鸡白痢－伤寒沙门氏菌PCR检测方法及其中的核酸和引物对.pdf

一种食品安全检验技术领域的鸡白痢-伤寒沙门氏菌PCR检测方法及其中的核酸和引物对；该方法包括如下步骤：根据序列SEQ?ID?NO：1设计扩增引物；提取样品DNA，PCR法扩增；凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有鸡白痢-伤寒沙门氏菌；所述判断具体为：如果电泳结果出现相应的单一扩增条带，则说明样品中含有鸡白痢-伤寒沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条，则样品中不含该菌；本发明还涉及一种核酸，其碱基序列如SEQID?NO：1所示；本发明还涉及一种引物对，具体为碱基序列如SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3所示的核酸。采用本发明的检测方法检测鸡白痢-伤寒沙门氏菌，检测时间短，成本低，更加具有实用性，检测结果特异，结果判定简单。

1.  一种鸡白痢-伤寒沙门氏菌血清型PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，根据鸡白痢-伤寒沙门氏菌的基因组DNA序列中的保守序列SEQ ID NO：1设计扩增引物；
步骤二，提取样品DNA，PCR法扩增；
步骤三，凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有鸡白痢-伤寒沙门氏菌；所述判断具体为：如果电泳结果出现相应的单一扩增条带，则说明样品中含有鸡白痢-伤寒沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条，则样品中不含有鸡白痢-伤寒沙门氏菌。

2.  根据权利要求1所述的鸡白痢-伤寒沙门氏菌血清型PCR检测方法，其特征是，步骤一中，所述引物具体为：正向引物SEQ ID NO：2和反向引物SEQ ID NO：3。

3.  根据权利要求1所述的鸡白痢-伤寒沙门氏菌血清型PCR检测方法，其特征是，步骤二中，所述PCR法中，PCR检测体系具体为：25μL反应体系具体为，10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg2+2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 1.0μL，5μM引物对1μL，Taq酶1U，模板溶液取2～5μL，最后补水至25μL。

4.  根据权利要求1所述的鸡白痢-伤寒沙门氏菌血清型PCR检测方法，其特征是，步骤二中，所述PCR法中，PCR检测体系参数具体为：先94℃预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s；循环共35个；循环结束后，72℃延伸10min，降温至12℃，结束。

5.  根据权利要求1所述的鸡白痢-伤寒沙门氏菌血清型PCR检测方法，其特征是，步骤三中，所述判断具体为：检测凝胶电泳检测扩增产物在231bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，则说明样品中含有鸡白痢-伤寒沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条，则样品中不含有鸡白痢-伤寒沙门氏菌。

6.  一种如权利要求1所述的鸡白痢-伤寒沙门氏菌PCR检测方法中的核酸，其特征在于，该核酸的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

7.  一种如权利要求1所述的鸡白痢-伤寒沙门氏菌PCR检测方法的引物对，其特征在于，该引物对具体为碱基序列分别如SEQ ID NO：2所示和如SEQ ID NO：3所示的核酸。

