利用微生物发酵废弃细胞实现氮源循环利用的方法.pdf

本发明涉及一种利用微生物发酵废弃细胞实现氮源循环利用的方法，包括以下步骤：(1)废弃细胞的预处理；(2)细胞水解液的制备；(3)将细胞水解液作为氮源配制成微生物发酵培养基进行发酵生产。通过本发明提供的利用发酵废弃细胞制得的细胞水解液作为氮源进行微生物的发酵生产，不仅可以减少酵母粉、蛋白胨等昂贵氮源的使用量，并能实现发酵过程中氮源的循环利用，既降低了产品生产成本又减轻了废弃物处理的负担，达到了绿色、环保、节能的社会效益，本发明技术方案有效可行。

1.  一种利用微生物发酵废弃细胞实现氮源循环利用的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)废弃细胞的预处理；
(2)细胞水解液的制备；
(3)将细胞水解液作为氮源配制成微生物发酵培养基进行发酵生产。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的废弃细胞是发酵工业中利用微生物进行发酵生产结束后的菌体细胞。

3.  根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的废弃细胞包括发酵制备乳酸、丁二酸、乙醇所得的废弃细胞。

4.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(1)是指将发酵液采用包括过滤、沉降、沉淀或离心处理后，经过生理盐水或纯水洗涤后得到预处理后的废弃细胞。

5.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)是指采用包括超声破碎、盐溶、酶水解或酸水解制得细胞破碎液后，再经离心得到上清液。

6.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(3)是指根据微生物发酵所需的总氮含量加入与之总氮含量相等的细胞水解液，再进行微生物发酵生产。

7.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(3)还可以包括将细胞水解液与其他营养物质联用步骤，即以细胞水解液实现氮源循环利用的能力达到极限时，选择与少量酵母粉、玉米浆、豆粕粉等其他现有的所有可用于作为发酵培养基的氮源联合使用。

利用微生物发酵废弃细胞实现氮源循环利用的方法
技术领域
本发明具体涉及一种利用微生物发酵废弃细胞实现氮源循环利用的方法，具体是指将发酵废弃细胞水解后作为氮源再次用于发酵以实现微生物发酵中氮源循环利用的方法，属于发酵工程领域。
背景技术
在利用微生物进行发酵生产的过程中，有机氮源作为原料中的主要成分对微生物的生长代谢起到了至关重要的作用。大部分氮源参与微生物细胞的合成，小部分则残留在发酵液中。发酵工业中，通常选择容易被微生物利用的有机氮源，例如酵母粉、蛋白胨或玉米浆等，这些氮源虽然能在最大程度上保证产物的产量及生产效率，然而却价格昂贵。有研究证明，废啤酒酵母、豆粕粉等物质也可作为廉价的有机氮源被细胞利用。
整个发酵过程中，随着细胞活力的降低，发酵也随即终止，细胞便作为废弃物被排放。然而细胞是一个有机体，其体内含有丰富的氨基酸和维生素，是微生物生长代谢所必需的物质。可见若能将废弃细胞作为氮源再次用于微生物发酵，则可以减少酵母粉、蛋白胨等昂贵氮源的使用量，并能实现发酵过程中氮源的循环利用，这样既降低了产品生产成本又减轻了废弃物处理的负担，达到了绿色、环保、节能的社会效益。目前有关废弃细胞的处理多集中在废酵母细胞的综合利用，微生物细胞的灭活处理以及利用废弃微生物治理污水等方面。
发明内容
本发明的技术目的是将废弃细胞水解后作为氮源用于微生物的发酵，达到减少酵母粉、蛋白胨等昂贵氮源的使用量，并实现发酵过程中氮源的循环利用的目的，使得本发明的技术方案既能降低产品生产成本，又能减轻废弃物处理的负担，达到绿色、环保、节能的社会效益。
本发明提出的技术方案为：
一种利用微生物发酵废弃细胞实现氮源循环利用的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)废弃细胞的预处理；
(2)细胞水解液的制备；
(3)将细胞水解液作为氮源配制成微生物发酵培养基进行发酵生产。
本发明所述的废弃细胞可以是发酵工业中所有利用微生物进行发酵生产结束后的菌体细胞，优选发酵制备乳酸、丁二酸、乙醇等所得的废弃细胞；
本发明所述的步骤(1)是指将发酵液采用包括过滤、沉降、沉淀或离心处理后，经过生理盐水或纯水洗涤后得到预处理后的废弃细胞；
本发明所述的步骤(2)是指采用包括超声破碎、盐溶、酶水解或酸水解制得细胞破碎液后，再经离心得到上清液；
本发明所述的步骤(3)是指根据微生物发酵所需的总氮含量加入与之总氮含量相等的细胞水解液，再进行微生物发酵生产；
本发明所述的步骤(3)还可以包括将细胞水解液与其他营养物质联用步骤，是指以细胞水解液实现氮源循环利用的能力达到极限时，选择与少量酵母粉、玉米浆、豆粕粉等其他现有的所有可用于作为发酵培养基的氮源联合使用，以达到最佳发酵效果。
本发明的有益效果在于：
本发明所述的方法，将水解废弃细胞后制备的发酵培养基与对应不同氮源种类，但总氮含量相同，且除氮源以外其他微量元素和营养成分完全相同的常规培养基在完全相同的发酵条件下进行微生物发酵，证明使用该方法配制的培养基完全能达到相同的产物产量和效果，并且使部分氮源得以回收，实现其循环利用。
此外，通过本发明提供的利用发酵废弃细胞制得的细胞水解液作为氮源进行微生物的发酵生产，不仅可以减少酵母粉、蛋白胨等昂贵氮源的使用量，还能实现发酵过程中氮源的循环利用，这既降低了产品生产成本又减轻了废弃物处理的负担，达到了绿色、环保、节能的社会效益。
具体实施方式
以下实施例对本发明做了详细说明，但对本发明的应用并无限制。
实施例1
本实施例在生物法制备丁二酸的过程中实现氮源的循环利用。首先以10g/L酵母粉为氮源进行厌氧发酵制备丁二酸，菌种为Actinobacillus succinogenes NH113(CGMCC1716)，具体培养方法按照《食品与发酵工业》，2007，33(6)：1～5中提供的培养方法。发酵结束后的废弃细胞经过离心、生理盐水洗涤后称重并测定其总氮含量，备用。
本实施例中所采用的总氮含量测定方法为凯氏定氮法。
表1单批发酵制备丁二酸中总氮的回收情况

