸收；
(8)倒置平板于37℃培养16h，进行菌落计数；
(9)按照下式计算转化率：
转化率＝产生菌落的总数/铺板DNA的总量。例如：用0.1ng完整的质粒DNA转化100μl的感受态细胞，向转化反应液中加入900μl培养液(0.1ng/1ml)，让细菌恢复一段时间(1h)。将转化反应用培养液作1∶10的稀释(0.01ng/ml)，取其中100μl的稀释液来涂布(0.001ngDNA/100μl)。如能获得200个克隆，转化效率是2×10⁸cfu/ugDNA，计算方法如下：
200cfu/0.001ng＝2×10⁵cfu/ng＝2×10⁸cfu/ugDNA
转化效率1×10⁶cfu/μgDNA可满足普通的亚克隆实验；1×10⁷cfu/μgDNA用于作更复杂的亚克隆。结果如图4显示。
2.4.3  筛选产物扩增和胶回收纯化
经11轮筛选得到的ssDNA，用引物1和引物5经PCR扩增成dsDNA，再用胶回收试剂盒回收DNA，按说明书操作步骤进行。
2.4.4  PCR纯化产物的连接反应
(1)DNA分子摩尔质量计算方法：
DNA分子摩尔数(pmol)＝DNA分子质量(ng)×1000/(660×DNA分子的bp数)
(2)PCR胶回收产物通过3％琼脂糖凝胶电泳估量约为10ng/μl。
(3)按1∶3、1∶5、1∶8比例在微量离心管中加入以下成分：

将上述物质混合均匀，4℃放置过夜。
2.4.5  连接产物的转化及Amp和α互补筛选
(1)向上述分装好感受态细胞的Eppendorf管加入连接反应液10μl，吹打混匀，置冰上30min；
(2)将Eppendorf管放到42℃水浴90s；
(3)将Eppendorf管冰上放置2min；
(4)向各管加入800μl的LB液体培养基，37℃慢摇培养1h；
(5)将以上各管取转化反应用培养液取100μl，分别涂布到IPTG/X-gal/Amp的LB平板上；
(6)将平板置于室温0.5h以使液体能被吸收；
(7)倒置平板于37℃培养16h；
(8)取出培养皿在4℃放置6h，使蓝色充分显现，观察结果如图5。
2.4.6  挑选单克隆菌液测序
次日取出培养皿，随机挑选24个菌落接种于3ml含Amp的LB液体培养基中，37℃摇菌过夜，分别吸取转化菌液1ml加入离心管中，每管加入30μl灭菌甘油，颠倒混匀、封膜后送上海生工生物技术有限公司采用载体的通用测序引物(T7引物)鉴定并测序。剩余菌液加入100μl灭菌甘油，颠倒混匀后置-80℃冰箱冻存。
2.4.7  适配子一级结构和二级结构分析
用DNAMAN软件对随机区序列进行分析发现无同源序列，但可分为6个家族(family)：家族1含有保守序列ACCAG，家族2含有保守序列ACCGG，家族3含有保守序列CCCGC，家族4含有保守序列CTCC，家族5含有保守序列AAGTT。家族6共10个，无保守序列。
结果如下：
Family 1
1  N18--CACCACGAGGAACTTCCCGCAAACCAGCAGATGTGACACGCATAGGTCCT--N18
2  N18--ACCAGATAGTAAGTGCAATCTATACCAGCTTATTCAATTGGC--N18
9  N18--ATCGTTTTTAAGAGAATGAGAGGTGGGGCGCGTCCACCAGGCCTAAGTCGG--N18
Family 2
6  N18--CGCGGCGGAATCCCCCGGAGCACCGGAACGGGCGGGAATCTGGCCACTGCTCG--N18
7  N18--GGTCGGGGCAGTCCTCGTAACACCGGACTGGGCGGGAATGACCTCTCTGTTC--N18
17 N18--TAGGAGTGGGACCGGTACAAAAAAATATAACCCACTCAATATAATGCCTCAT--N18
Family 3
10  N18--CCCGCTGCTTCGGCTCCCCACTCCGCACTGTGTTACTGCCTTAGTCTACTTG--N18
16  N18--ACTGACCCGCCTGGAGAGATCTCGTCCCAGTTGCAAACCTAACGTCGATTAT--N18
22  N18--GAGCTTCCCCCGCGAGACCGTTAGCGACGTCAATTGGAGTCTATTCACCAGA--N18
