降解养殖水体中亚硝酸盐和氨态氮的净水剂的制备方法 【技术领域】
本发明涉及用非致病性的蜡状芽胞杆菌培养的一种降解养殖水体中亚硝酸盐和氨态氮的净水剂。
背景技术
近年来，水产养殖业有了飞速的发展，由传统开放型养殖方式向半密集型乃至密集型、设施化、集约化养殖方式的转变，养殖方式的进步是一把“双刃剑”，一方面可大幅度提高水产产量，另一方面日益加剧了对养殖水体环境的破坏，即高密度养殖及大量投放人工饵料使养殖水体质量迅速恶化，由此严重影响了水产品产量、质量和养殖效益。这种高密度养殖模式下，养殖水体中的残饵、排泄物及其它有机污染物也日趋增多，有机污染物分解需大量消耗溶氧，同时迅速积累各种有毒有害物质，尤以以亚硝态氮、氨态氮的积累最为突出，随着这些有毒有害物质的增加，不仅影响水产生物的生长、繁殖，严重的还产生中毒死亡。研究表明，水体中病原微生物的数量与水体中亚硝态氮、氨态氮的浓度直接相关。综上所述，高浓度的亚硝态氮或氨态氮不仅直接危害水产生物，同时也是引起暴发性病害的直接或间接的因素，因此解决养殖水体中氮的转化和消除问题迫在眉睫。
现有的养殖水体净水剂有两种，一种是以无机盐为主，该法能在短期内解决一些问题，但无法从根本上解决养殖水体的亚硝态氮和氨态氮超标的问题；另一种是以微生态活菌剂为主，而现行的方法中，普遍存在三种缺陷：
(1)活菌数量活力太低或活菌数太少，作用时间过长，无法起到立竿见影的效果，如申请号为200810100231.4的中国发明专利申请公开了“复合型活菌生物净水剂及其制备方法”中的总菌数为108cfu/g，由于总菌数低，降解水体亚硝酸盐和氨态氮的效果不明显；专利号为ZL 200410024622.4的中国发明专利申请公开了“解毒菌的制备和修复水产养殖环境的方法”中发酵周期长达15天，活菌数只有108cfu/g，用于养殖水体解毒作用时间长，不能解燃眉之急；申请号为02134998.3的中国发明专利申请公开了“一种长效微生物净水剂及其生产方法”，其中总菌数只达109cfu/ml，还用到菌株白地霉AS2.1175，其生长最适温度较窄且较低为20℃左右，不适于养殖水体温度的变化；申请号为00117453.3的中国发明专利申请公开了“一种活菌生物净水剂的高密度活菌发酵工艺”，其中发酵培养基的氮源主要为无机氮源，不能满足生长旺盛的芽胞菌对氮源的大量需求，使得活菌量不可能达到真正的“高密度”。
(2)采用具有强吸附功能的原料作为固定化载体、或制成片剂的微生态净水剂，使芽胞菌在施放时容易沉到养殖水体的底部，而不能为芽胞菌提供繁殖所必需的氧气，所以效果不显著。如申请号为200810198302.9的中国发明专利申请公开了“一种固定化硝化细菌降解养殖废水亚硝酸盐的工艺”，就是其中之一；申请号为200510112131.X的中国发明专利申请公开了“微生物亚硝酸盐降解剂及制作方法”中，使用海藻酸钠-氯化钙对枯草芽胞菌和硝化细菌进行包埋，制作工艺复杂，包埋体用于养殖水体中，容易破裂，载体本身会对养殖水体造成一定污染；申请号为200710059467.3的中国发明专利申请公开了“一种净化养殖水体的复合微生态制剂、剂型及其制备工艺”，用到改性聚丙烯酰胺，该物质有不容易降解的潜在危害，当絮凝到一定程度时，可形成较大分子颗粒物沉到池底，或被滤食性鱼类吞食，造成一定的潜在危害。
(3)所选用的活菌降解养殖水体的亚硝酸盐和氨态氮的效果不明显、作用范围窄、作用效果单一，如申请号为200410014054.X的中国发明专利申请公开了“复合活菌生物净水剂的制备方法”，该方法是将蜡状芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和地衣芽胞杆菌经过培养，制成干粉的制备方法，只公布了制备的过程，没有公布使用效果，对于现代养殖需要的高效、快速的集约化养殖是不足的；申请号为200710193008.4的中国发明专利申请公开了“调节淡水养殖中水质的加强型微生物制剂及其应用”，只适用于淡水养殖，没有涉及到海水养殖的范畴，这也是不全面的；申请号为200610013732.X地中国发明专利申请公开了“用于水产养殖的微生物制剂”，用到的菌种没有絮凝作用，无法快速高效对养殖水体进行澄清。
【发明内容】
