体外培养骨髓间充质干细胞的完全培养基 【技术领域】
本发明涉及一种培养基，具体地说是一种用于高效培养体外骨髓间充质干细胞的完全培养基。
背景技术
间充质干细胞是来源于中胚层的一类成体干细胞，可从骨髓、骨膜、滑膜、肌肉、脂肪等多种组织中分离出来，并且实验证实在不同的诱导条件下，其具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力，如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞等分化的能力。骨髓被认为是MSCs的主要居住场所。在整个生命过程中，组织器官无论在稳定状态还是环境改变而受到刺激都需要这些骨髓来源的MSCs不断补充、更新。由于骨髓具有：①取材方便且对机体无害；②在体外可大量培养扩增；③由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥的问题；④转入外源性基因后不影响MSCs的特性，因此，骨髓MSC成为细胞治疗和组织工程理想的种子细胞。然而，骨髓中间充质干细胞数量较少，难以满足临床治疗和研究方面的需求，因此需要在体外对间充质干细胞进行大量扩增。
目前，在MSCs的常规培养体系中均加入了一定比例的动物血清，比较常用是胎牛血清。血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混物，它对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供护作用。但它也含有一些不利于细胞生长的抑制因子或毒性物质，具有潜在的细胞性作用。动物血清可能存在动物携带的已知未知病原体，对以后可能的临床应用构成威胁，对用于规模化培养细胞增加了难度。且每个批次的血清之间存在批间差异，使得到的培养结果出现差异。尽管研究人员尝试了很多的无血清培养基的方案，但无血清培养基普遍存在生长缓慢、甚至负增值的问题，致使处于RS的细胞进展到SR状态而丢失分化的能力。因此，无血清培养基用于间充质干细胞培养的研究至今也未取得重大突破。随着骨髓干细胞研究进一步深入，干细胞的应用研究也有了逐步发展，进而如何安全、稳定、快速、高质量扩增间充质干细胞的问题也越来越突出，亟需开发一种骨髓间充干细胞合适的培养基。
【发明内容】
本发明的目的在于，提供一种避免了高浓度胎牛血清带来的问题，并具有很好的促进细胞增殖功效的体外骨髓间充质干细胞的完全培养基。
本发明人经过长期的实验及研究最终确定了本发明完全培养基成分，本发明是在现有无血清培养基的基础上添加低浓度的胎牛血清及碱性成纤维细胞生长因子，弥补了无血清对间充质干细胞扩增效率不高，而高浓度胎牛血清存在使用上的缺陷。具体的讲是在基础培养基中添加了胰岛素、转铁蛋白、白蛋白、丙硒酸纳、氢化可的松、孕酮、还原型谷胱甘肽等细胞生长因子成分，再补加低浓度的胎牛血清。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种体外培养骨髓间充质干细胞的完全培养基，其基础培养基为DMEM-L或DMEM/F12；所述培养基中还添加有胰岛素、白蛋白、转铁蛋白、亚硒酸钠、氢化可的松、碱性成纤维细胞生长因子、孕酮、还原型谷胱甘肽以及胎牛血清。
所述各添加成分的用量推荐如下：
胰岛素 1～100μg/ml
白蛋白 1～50mg/ml
转铁蛋白 1～50ng/ml
亚硒酸钠 1～100ng/ml
氢化可的松 1～100μg/ml
孕酮 1～100nmol/L
还原型谷胱甘肽 1～10μg/ml
碱性成纤维细胞生长因子 1～100ng/ml
胎牛血清 1～50ul/ml。
所述各添加成分的用量优选如下：
胰岛素 1～10μg/ml
白蛋白 1～10mg/ml
转铁蛋白 1～10ng/ml
亚硒酸钠 1～30ng/ml
氢化可的松 1～40μg/ml
孕酮 1～50nmol/L
还原型谷胱甘肽 1～5μg/ml
碱性成纤维细胞生长因子 1～50ng/ml
胎牛血清 5～20ul/ml。
所述各添加成分的最优用量如下：
胰岛素 5μg/ml
白蛋白 5mg/ml
转铁蛋白 5ng/ml
亚硒酸钠 10ng/ml
氢化可的松 10μg/ml
孕酮 20nmol/L
还原型谷胱甘肽 1.5μg/ml
碱性成纤维细胞生长因子 5ng/ml
胎牛血清 10ul/ml。
本发明所述的培养基在体外培养骨髓间充质干细胞中的用途。
本发明主要发明点在于培养基配方，本发明培养基配制可按现有常规方法进行，推荐如下：按配方所示，在所述用量范围内选择所需用量，称取DMEM(L)干粉、胰岛素、白蛋白、转铁蛋白、亚硒酸钠、氢化可的松、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、孕酮、还原型谷胱甘肽，超纯水加至1000ml，搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
