婴儿沙门氏菌PCR检测方法及其中的核酸和引物对.pdf

一种食品安全检验技术领域的婴儿沙门氏菌PCR检测方法及其中的核酸和引物对；该检测方法包括如下步骤：根据婴儿沙门氏菌的基因组DNA序列中的保守序列SEQ?ID?NO：1设计扩增引物；提取样品DNA，PCR法扩增；凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有婴儿沙门氏菌；所述判断具体为：如果电泳结果出现相应的单一扩增条带，则说明样品中含有婴儿沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有婴儿沙门氏菌。本发明还涉及一种核酸，其碱基序列如SEQ?ID?NO：1所示；本发明还涉及一对引物，具体为碱基序列如SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：3所示的核酸。采用本发明的检测方法检测婴儿沙门氏菌，检测时间短，成本低，检测结果特异，结果判定简单。

1.  一种婴儿沙门氏菌PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，根据婴儿沙门氏菌的基因组DNA序列中的保守序列SEQ ID NO：1设计扩增引物；
步骤二，提取样品DNA，PCR法扩增；
步骤三，凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有婴儿沙门氏菌；所述判断具体为：如果电泳结果出现相应的单一扩增条带，则说明样品中含有婴儿沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有婴儿沙门氏菌。

2.  根据权利要求1所述的婴儿沙门氏菌PCR检测方法，其特征是，步骤一中，所述引物具体为：正向引物的序列如SEQ ID NO：2所示和反向引物的序列如SEQ IDNO：3所示。

3.  根据权利要求1所述的婴儿沙门氏菌PCR检测方法，其特征是，步骤二中，所述PCR法中，PCR检测体系具体为：25μL反应体系具体为，10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg2+2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 1.0μL，5μM引物对1μL，Taq酶1U，模板溶液取2～5μL，最后补水至25μL。

4.  根据权利要求1所述的婴儿沙门氏菌PCR检测方法，其特征是，步骤二中，所述PCR法中，PCR检测体系扩增参数具体为：先94℃预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s；循环共35个；循环结束后，72℃延伸10min，降温至12℃，结束。

5.  根据权利要求1所述的婴儿沙门氏菌PCR检测方法，其特征是，步骤三中，所述判断具体为：检测凝胶电泳检测扩增产物在197bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，则说明样品中含有婴儿沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有婴儿沙门氏菌。

6.  一种根据权利要求1所述的婴儿沙门氏菌PCR检测方法中的核酸，其特征在于，该核酸的的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

7.  一种根据权利要求1所述的婴儿沙门氏菌PCR检测方法中的引物对，其特征在于，该引物对具体为如碱基序列分别如SEQ ID NO：2所示和如SEQ ID NO：3所示的核酸。