本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种活菌数含量为1014cfu/ml以上的液态或1016cfu/g以上的干粉的降解养殖水体中亚硝酸盐和氨态氮的净水剂，其生产发酵时间短，具有高效降解养殖水体中亚硝酸盐、氨态氮和COD，该剂并有澄清水体的作用。
本发明的另一目的是提供所述净水剂的制备方法。
本发明的一种降解养殖水体中亚硝酸盐和氨态氮的净水剂的制备方法，包括如下步骤：
第一步以重量比为0.01～0.50∶100的比例，将非致病性的蜡状芽孢杆菌的冻干粉接入至100～200ml的活化液体培养基中，于25～30℃，150～200r/min振摇培养24～36h，得到种子培养液；所述的活化液体培养基及其重量为：蛋白胨0.5～2.0份、牛肉膏粉0.05～0.50份、氯化钠0.05～1.00份，水96.5～99.4份，用1～5mol/L的NaOH溶液调节pH为7.0～7.5，混合均匀后于0.08～0.10MPa灭菌15～20min后，冷却至25～30℃备用；
第二步以体积比为1～10∶100的比例，将步骤一得到的种子培养液接入至100-200ml的活化液体培养基中，于25～30℃，150～200r/min振摇培养24～36h，得到工作发酵剂；所述的活化液体培养基及其重量为：蛋白胨0.5～2.0份、牛肉膏粉0.05～0.50份、氯化钠0.05～1.00份，水用1～5mol/L的NaOH溶液调节pH为7.0～7.5，混合均匀后于0.08～0.10MPa灭菌15～20min后，冷却至25～30℃备用；
第三步以体积比为1～10∶100的比例，将步骤二得到的工作发酵剂接入增菌培养基中，于25～40℃，150～200r/min下进行培养24～48h，通过培养后活菌数达1014cfu/ml以上，得到高密度培养液；所述的增菌培养基及其重量为：葡萄糖1.0～3.0份，麸皮水解液3.0～6.0份，豆粕粉1.0～5.0份，MgSO40.008～0.020份，K2HPO40.008～0.020份，NaCl 0.01～0.05份，柠檬酸三钠0.05～0.30份，水86～95份，用NaOH溶液调节pH为7.0～7.5，混合均匀后于0.08～0.10MPa灭菌15～20min后，冷却至25～40℃备用；
第四步将步骤三得到的高密度培养液密闭放置于3～10℃下保存144～240h后，为液态净水剂，该液态净水剂用0.9～1.5％的食盐水稀释后使用；或者
将步骤三得到的高密度培养液用离心机在8000～10000rpm离心20～40min，去掉上清液后的菌泥，按重量比为1∶2～10的比例加入40～80目的麸皮，混合均匀，用干燥温度为40～50℃，真空度为1.3～13.0Pa的真空热风干燥机进行干燥，使水分控制10％以下，得到干粉净水剂。
步骤三所述的水麸皮水解液通过如下方法制备得到：干麸皮∶水∶浓盐酸＝1～6∶20～30∶1质量比；将干麸皮与浓盐酸和水按比例混合后，于0.08～0.10MPa的高压蒸气灭菌锅中水解70～80min。
步骤三所述NaOH溶液的浓度为1～5mol/L。
得到的干粉净水剂的活菌数达1016cfu/g以上。
作为优选，第一、第二步中的活化液体培养基优选为：蛋白胨1.0份、牛肉膏粉0.3份、氯化钠0.5份，水98.2份，用1mol/L的NaoH溶液调节pH为7.2。
第三步种子培养液与增菌培养基的体积比优选为5∶100。所述的增菌培养基优选为：葡萄糖1.5份，麸皮水解液4份，豆粕粉2份，MgSO40.01份，K2HPO40.01份，NaCl 0.03份，柠檬酸三钠0.1份，水987g，pH调节为7.2。所述的水麸皮水解液的制作方法为：干麸皮∶水∶浓盐酸＝4.6∶26∶1(质量比)。
所述第三步中以重量计，发酵温度优选为30℃，培养时间优选为36h。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
(1)生产成本低廉，采用麸皮、豆粕为主要营养原料，一方面完全满足了蜡状芽胞杆菌对氮源和碳源的需求，另一方面由于采用合适的培养基，使得发酵时间短，提高了生产效率。
(2)在1m深、7～8亩的养殖水体中使用液态净水剂(高密度的蜡状芽胞杆菌(1016cfu))，在7天后，其中的亚硝酸盐从0.20mg/L降低到0.01mg/L；氨氮含量从1.5mg/L降低到0.18mg/L；COD从325mg/L降低到29mg/L；澄清度由0.78降低到0.20以下。