本发明所用原料均可通过市售够买得到。
本发明的优点及有益效果：
本发明培养基采用低浓度的胎牛血清及其他添加成分进行复配，各成分起到协同作用，成功培养了骨髓间充质干细胞，从促进细胞增殖方面达到了与高浓度血清相同效果，在维持间充质干细胞干性方面优于高浓度胎牛血清。培养速度快，由于采用了低血清的浓度，大大避免了高浓度血清存在地批次间不稳定、细胞毒性、大量异源蛋白等缺陷，为骨髓间充质干细胞的基础研究和临床治疗提供了很好的工具。
下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。
【附图说明】
图1为人骨髓间充质干细胞的形态特征
(a：培养2d、b：培养7d、c：培养12d)；
图2人骨髓间充质干细胞生长曲线；
图3人骨髓间充质干细胞细胞生长周期；
图4人骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化
(a：诱导10d、b：诱导20d、c：诱导20d经油红O染色)；
图5大鼠骨髓间充质干细胞的形态特征(a：培养3d、b：培养8d)；
图6大鼠骨髓间充质干细胞生长曲线；
图7大鼠骨髓间充质干细胞细胞生长周期；
图8大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞诱导分化
(a：诱导10d、b：诱导20d、c：诱导20d经油红O染色)。
【具体实施方式】
原料来源：
DMEM(L)干粉：美国Hyclone公司
DMEM/F12干粉：Hyclone公司
胰岛素：Sigma公司
白蛋白：Sigma公司
转铁蛋白：Sigma公司
亚硒酸钠：Amresco公司
氢化可的松：Sigma公司
孕酮：Sigma公司
还原型谷胱甘肽：Sigma公司
碱性成纤维细胞生长因子：PeproTech公司
胎牛血清：Gibco公司
实施例1 本发明培养基制备
下述骨髓间充质干细胞培养液配制所用到的基础培养基可以是DMEM(L)、也可以是DMEM/F12。
1000ml骨髓间充质干细胞培养液的配制：
(1)称取10g DMEM(L)干粉、1mg胰岛素、10g白蛋白、25ug转铁蛋白、30ug亚硒酸钠、20mg氢化可的松、1ml胎牛血清、30ug碱性成纤维细胞生长因子、10mg还原型谷胱甘肽、20nmol/L孕酮，超纯水加至1000ml，搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃存放。
(2)称取10g DMEM(L)干粉、5mg胰岛素、5g白蛋白、5ug转铁蛋白、10ug亚硒酸钠、10mg氢化可的松、10ml胎牛血清、5ug碱性成纤维细胞生长因子、1.5mg还原型谷胱甘肽、20nmol/L孕酮，超纯水加至1000ml，搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃存放。
(3)称取10g DMEM/F12干粉、50mg胰岛素、50g白蛋白、50ug转铁蛋白、100ug亚硒酸钠、80mg氢化可的松、10ml胎牛血清、50ug碱性成纤维细胞生长因子、10mg还原型谷胱甘肽、100nmol/L孕酮，超纯水加至1000ml，搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃存放。
实施例2 利用本发明培养基进行骨髓间充质干细胞体外培养
(1)人骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增
用骨穿针在骼后上棘抽取骨髓5ml，装入1ml含500u/ml肝素的PBS的无菌离心管中，等量PBS稀释，加到等体积的比重为1.073g/ml的淋巴细胞分离液上。2000转/min，离心30min，取中间云雾状的单个核细胞层，用DMEM(L)培养液离心洗涤2次，每次1000转/min，离心5min，弃去上清液。
用实施例1(2)配制的间充质干细胞培养基混悬并计数细胞，按5×106/ml接种于的培养瓶中，置37℃ 5％CO2饱和湿度的CO2孵箱中培养。2天后首次换液，弃去未贴壁细胞，以后每3天更换培养液1次。8～10d后细胞融合达50％-60％时第一次传代，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA 37℃消化2-2.5min。收取细胞悬液，1000转/min，离心5min。弃上清后用实施例1(2)所述培养基重新悬浮细胞按1×104/ml传代培养如图1。
(2)细胞生长曲线
取3代的培养细胞，制备单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为5×103/ml，接种于24孔细胞培养板中，24h后用胰酶消化孔板中3个孔中的细胞并计数，连续每天取3孔，直至细胞长满孔时停止计数，以时间(d)为横坐标，以细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。结果如图2，在接种后的第1、2天细胞数没有明显的变化，从第3天起，细胞大量增加，至第6天细胞量达到高峰，以后细胞增长速度减慢。