鸡白痢—伤寒沙门氏菌PCR检测方法及其中的核酸和引物对
技术领域
本发明涉及一种食品安全检验技术领域的PCR检测方法及其中的核酸和引物对，具体是一种鸡白痢-伤寒沙门氏菌PCR检测方法及其中的核酸和引物对。
背景技术
鸡沙门氏菌病是由沙门氏菌属的某些致病性沙门氏菌引起的鸡的细菌性传染病，一般分为鸡白痢、鸡伤寒和副伤寒三种病型，其中以鸡白痢和鸡伤寒发病较多，危害较强。鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌血清型(Salmonella Gallinarum)感染鸡群引起的，主要是侵害雏鸡，2周以下的雏鸡发病后死亡率可达40～70％，受感染的雏鸡在4～7天死亡，急性时可在1～3天死亡。鸡伤寒沙门氏菌血清型(Salmonella Pullorum)感染鸡群可引起鸡伤寒病症，主要是感染成年鸡，雏鸡有时也会被感染，出壳后几天开始发病，死亡率较高。近年来，这两种致病菌被归为一个种，统称为鸡白痢-伤寒沙门氏菌(SalmonellaGallinarum-Pullorum)，主要是存在于卵巢、睾丸、肝脏等器官中，可由感染的父母代鸡传染给雏鸡。控制鸡沙门氏菌病最有效的措施是严格的管理和根除计划。因此，鉴定和清除感染的父母代鸡群至关重要。目前，有许多关于沙门氏菌的PCR检测方法应用于检疫的报道，虽然积极推动了鸡沙门氏菌病的防治，但是只针对血清型鸡白痢-伤寒沙门氏菌的PCR检测的靶点及引物的研究报道几乎没有，因而也没有有关针对鸡白痢-伤寒沙门氏菌血清型检测的PCR方法建立的报道。
经对现有技术的文献检索发现，长期以来，我国主要是通过使用玻片凝集试验检测鸡白痢-伤寒沙门氏菌的抗体来鉴定病鸡，正如徐耀辉、焦新安、李求春等在《中国兽医科技》2005年第36卷第8期第661～664页发表的“部分省市鸡白痢和鸡伤寒的单抗阻断ELISA血清学调查”文中所述，该方法敏感性有限，依据抗原质量不同常常出现不稳定结果。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种鸡白痢-伤寒沙门氏菌PCR检测方法及其中的核酸和引物对。采用本发明的检测方法检测鸡白痢-伤寒沙门氏菌，检测时间短，成本低，更加具有实用性，检测结果特异，结果判定简单。
本发明是通过以下的技术方案实现的，
本发明涉及一种鸡白痢-伤寒沙门氏菌PCR检测方法，包括如下步骤：
步骤一，根据鸡白痢-伤寒沙门氏菌的基因组DNA序列中的保守序列SEQ ID NO：1设计扩增引物；
步骤二，提取样品DNA，PCR法扩增；
步骤三，凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有鸡白痢-伤寒沙门氏菌；所述判断具体为：如果电泳结果出现相应的单一扩增条带，则说明样品中含有鸡白痢-伤寒沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有鸡白痢-伤寒沙门氏菌。
步骤一中，所述引物具体为：正向引物SEQ ID NO：2和反向引物SEQ ID NO：3。
步骤二中，所述PCR法中，PCR检测体系具体为：25μL反应体系具体为，10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg²⁺2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 1.0μL，5μM引物对1μL，Taq酶1U，模板溶液取2～5μL，最后补水至25μL。
步骤二中，所述PCR法中，PCR检测体系扩增参数具体为：先94℃预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s；循环共35个；循环结束后，72℃延伸10min，降温至12℃，结束。
步骤三中，所述判断具体为：检测凝胶电泳检测扩增产物在231bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，则说明样品中含有鸡白痢-伤寒沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有鸡白痢-伤寒沙门氏菌。
本发明还涉及一种所述PCR检测方法中涉及的核酸，该核酸的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还涉及一种所述PCR检测方法中涉及的引物对，该引物对具体为碱基序列分别如SEQ ID NO：2所示和如SEQ ID NO：3所示的核酸。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：采用本发明的检测方法检测鸡白痢-伤寒沙门氏菌，检测时间短，由于不用采用传统检测方法中必须使用的抗血清，降低了检测成本；同时，本发明的检测方法也可以用于检测某些抗血清不能检测出的菌株，如抗原不表达的菌株，弥补免疫检测的缺陷，更加具有实用性；本发明的检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，结果判定简单。
附图说明
图1为实施例1中PCR检测方法特异性评价实验结果；
图2为实施例1中PCR检测方法灵敏度评价实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
鸡白痢-伤寒沙门氏菌血清型PCR检测方法的建立
通过生物信息学分析，从鸡白痢-伤寒沙门氏菌基因组DNA序列中找到共有的特异基因SG1046和SG1047(SEQ ID NO：1)，将之作为鸡白痢-伤寒沙门氏菌的检测靶基因。
将基因SG1046和SG1047的DNA序列输入到引物设计软件Primer Premier 5.0中设计引物，设置GC％范围为40～60％，产物大小范围为100～500bp，从备选引物对中选择出引物对SG5-L/R作为鉴定引物(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，引物序列如下：
SG5-L：5’-TTATGTTACGGGACGAGTG-3’(SEQ ID NO：2)；
SG5-R：5’-CAAGACTCCCTGCCCTAT-3’(SEQ ID NO：3)；
步骤二，DNA模板制备
将鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鸡白痢-伤寒沙门氏菌等各种血清型的沙门氏菌菌株(如表1所示)分别接菌至50mL的LB液体培养基中，在37℃增菌8h后，取1mL菌液，放入1.5mL离心管中；
之后在3,000r/min离心10min，取上清液，再在12,000r/min离心5min，收集菌体。用无菌双蒸水重新悬浮菌体，离心洗涤后加入100μL无菌超纯水，在沸水浴中煮15min，立即取出，在-20℃放置30min。在37℃解冻后，12,000r/min离心5min，取上清液放置-20℃备用。
步骤三，PCR检测方法特异性评价实验
PCR检测方法如下：先加入16.1μL无菌水到反应管中，再依次加入10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg²⁺2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 1.0μL，5μM引物1.0μL，2.5U/μL Taq酶0.4μL，最后加模板溶液2μL，并以无菌水为模板作为反应的阴性对照。然后将反应管离心后，放入PCR反应仪中，按照以下PCR循环参数进行：在94℃预变性5min，接着作35个循环，每个循环的程序包括94℃变性30s，退火温度60℃，退火时间为30s，然后在72℃延伸30s，循环结束后在72℃延伸10min，最后降温至12℃，结束所有操作程序。
表1特异性评价所用菌株及试验结果