表1中可见，利用废弃细胞为氮源进行发酵可以使73.6％的氮源得以回收利用。下面对水解液用于发酵的可行性进行验证。
将备用的细胞进行酶水解，水解条件如下：碱性蛋白酶添加量4.17μL/g细胞干重，温度55℃，pH8.0，水解时间24h。水解完成后离心得到的上清液即为细胞水解液，备用。
测定水解液总氮含量为3g/L，向3L发酵罐中加入水解液730mL，加入Na₂HPO₄15g/L和KH₂PO₄4g/L，加水970mL，121℃灭菌15min，加入已灭菌的浓度为500g/L葡萄糖200mL，种子液100mL。此时培养基中总氮含量为1.1g/L，相当于常规培养基对应的10g/L酵母粉的总氮含量，葡萄糖浓度为50g/L。
将上述培养基和常规产丁二酸培养基在下述相同发酵条件下进行发酵实验：
灭菌结束后接入5％的Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC 1716)种子液，搅拌转速300rpm，37℃发酵培养，CO₂通气量为0.25vvm，用Na₂CO₃控制发酵液的pH为6.8，发酵培养48h后，检测发酵液中丁二酸含量。
产丁二酸培养基的常规配方和本实施例配方，以及发酵结果的区别如表2所示：
表2不同培养基发酵生产丁二酸的结果

实施例2
本实施例在生物法制备乳酸的过程中实现氮源的循环利用。首先以15g/L酵母粉为氮源发酵制备乳酸，具体培养方法按照《中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集》，2005：88～90中提供的培养方法。发酵结束后的废弃细胞经过过滤、纯水洗涤后称重并按实施例1中的方法测定其总氮含量，备用。
表3单批发酵制备乳酸中总氮的回收情况

表3中可见，利用废弃细胞为氮源进行发酵可以使79.9％的氮源得以回收利用。下面对水解液用于发酵的可行性进行验证。
将备用的细胞进行超声破碎，破碎条件如下：150W功率下，冰浴，超声处理至镜检无完整细胞，超声破碎后离心得到的上清液即为细胞水解液。
按实施例1中的方法测定总氮含量为3.5g/L，向3L发酵罐中加入457mL水解液，加入0.1g/LLNaCl，0.5g/L K₂HPO₄和2g/L MgSO₄，1043mL水，121℃灭菌15min，加入已灭菌的浓度为500g/L葡萄糖400mL，种子液100mL。此时培养基中总氮含量为1.6g/L，相当于常规培养基对应的15g/L酵母粉的总氮含量，葡萄糖浓度为100g/L。
将上述培养基和常规产乳酸培养基在下述相同发酵条件下进行发酵实验：
灭菌结束后接入5％的Lactobacillus rhamnosus NRRL B445种子液，搅拌转速300rpm，38℃发酵培养，N₂通气量为0.25vvm，用CaCO₃作为中和剂，发酵培养48h后，检测发酵液中乳酸含量。
产乳酸培养基的常规配方和本实施例配方，以及发酵结果的区别如表4所示：
表4利用不同培养基发酵生产乳酸的结果