(3)细胞周期检测
培养的MSCs，胰酶消化，PBS液漂洗2-3次后，70％乙醇4℃固定16h，加50μg/ml碘化丙锭和50μg/ml核糖核酸酶，4℃孵育30min，取100ul细胞悬液到流式管底部，流式细胞仪检测(计数104个细胞)。结果如图3，G0/G1期为54.53％，G2-M期为16.31％，S期为29.16％。高比例的G0/G1期细胞显示着骨髓间充质干细胞具有高度的分化潜能。
(4)向脂肪细胞诱导分化
收集消化后的第4代BM-MSC，按2×104/cm2接种于6孔板，待细胞融合达50％以上后，用含10％FCS的低糖DMEM培养液，加入脂肪诱导体系(地塞米松1μmol/L、人胰岛素5mg/L、IBMX 0.5mmol/L、消炎痛100μmol/L)，每3天全量换液，维持3周。细胞经油红O染色，镜下观察细胞内脂肪小滴形成情况。结果如图4，加入脂肪诱导体系后约7天，少数细胞内就出现微小明亮的脂肪滴。随着诱导时间延长，出现脂滴的细胞增多，细胞也变成方形或角形。培养至3周，融合的脂肪滴几乎充满整个细胞，油红O染色呈明亮的橙红色。
采用实施例1配制的间充质干细胞培养基，成功用于对人骨髓间充质干细胞进行扩增，从生长曲线看符合间充质干细胞的生长特性。细胞周期显示其具有高比例的G0/G1期的干细胞所具有的高度分化潜能。获得的骨髓间充质干细胞具有向脂肪细胞的分化潜能。
实施例3 本发明培养基对大鼠骨髓间充质干细胞培养实验
(1)大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养
SD大鼠断颈处死，充分消毒。无菌条件下解剖出股骨及胫骨，剪去股骨、胫骨两端骨髓，显露骨髓腔。用5ml针管穿刺骨髓腔，用添加了肝素的DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬浮液。悬浮液贴壁轻轻加入到预置等体积1.077g/L的淋巴细胞分离液的离心管中，2000r/min离心20min。吸取中间乳白色的界面层，加入5倍体积的DMEM培养基，混匀后1000r/min离心10min。弃上清，留取离心管底端白色絮状物，加入实施例1制备的(3)间充质干细胞培养基，混匀后以2.0×106/ml的密度接种于培养瓶中，放入37℃、5％CO2培养箱内培养。48h后换液，去除未贴壁细胞。以后每3d换液1次。当细胞铺满瓶底60-70％时，倒掉培养液，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA将贴壁细胞消化2-3min，见细胞回缩，形态变圆，间隙增大时，终止反应。加入培养液吹打制成细胞悬液，按1∶3传代培养，结果如图5所示。
(2)细胞生长曲线
取3代的培养细胞，制备单细胞悬液，计数，调整细胞浓度为5×103/ml，接种于24孔细胞培养板中，24h后用胰酶消化孔板中3个孔中的细胞并计数，连续每天取3孔，直至细胞长满孔时停止计数，以时间(d)为横坐标，以细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。结果如图6，在接种后的第1，2天细胞数没有明显的变化，从第3天起，细胞大量增加，至第6天细胞量达到高峰。
(3)细胞周期检测
培养的MSCs，胰酶消化，PBS液漂洗2-3次后，70％乙醇4℃固定16h，加50μg/ml碘化丙锭和50μg/ml核糖核酸酶，4℃孵育30min，取100ul细胞悬液到流式管底部，流式细胞仪检测(计数104个细胞)。结果如图7，G0/G1期为58.07％，G2-M期为26.44％，S期为36.36％。高比例的G0/G1期细胞显示着骨髓间充质干细胞具有高度的分化潜能。
(4)向脂肪细胞诱导分化
收集消化后的第4代BM-MSC，按2×104/cm2接种于6孔板，待细胞融合达50％以上后，用含10％FCS的低糖DMEM培养液，加入脂肪诱导体系(地塞米松1μmol/L、人胰岛素5mg/L、IBMX 0.5mmol/L、消炎痛100μmol/L)，每3天全量换液，维持3周。细胞经油红O染色，镜下观察细胞内脂肪小滴形成情况。结果如图8，加入脂肪诱导体系后约7天，少数细胞内就出现微小明亮的脂肪滴。随着诱导时间延长，出现脂滴的细胞增多，细胞也变成方形或角形。培养至3周，融合的脂肪滴几乎充满整个细胞，油红O染色呈明亮的橙红色。
采用实施例1配制的间充质干细胞培养基，成功用于对大鼠骨髓间充质干细胞进行扩增，从生长曲线看符合间充质干细胞的生长特性。细胞周期显示其具有高比例的G0/G1期的干细胞所具有的高度分化潜能。获得的骨髓间充质干细胞具有向脂肪细胞的分化潜能。