表1中，- ：PCR结果为阴性；+：PCR结果为阳性。
16株鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鸡白痢-伤寒沙门氏菌等沙门氏菌标准菌株和31株分离株(如表1所示，表中所示菌株均为本领域的技术人员可通过公开的渠道获得的)按照DNA模板制备的方法分别提取基因组DNA。每株菌株的DNA溶液均取2μL作为PCR反应模板添加到PCR反应体系中进行扩增反应。
图1中显示了标准菌株的检测结果，其血清型及菌株编号请参见附图说明。图中：泳道1～16：AS1.1190，CMCC 50004，CMCC 50017，CMCC 50335，AS1.1174，ATCC 14028，ATCC13076，ATCC 7001，ATCC 15611，ATCC 9150，ATCC 9270，NCTC 4840，ATCC 12002，ATCC51812，NCTC 6017，CMCC 50770；泳道17：ddH₂O；泳道M：200bp分子量标准。从图1可以看出除了鸡白痢-伤寒沙门氏菌的标准菌株CMCC50770外，其余沙门氏菌均没有特异扩增条带，说明引物对SG5-L/R的特异性很好。表1为16株标准菌株及31株分离菌株的PCR鉴定结果，从表1中可知，除了鸡白痢-伤寒沙门氏菌的1株标准菌株CMCC50770和3株分离株外，其余沙门氏菌均没有特异扩增条带。
步骤五，灵敏度评价试验
经测定，鸡白痢-伤寒沙门氏菌总DNA溶液的浓度为68.6μg/mL，用无菌水作10倍梯度稀释，共稀释10个梯度，每个梯度分别取5μL加入PCR反应体系，凝胶电泳检测扩增结果；结果如图2所示，图中：泳道1～10：DNA模板浓度分别为34.3ng，3.43ng，343pg，34.3pg，3.43pg，343fg，34.3fg，3.43fg，0.343fg，0.034fg/反应；泳道M：200 bp分子量标准。由图2可知，在第7条泳道可以看到清晰的条带，所对应DNA浓度为34.3fg/PCR，而第8条泳道之后看不到扩增条带。因此，判定PCR检测灵敏度为34.3fg/PCR，具有较高的灵敏度。
实施例2
沙门氏菌疑似菌株的检测
利用建立的鸡白痢-伤寒沙门氏菌的PCR检测体系，检测了44株从鸡粪中分离的沙门氏菌疑似菌株，样品采集于上海市城郊5个鸡场，鸡粪样品的处理及疑似菌株的分离参见国标GB/T 4789.4-2008。从中检测出11株疑似菌株呈阳性结果，这11株疑似菌株经沙门氏菌属诊断血清(兰州生物制品研究所)鉴定是O9:H-:-，判定其为鸡白痢-伤寒沙门氏菌(血清鉴定步骤请参见产品说明书及国标GB4789.4-1994)。其他疑似菌株经鉴定都不是鸡白痢-伤寒沙门氏菌。通过本实施例证明，鸡白痢-伤寒沙门氏菌沙门氏菌的血清型PCR检测方法具有非常高的可靠性。
序列表
<110>上海交通大学
<120>鸡白痢-伤寒沙门氏菌PCR检测方法及其中的核酸和引物对
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1460
<212>DNA
<213>鸡白痢-伤寒沙门氏菌
<400>1
gtggtgttcc cggcagggct ggtgaggcgg ctggacagcc tggaggcaga gctgcgggcg     60
gggagagtga gcagtgagag ccgtgcatgg ctggcgcagt gcggactgac ggcggagcag    120
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tatctaactg ttctaaataa                                              1460
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ttatgttacg ggacgagtg                                               19
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
caagactccc tgccctat                                                18