实施例3
本实施例在生物法制备丁二酸的过程中实现氮源的循环利用，并通过与少量酵母粉联用提高废弃细胞水解液作为氮源用于发酵制备丁二酸的能力。以10g/L酵母粉为氮源进行厌氧发酵制备丁二酸，菌种为Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC 1716)，具体培养方法同实施例1。发酵结束后的废弃细胞经过沉降、生理盐水洗涤后称重并用凯式定氮法测定其总氮含量，备用。
由实施例1可知，在利用废弃细胞实现氮源循环时，废弃细胞只能替代原发酵培养基中73.6％的氮源，即以细胞水解液作为氮源的发酵能力是有限的，将细胞水解液与少量氮源联用后便能完全达到以10g/L酵母粉为氮源的发酵效果。
将备用细胞进行酸水解，水解条件如下：3M H₂SO₄，90℃水解2h，离心得到上清液用NaCO₃溶液调节pH至中性后测定其总氮含量为3g/L。向5L发酵罐中加入水解所得的全部水解液1283mL，加入Na₂HPO₄15g/L和KH₂PO₄4g/L，酵母粉3g/L，加水2467mL，121℃灭菌15min，加入已灭菌的浓度为500g/L葡萄糖1000mL，种子液250mL。此时培养基中总氮含量为1.1g/L，相当于常规培养基对应的10g/L酵母粉的总氮含量，葡萄糖浓度为100g/L。
将上述培养基和常规产丁二酸培养基在下述相同发酵条件下进行发酵实验：
灭菌结束后接入5％的Actinobacillus succinogenes NJ113(CGMCC 1716)种子液，搅拌转速300rpm，37℃发酵培养，CO₂通气量为0.25vvm，用Na₂CO₃控制发酵液的pH为6.8，发酵培养48h后，检测发酵液中丁二酸含量。
产丁二酸培养基的常规配方和本实施例配方，以及发酵结果的区别如表5所示：
表5不同培养基发酵生产丁二酸的结果

表5可见，当废细胞水解液补加3g/L酵母粉用于发酵时，丁二酸产量完全能够达到以10g/L酵母粉为氮源时的丁二酸产量，可以使酵母粉用量减少70％，而发酵时间却比常规培养基缩短了近24h，不仅降低了培养基原料成本，更减小了发酵过程中水、电、气的消耗，降低了生产成本，更加环保、节能。
实施例4
本实施例在生物法制备乙醇的过程中实现氮源的循环利用。首先以5g/L酵母粉为氮源进行厌氧发酵制备乙醇，菌种为Pichia stipitis CBS 5776具体培养方法按照《生物加工过程》，2008，6(6)：19～24中提供的培养方法，发酵结束后的废弃细胞经过沉淀、纯水洗涤后称重并按实施例1中的方法测定其总氮含量，备用。
表6单批发酵制备乙醇中总氮的回收情况

表6中可见，利用废弃细胞为氮源进行发酵可以使88.0％的氮源得以回收利用。下面对水解液用于发酵的可行性进行验证。
将备用的细胞进行盐溶法水解，水解条件如下：将酵母细胞配成6％的菌悬液，加入1g/100mLNaCl和6g/100mL无水乙醇，50℃水浴24h后离心得到的上清液即为细胞水解液。测得水解液总氮含量为3.5g/L，向5L发酵罐中加入细胞水解液500mL，加水2475mL，121℃灭菌15min，加入已灭菌的浓度为500g/L葡萄糖350mL，种子液175mL。此时培养基中总氮含量为0.5g/L，相当于常规培养基对应的5g/L酵母粉的总氮含量，葡萄糖浓度为50g/L。
将上述培养基和常规产乙醇培养基在下述相同发酵条件下进行发酵实验：
灭菌结束后接入5％的Pichia stipitis CBS 5776种子液，搅拌转速100rpm，35℃发酵培养，用浓度为2N的KOH溶液控制发酵液的pH为6.0，发酵培养24h后，检测发酵液中乙醇含量。
产乙醇培养基的常规配方和本实施例配方，以及发酵结果的区别如表7所示：
表7利用不同培养基发酵生产乙醇的结果