(3)由于运用了K+、Na+、Mg2+、PO43-和麸皮、豆粕中的促生长素等各成分之间的科学配比，使液态净水剂的活菌数高达1014cfu/ml以上，干粉净水剂的活菌数高达1016cfu/g以上。
(4)蜡状芽胞杆菌经过两次在活化液体培养基的活化培养后，尽量使细胞处于同步生长时期，这样使得后续的增菌培养时间大大缩短。
(5)由于本发明所使用的非致病性蜡状芽孢杆菌能耐受较高浓度的盐，所以本发明的两种剂型的产品均可用于淡水、海水的水产养殖，也可用于微生态制剂和饲料中。
(6)本发明的净水剂能够高效分解养殖水体中大分子有机物，降低养殖水体中亚硝态氮(NO2-)和氨氮(NH3-N)的含量，并且还能有效降低养殖水体中COD值。
【附图说明】
图1实施例1中的液态净水剂用于1m深、7～8亩的养殖水体降解亚硝酸盐的变化曲线；
图2实施例1中液态净水剂用于1m深、7～8亩的养殖水体降解氨态氮的变化曲线；
图3实施例1中液态净水剂用于1m深、7～8亩的养殖水体降解COD的变化曲线；
图4实施例1中的干粉净水剂用于1m深、7～8亩的养殖水体降解亚硝酸盐的变化曲线；
图5实施例1中干粉净水剂用于1m深、7～8亩的养殖水体降解氨态氮的变化曲线；
图6实施例1中干粉净水剂用于1m深、7～8亩的养殖水体降解COD的变化曲线。
【具体实施方式】
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
实施例1
第一步以重量比为0.01∶100的比例，将蜡状芽孢杆菌AS1.260(Bacillus cereus，中国普通微生物保藏管理中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，邮编：100101，电话：86-10-64807596)的冻干粉接入至100ml的活化液体培养基中，于25℃，150r/min振摇培养24h，得到种子培养液；所述的活化液体培养基为：蛋白胨5.0g、牛肉膏粉0.5g、氯化钠0.5g，水994g，用1mol/L的NaOH溶液调节pH为7.0，混合均匀后于0.08MPa灭菌20min后，冷却至25℃备用。
第二步以体积比为10∶100的比例，将种子培养液接入至100ml的活化液体培养基中，于25℃，150r/min振摇培养24h，得到工作发酵剂；所述的活化液体培养基为：蛋白胨5.0g、牛肉膏粉0.5g、氯化钠0.5g，水994g，用1mol/L的NaOH溶液调节pH为7.0，混合均匀后于0.08MPa灭菌20min后，冷却至25℃备用。
第三步以体积比为10∶100的比例，将蜡状芽孢杆菌的工作发酵剂接入增菌培养基中，于25℃，200r/min下进行培养24h，通过培养后活菌数为3.25×1014cfu/ml，得到高密度培养液；所述的增菌培养基为：葡萄糖10g，麸皮水解液60g，豆粕粉10g，MgSO40.08g，K2HPO40.08g，NaCl 0.1g，柠檬酸三钠0.5g，水949g，用1mol/L的NaOH溶液调节pH为7.0，混合均匀后于0.08MPa灭菌20min后，冷却至25℃备用。所述的水麸皮水解液的制作方法为：干麸皮∶水∶浓盐酸＝1∶20∶1(质量比)。将干麸皮与浓盐酸和水按比例混合后，于0.10MPa的高压蒸气灭菌锅中水解70min，备用；
第四步将高密度培养液密闭放置于3℃下保藏240h后，为液态净水剂，该液态净水剂用0.9％的食盐水稀释后使用；也可将高密度培养液用8000rpm离心40min，去掉上清液后的菌泥，按照重量比为1∶2的比例加入40目的麸皮，混合均匀后在在干燥温度为40℃，真空度为13.0Pa的真空热风干燥机进行干燥，干粉的水分为9.8％，活菌数为2.62×1016cfu/g。
A：实施例1中液态净水剂的使用效果