婴儿沙门氏菌PCR检测方法及其中的核酸和引物对
技术领域
本发明涉及一种食品安全检验技术领域的检测方法及其中的核酸和引物对，婴儿沙门氏菌PCR检测方法及其中的核酸和引物对。
背景技术
婴儿沙门氏菌(Salmonella Infantis)是引起新生儿及婴幼儿感染的主要沙门氏菌血清型之一，是在1943年由Wheele和Borman首次发现。婴儿沙门氏菌的主要传染源为动物(禽类为主)、食物和带菌人群等，可以通过食物、环境等途径，经口腔侵染到健康人体，在其肠道繁殖，侵袭肠壁粘膜，引起肠炎、痢疾、败血症等疾病。婴儿沙门氏菌感染没有严格的季节性，四季均可发病，其在污染环境中具有很强的抵抗力，能存活数个月，因而会造成新生儿及婴幼儿反复感染，不易消灭。婴儿沙门氏菌的检测主要是通过国标规定的传统培养的方法(可参见国标GB/T 4789.4-2008)。正如邹静波、程跃、郑显奇在《检验医学与临床》2008年第5卷第1期第62～63页发表的题为“一起由婴儿沙门菌引起食物中毒的实验室分析”一文，文中提及如下内容：该方法需经选择性增菌培养，并结合生化反应、血清学测试等试验来鉴定，虽然结果可靠，但是操作复杂，检测时间长，通常要3～5天才能鉴定出结果，不利于及时诊断病因，查找病源，控制病情的蔓延。为了能够快速、准确、简便的检验婴儿沙门氏菌，以分子生物学为基础的检测鉴定方法在实践检验中不断取得新进展，成为取代传统检测方法最具潜力的检测方法之一，其中，PCR以其敏感、特异、简便、快速的特点成为在分子生物学水平建立的重要检测技术之一。
目前，国外用于婴儿沙门氏菌血清型PCR检测的靶基因主要是来自编码沙门氏菌H抗原的鞭毛基因flic C和fl jB，如Kardos G，Farkas T，Antal M等在《Letters in AppliedMicrobiology》(应用微生物学快报)2007年第45卷第4期第421～425页发表的题为《NovelPCR assay for identification of Salmonella enterica serovar Infantis》(鉴定婴儿沙门氏菌的新PCR方法)一文中所述。然而，由于沙门氏菌抗原的多态性及其编码基因的复杂，不易找到适合的靶基因及检测引物对，而且对于一些与婴儿沙门氏菌有相似抗原结构的血清型菌株，需要结合其他相关的基因组成多重PCR才能判定，增加了检测的复杂性。
经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的婴儿沙门氏菌血清型PCR检测方法、核酸及引物有关的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种婴儿沙门氏菌PCR检测方法及其中的核酸和引物对。采用本发明的检测方法检测婴儿沙门氏菌，检测时间短，成本低，更加具有实用性，检测结果特异，结果判定简单。
本发明是通过以下的技术方案实现的，
本发明涉及一种婴儿沙门氏菌PCR检测方法，包括如下步骤：
步骤一，根据婴儿沙门氏菌的基因组DNA序列中的保守序列SEQ ID NO：1设计扩增引物；
步骤二，提取样品DNA，PCR法扩增；
步骤三，凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有婴儿沙门氏菌；所述判断具体为：如果电泳结果出现相应的单一扩增条带，则说明样品中含有婴儿沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有婴儿沙门氏菌。
步骤一中，所述引物具体为：正向引物的序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物如SEQ IDNO：3所示。
步骤二中，所述PCR法中，PCR检测体系具体为：25μL反应体系具体为，10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg²⁺2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 1.0μL，5μM引物对1μL，Taq酶1U，模板溶液取2～5μL，最后补水至25μL。
步骤二中，所述PCR法中，PCR检测体系扩增参数具体为：先94℃预变性5min，之后开始扩增循环，每个循环的程序为：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s；循环共35个；循环结束后，72℃延伸10min，降温至12℃，结束。
步骤三中，所述判断具体为：检测凝胶电泳检测扩增产物在197bp位置是否存在单一扩增条带，如果存在，则说明样品中含有婴儿沙门氏菌；如果没有出现相应的单一扩增条带，则样品中不含有婴儿沙门氏菌。
本发明还涉及一种所述PCR检测方法中涉及的核酸，该核酸的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还涉及一种所述PCR检测方法中涉及的引物对，该引物对具体为碱基序列分别如SEQ ID NO：2所示和如SEQ ID NO：3所示的核酸。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：采用本发明的检测方法检测婴儿沙门氏菌，检测时间短，由于不用采用传统检测方法中必须使用的抗血清，降低了检测成本；同时，本发明的检测方法也可以用于检测某些抗血清不能检测出的菌株，如抗原不表达的菌株，弥补免疫检测的缺陷，更加具有实用性；本发明的检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，结果判定简单。
附图说明
图1为实施例1中PCR检测方法特异性评价实验凝胶电泳结果图；
图2为实施例1中PCR检测方法灵敏度评价实验凝胶电泳结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
婴儿沙门氏菌血清型PCR检测方法的建立
步骤一，根据婴儿沙门氏菌的基因组DNA序列中的保守序列设计扩增引物
从婴儿沙门氏菌基因组DNA序列中找到特异的限制性核酸内切酶基因，将之作为婴儿沙门氏菌的检测靶基因，基因序列如SEQ ID NO：1所示；
将限制性核酸内切酶基因的DNA序列输入到引物设计软件Primer Premier 5.0中设计引物，设置GC％范围为40～60％，产物大小范围为150～300bp，从备选引物对中选择出引物，引物序列如下(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)：
SIN5-L：5’-AGCCAACGCCACCTACTACT-3’(SEQ ID NO：2)；
SIN5-R：5’-TGAACACCATATCCATCCACAT-3’(SEQ ID NO：3)；
步骤二，DNA模板制备
将鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及婴儿沙门氏菌等各种血清型的沙门氏菌菌株(如表1所示)分别接菌至50mL的LB液体培养基中，在37℃增菌8h后，取1mL菌液，放入1.5mL离心管中；
之后，3,000r/min离心10min，取上清液，再在12,000r/min离心5min，收集菌体。用无菌双蒸水重新悬浮菌体，离心洗涤后加入100μL无菌超纯水，在沸水浴中煮15min，立即取出，在-20℃放置30min；37℃解冻后，12,000r/min离心5min，取上清液放置-20℃备用。
步骤三，PCR检测方法特异性评价实验
PCR检测方法如下：先加入16.1μL无菌水到反应管中，再依次加入10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg²⁺2.0μL，2.5mmol/L的dNTP 1.0μL，5μM引物1.0μL，2.5U/μL Taq酶0.4μL，最后加模板溶液2μL，并以无菌水为模板作为反应的阴性对照。然后将反应管离心后，放入PCR反应仪中，按照以下PCR循环参数进行：在94℃预变性5min，接着作35个循环，每个循环的程序包括94℃变性30s，退火温度65℃，退火时间为30s，然后在72℃延伸30s，循环结束后在72℃延伸10min，最后降温至12℃，结束所有操作程序。
取16株鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及婴儿沙门氏菌等沙门氏菌标准菌株及29株分离菌株(如表1所示，表中所示菌株均为本领域的技术人员可通过公开的渠道获得的)，按照DNA模板提取方法，分别提取基因组DNA。每株菌株的DNA溶液均取2μL作为PCR反应模板添加到PCR反应体系中，按前述PCR检测方法进行扩增反应。
图1是沙门氏菌标准菌株的检测结果，其血清型及菌株编号请参见附图说明及表1。图中：泳道1～15：Salmonella Typhimurium AS1.1174，Salmonella Choleraesuis AS1.1190，Salmonella Gallinarum CMCC50770，Salmonella Enteritidis ATCC13076，SalmonellaEnteritidis CMCC50335，Salmonella Paratyphi A ATCC9150，Salmonella Paratyphi BCMCC50004，Salmonella Vellore ATCC15611，Salmonella Anatum ATCC9270，SalmonellaPoona NCTC4840，Salmonella Tallahassee ATCC12002，Salmonella HirschfeldiiCMCC50017，Salmonella Abony NCTC6017，Salmonella Choleraesuis ATCC 7001，Salmonella Typhimurium ATCC 51812；泳道16：ddH₂O；泳道17：Salmonella InfantisATCC 51741；泳道M：200bp分子量标准。从图1中可知，除了鼠伤寒沙门氏菌标准菌株ATCC51744外，其余血清型均没有197bp特异扩增条带。表1为16株标准菌株及29株分离菌株的PCR鉴定结果，从表1中可知，除了1株婴儿沙门氏菌标准菌株ATCC51744及2株分离株外，其余沙门氏菌均没有特异扩增条带。
表1特异性评价所用菌株及试验结果