Family 4
5   N18--CCGCCCGGTCAGCATCTCTTCCCAACCTATTTTCACTGTGTGGCTCCCTATC--N18
11  N18--ACCTGGTCCTACCCTCTTTACTGGATCAGTCCTCCGCCGAGTATTTTTTGTG--N18
24  N18--AGTTCGGCTCAGAAGGGGTGCTAGCTCCGGGTGTAGCCGGACGCGTGACCGT--N18
Family 5
12  N18--GGCAAGGAAATTCACTCATGGAGTATGTGGAAGTTAAGACGGTTCCGGGGCG--N18
19  N18--CCGTCCAAGTTTTCTACTTCCGTTTAGCAAGTCAATGTTGCGTTGTCTCTG--N18
Family 6
3   N18-AGTTCGGCTCAGAAGGGGTGCTAGCTCCGGGTGTAGCCGGACGCGTGACCGT--N18
4   N18-GAGCTTCCCCCGCGAGACCGTTAGCGACGTCAATTGGAGTCTATTCACCAGA--N18
8   N18-GCCGTCCAAGTTTTCTACTTCCGTTTAGCAAGTCAATGTTGCGTTGTCTCTG--N18
13  N18-GCACCACGAGGAACTTCCCGCAAACCAGCAGATGTGACACGCATAGGTCCT--N18
14  N18-GGTCGGGGCAGTCCTCGTAACACCGGACTGGGCGGGAATGACCTCTCTGTTC--N18
15  N18-CCGCCCGGTCAGCATCTCTTCCCAACCTATTTTCACTGTGTGGCTCCCTATC--N18
18  N18-CCCGCTGCTTCGGCTCCCCACTCCGCACTGTGTTACTGCCTTAGTCTACTTG--N18
20  N18-ACCTGGTCCTACCCTCTTTACTGGATCAGTCCTCCGCCGAGTATTTTTTGTG--N18
21  N18-CATCGTTTTTAAGAGAATGAGAGGTGGGGCGCGTCCACCAGGCCTAAGTCGG--N18
23  N18-GGCAAGGAAATTCACTCATGGAGTATGTGGAAGTTAAGACGGTTCCGGGGCG--N18
对所有序列用DNAMAN软件进行最低能量二级结构分析，结果显示：所有寡核苷酸适配子的二级结构主要是由茎环和凸环结构组成的，分为以下5类：A类：随机序列与3’端形成几个小茎环，树杈样分布，基底部与5’端形成的大凸环相连；B类：5’端与随机序列形成几个小茎环，分两支与3’端形成的大凸环相连；C类：5’端、3’端和随机序列分别形成一个小茎环，各自连接在一个大凸环上；D类：5’端、3’端和随机序列形成4个小茎环，各自连接在一个大凸环上；E类：5’端、3’端和随机序列形成多个小茎环复杂排列，无凸环结构。具体的二级结构预测图如图6。
2.5  24个克隆适配子与靶细胞亲和力的测定
取-80℃冰箱冻存的测序之转化菌，经质粒抽提、PCR扩增、纯化后测定其与慢性粒细胞白血病K562细胞的亲和力。
2.5.1  各克隆菌质粒抽提
用质粒提取试剂盒的说明书操作步骤进行。
2.5.2  PCR扩增及扩增产物纯化
将上述质粒抽提产物用标记荧光素和生物素的引物进行PCR扩增，取PCR产物凝胶电泳观察看是否有明亮清晰的目的条带，若条带明亮清晰，则进一步纯化PCR产物，方法同2.2.4。
PCR反应体系如下：

2.5.3  荧光强度-ssDNA浓度标准曲线的制备
将标准品(5’-FITC-88nt-3’)用选择缓冲液稀释为800ng/ml、666.7ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml 9管不同浓度的溶液，测定各管的荧光强度(测三次取平均值)，绘出荧光强度-ssDNA浓度标准曲线。
2.5.4  荧光素标记的ssDNA的制备