蜡状芽胞杆菌AS1.260为需氧型细菌，生命力极强，耐高温，代谢旺盛，能在水体中迅速繁殖，产生大量的胞外酶，能大量消耗水体中的残饵和动物排泄物等有机质，将大分子的有机物分解为小分子的氨基酸、有机酸和水，体现出一定的降解亚硝酸盐、氨态氮、COD的能力，也能产生生物絮凝剂，使水体中难以降解的有机物胶体脱稳，固液分离，最终絮凝沉淀，便可提高水体的透明度。亚硝酸盐、氨态氮、化学需氧量和澄清度是反映养殖水体是否健康的直观因素，为了研究本发明的净水剂对养殖水体中亚硝酸盐、氨态氮、化学需氧量的降解效果和澄清度，在7～8亩的养殖水体中投入1000ml的本例生产出来的液态净水剂(活菌数为3.25×1014cfu/ml)，用200kg的0.9％食盐水进行稀释后均匀泼洒在养殖水体表面，同时每隔6小时开增氧机一次，每次2h，每天上午11:00在同一个取样点取样分析水体中的亚硝酸盐含量(采用国标GB/T5009.33-2003的盐酸萘乙二胺法)、氨态氮含量(采用国标GB/T7479-1987的纳氏试剂比色法)、化学需氧量COD(GB11914-1989的COD测定重铬酸盐法)和澄清度(分光光度计法吸光度，检测波长为660nm)。
结果分别如图1、图2、图3所示，从图1中可以看出蜡状芽胞杆菌AS1.260能快速降解水体亚硝酸盐，在第72h降解为0.05mg/L，至144-168h后稳定在0.01mg/L，降解率高达95％。而对照菌至168h后降解率仅为60％。由于高密度的蜡状芽胞杆菌(4.33×1016cfu/亩)使得养殖水体的亚硝酸盐能迅速下降。
从图2中可以看出蜡状芽胞杆菌AS1.260也能快速降解水体氨态氮，在第72h降解为0.30mg/L，至144-168h后稳定为0.18mg/L，降解率高达88％。而对照菌至168h后降解率仅为56.7％。由于高密度的蜡状芽胞杆菌(4.33×1016cfu/亩)使得养殖水体的氨态氮含量能迅速下降。
化学需氧量(COD)，是在一定条件，用一定的强氧化剂处理水样所消耗的氧化剂的量，以氧的“毫克/升”表示，它是指示水体被还原性物质污染的主要指标，还原性物质包括各种有机物、亚硝酸盐、亚铁盐和硫化物等，但水样受有机物污染是极为普遍的，因此化学需氧量可做有机物相对含量的指标之一。从图3可以看出，本例的蜡状芽胞杆菌AS1.260高密度净水剂能迅速降低养殖水体的COD值，96h后的COD去除率达到76.9％；在处理144h后，水样的COD除去率达到了91.0％。
由于某种未知的原因，本例的蜡状芽胞杆菌AS1.260在培养10h以上即会在培养液中形成絮状沉淀，这种特性用在养殖水体非常有用，因为在人工投饵、施肥的条件下，水中溶解的有机物质与细菌通过絮凝作用形成的有机碎屑，可以成为鱼类和其他水生生物的食物，从而起到自净和澄清水质的作用，因此从外观看水质的透光率大大提高，在7天后，其吸光度由0.78降低到0.20。
B：实施例1中干粉净水剂的使用效果
在7～8亩的养殖水体中投入100g的本例生产出来的干粉净水剂(活菌数为2.62×1016cfu/g)，用200kg的0.9％食盐水进行稀释后均匀泼洒在养殖水体表面，增氧方法、取样方法及测定方法同A。结果分别如图4、图5、图6所示：
从图4中可以看出蜡状芽胞杆菌AS1.260能快速降解水体亚硝酸盐，在第72h降解为0.03mg/L，至144-168h后稳定在0.015mg/L，降解率高达94％。而对照菌至168h后降解率仅为62.5％。从图5中可以看出蜡状芽胞杆菌AS1.260也能快速降解水体氨态氮，在第72h降解为0.43mg/L，168h后为0.10mg/L，降解率高达93％。而对照菌至168h后降解率仅为59.5％。从图6可以看出，本例的蜡状芽胞杆菌AS1.260高密度净水剂能迅速降低养殖水体的COD值，72h后的COD去除率达到65.6％；在处理168h后，水样的COD除去率达到了85.6％。干粉净水剂同样可以起到澄清水质的作用，因此从外观看水质的透光率大大提高，在7天后，其吸光度由0.80降低到0.23。
干粉净水剂由于含有高密度的蜡状芽胞杆菌使得养殖水体的亚硝酸盐、氨态氮和COD迅速下降。与液态的净水剂的使用效果相比，尽管单位养殖水体面积的干粉净水剂的密度比前者高8-9倍，但是在最初的降解效果中普遍不如液态净水剂，可能因为干粉净水剂存在一个活化的过程，所以图4、5、6中在第24h的降解效果都不如液态净水剂。
实施例2