表1中： -：PCR结果为阴性；+：PCR结果为阳性。
步骤五，灵敏度评价试验
经测定，婴儿沙门氏菌总DNA溶液的浓度为599.96μg/mL，用无菌水作10倍梯度稀释，共稀释10个梯度，每个梯度分别取5μL加入PCR反应体系，凝胶电泳检测扩增产物，在凝胶成像仪中观察凝胶电泳结果。如图2所示，图中：泳道1～10：DNA模板浓度分别为299.83ng，29.983ng，2.998ng，299.83pg，29.983pg，2.998pg，299.83fg，29.983fg，2.998fg，0.29983fg/反应；泳道M：200bp分子量标准。在第8条泳道可以看到清晰的条带，所对应DNA浓度为29.983fg/PCR，而第9条泳道之后看不到扩增条带。因此，判定PCR检测灵敏度为29.983fg/PCR，具有较高的灵敏度。
实施例2
沙门氏菌疑似菌株的检测
利用实施例1的婴儿沙门氏菌血清型PCR检测方法对53株从食品样品中分离的沙门氏菌疑似菌株进行检测，食品样品采集于上海的城郊超市及集贸市场，样品处理及疑似菌株的分离参见国标GB/T 4789.4-2008。
从中检测出2株疑似菌株呈阳性结果，这2株疑似菌株经沙门氏菌属诊断血清(兰州生物制品研究所)鉴定是O7:Hr:5，判定其为婴儿沙门氏菌(血清鉴定步骤请参见产品说明书及国标GB/T 4789.4-2008)，其他疑似菌株经鉴定都不是婴儿沙门氏菌。通过本实施例证明，婴儿沙门氏菌的PCR检测方法具有非常高的可靠性。
序列表
<110>上海交通大学
<120>婴儿沙门氏菌PCR检测方法及其中的核酸和引物对
<160>3
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>692
<212>DNA
<213>婴儿沙门氏菌
<400>1
atgtcagagg cagtgttttt cgtcgagaat gctgaagagt tggcaaaaca gaaaatggat     60
aatattaatc ctgaactttc tgaaaaattc cagcttttaa ttaaatttct ttcaagattt    120
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tttgttgaaa gctacttacg aaaaattaaa ta                                  692
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
agccaacgcc acctactact                                                20
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
tgaacaccat atccatccac at                                             22