2.4.2中PCR产物一条链5’端含荧光素，另一条链5’端含生物素。利用生物素-链霉亲和素磁珠将dsDNA解链为ssDNA。含生物素的一条ssDNA仍留在链霉亲和素磁珠上并吸附于管壁，而另一条带荧光素的ssDNA存在于上清中，分离出上清中ssDNA并用荧光分光光度计测定其荧光强度，从标准曲线查得其荧光强度对应的ssDNA的含量，此即测定结合率的纯适配子库。
2.5.5  各克隆适配子与靶细胞和中性粒细胞结合率的测定
按荧光素标记的ssDNA∶慢性粒细胞性白血病K562细胞＝50pmol∶1×10⁶个慢性粒细胞性白血病K562细胞的比例进行结合反应，将二者在选择缓冲液中结合30min，更换离心管，离心，吸取上清测定荧光强度；用选择缓冲液重悬慢性粒细胞性白血病K562细胞后离心，吸取上清，测定荧光强度，重复洗涤2次，洗去未与慢性粒细胞性白血病K562细胞结合的荧光素-ssDNA。根据各管洗涤上清的荧光强度从标准曲线查得其对应的浓度，乘体积得到ssDNA的量，再将各管的量相加，即为未结合到慢性粒细胞性白血病K562细胞上的ssDNA的总量。将投入总量减去未结合的量即为结合到慢性粒细胞性白血病K562细胞上的ssDNA的量，用结合的量除以总量，计算出结合率；用同样的方法测定其与人正常中性粒细胞的集合率。结果如下表所示：

从上表中看出，各适配子中与靶细胞结合率比较高的是5、10、21、22、24号适配子，其结合率分别为40.6％、45.2％、40.8％、42.2％、41.6％。
2.6  各克隆适配子特异性
通过上表中各适配子与慢性粒细胞白血病K562细胞和中性粒细胞的结合率测定显示结合率高的5、10、21、22、24号适配子都有较高的特异性，与正常人血液中提取的中性粒细胞的结合率明显降低，分别仅为2.9％、2.8％、3.0％、2.5％、2.7％，由此证明此5种适配子具有较高的特异性。
适配子一级结构测序结果表

SEQUENCE LISTING
<110>兰州大学
<120>检测慢性粒细胞白血病的单链DNA适配子及其制备方法
<130>检测慢性粒细胞白血病的单链DNA适配子及其制备方法
<160>5
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>88
<212>DNA
<213>白血病细胞
<400>1
ataccagctt attcaattcc gcccggtcag catctcttcc caacctattt tcactgtgtg    60
gctccctatc agatagtaag tgcaatct                                       88
<210>2
<211>88
<212>DNA
<213>白血病细胞
<400>2
ataccagctt attcaattcc cgctgcttcg gctccccact ccgcactgtg ttactgcctt    60
agtctacttg agatagtaag tgcaatct                                       88
<210>3
<211>88
<212>DNA
<213>白血病细胞
<400>3
ataccagctt attcaattca tcgtttttaa gagaatgaga ggtggggcgc gtccaccagg    60
cctaagtcgg agatagtaag tgcaatct                                       88
<210>4
<211>88
<212>DNA
<213>白血病细胞
<400>4
agattgcact tactatctga gcttcccccg cgagaccgtt agcgacgtca attggagtct    60
attcaccaga aattgaataa gctggtat                                       88
<210>5
<211>88
<212>DNA
<213>白血病细胞
<400>5
agattgcact tactatctag ttcggctcag aaggggtgct agctccgggt gtagccggac    60
gcgtgaccgt aattgaataa gctggtat                                       88