第一步以重量比为0.50∶100的比例，将蜡状芽孢杆菌AS1.260(Bacillus cereus，中国普通微生物保藏管理中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，邮编：100101，电话：86-10-64807596)的冻干粉接入至200ml的活化液体培养基中，于30℃，200r/min振摇培养36h，得到种子培养液；所述的活化液体培养基为：蛋白胨20g、牛肉膏粉5g、氯化钠10g，水965g，用5mol/L的NaOH溶液调节pH为7.5，混合均匀后于0.10MPa灭菌15min后，冷却至30℃备用。
第二步以体积比为1∶100的比例，将种子培养液接入至200ml的活化液体培养基中，于30℃，200r/min振摇培养36h，得到工作发酵剂；所述的活化液体培养基为：蛋白胨20g、牛肉膏粉5g、氯化钠10g，水965g，用5mol/L的NaOH溶液调节pH为7.5，混合均匀后于0.10MPa灭菌15min后，冷却至30℃备用。
第三步以体积比为1∶100的比例，将蜡状芽孢杆菌的工作发酵剂接入增菌培养基中，于40℃，150r/min下进行培养48h，通过培养后活菌数为4.13×1014cfu/ml，得到高密度培养液；所述的增菌培养基为：葡萄糖20g，麸皮水解液30g，豆粕粉50g，MgSO40.2g，K2HPO40.2g，NaCl 0.5g，柠檬酸三钠3.0g，水896g，用5mol/L的NaOH溶液调节pH为7.5，混合均匀后于0.10MPa灭菌15min后，冷却至40℃备用。所述的水麸皮水解液的制作方法为：干麸皮∶水∶浓盐酸＝6∶30∶1(质量比)。将干麸皮与浓盐酸和水按比例混合后，于0.08MPa的高压蒸气灭菌锅中水解80min，备用；
第四步将高密度培养液密闭放置于10℃下保藏144h后，为液态净水剂，该液态净水剂用1.5％的食盐水稀释后使用；也可将高密度培养液用10000rpm离心20min，去掉上清液后的菌泥，按照重量比为1∶10的比例加入80目的麸皮，混合均匀后在干燥温度为50℃，真空度为1.3Pa的真空热风干燥机进行干燥，干粉的水分为8.50％，活菌数为5.23×1016cfu/g。
实施例3
第一步以重量比为0.25∶100的比例，将蜡状芽孢杆菌AS1.260(Bacillus cereus，中国普通微生物保藏管理中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，邮编：100101，电话：86-10-64807596)的冻干粉接入至150ml的活化液体培养基中，于28℃，180r/min振摇培养30h，得到种子培养液；所述的活化液体培养基为：蛋白胨10g、牛肉膏粉2.5g、氯化钠5.0g，水982.5g，用2.5mol/L的NaOH溶液调节pH为7.2，混合均匀后于0.09MPa灭菌18min后，冷却至28℃备用。
第二步以体积比为5∶100的比例，将种子培养液接入至150ml的活化液体培养基中，于28℃，180r/min振摇培养30h，得到工作发酵剂；所述的活化液体培养基为：蛋白胨10g、牛肉膏粉2.5g、氯化钠5.0g，水982.5g，用2.5mol/L的NaOH溶液调节pH为7.2，混合均匀后于0.09MPa灭菌18min后，冷却至28℃备用。
第三步以体积比为5∶100的比例，将蜡状芽孢杆菌的工作发酵剂接入增菌培养基中，于30C，180r/min下进行培养36h，通过培养后活菌数为6.89×1014cfu/ml，得到高密度培养液；所述的增菌培养基为：葡萄糖20g，麸皮水解液45g，豆粕粉30g，MgSO40.1g，K2HPO40.1g，NaCl 0.25g，柠檬酸三钠1.3g，水903g，用3mol/L的NaOH溶液调节pH为7.2，混合均匀后于0.09MPa灭菌18min后，冷却至30℃备用。所述的水麸皮水解液的制作方法为：干麸皮∶水∶浓盐酸＝3∶25∶1(质量比)。将干麸皮与浓盐酸和水按比例混合后，于0.09MPa的高压蒸气灭菌锅中水解75min，备用；
第四步将高密度培养液密闭放置于5℃下保藏192h后，为液态净水剂，该液态净水剂用1.2％的食盐水稀释后使用；也可将高密度培养液用9000rpm离心25min，去掉上清液后的菌泥，按照重量比为1∶6的比例加入60目的麸皮，混合均匀后在干燥温度为45℃，真空度为8.0Pa的真空热风干燥机进行干燥，干粉的水分为9.82％，活菌数为6.89×1016cfc/g。