抗URG4单抗杂交瘤细胞 【技术领域】
本发明主要涉及基因工程，特别是一个能稳定分泌抗URG4单抗杂交瘤细胞(1A8)。
背景技术
目前研究显示，URG4是利用抑制消减杂交及全长聚合酶链式反应扩增技术(RACE-PCR)克隆的一个可以被乙肝病毒X蛋白(HBx)上调的新基因，此基因全长3607个碱基对，编码区为2769个碱基对，编码由922个氨基酸组成、分子量为104KD的蛋白。
经NIH人类基因组数据库比较，定位在人类7号染色体。经蛋白质综合信息库分析(SWISS PROT)，此蛋白具有一个穿膜螺旋(Transmembranehelices：336-353)；三个核内信号定位肽(Nuclear localization signals：PYRGKRN 380，PRPRDKR 821，PRDKRQL 823)；一个ATP/GTP结合区(ATP/GTP binding site 690-697GVPGTGKS)；和caspase修复成员6(caspase recruitment domain family 6)在88-461氨基酸之间有34％同源。最初研究表明此基因不仅可促进细胞生长，还可促进癌细胞在体内的成瘤性，为一新的癌基因[3]。作为HBx致癌过程中上调的新分子之一，近期研究发现用合成的URG4抗原肽检测患者血清中的抗体(因URG4的单克隆抗体尚未制备)，联合其它新克隆的分子对肝癌的早期诊断具有预测价值[5]。另有研究推测urg4因参与了胃癌的发展而可能成为胃癌治疗的新靶点[4]。但其在恶性肿瘤形成过程中的具体作用机制有待更深入的研究以明确。
我们通过细胞杂交技术得到了能稳定分泌抗URG4单抗的杂交瘤细胞株(1A8)。
【发明内容】
本发明的目的是制作一种抗URG4单抗杂交瘤细胞，它能稳定分泌抗URG4单抗的杂交瘤细胞株(1A8)，进一步研究URG4的功能，用于癌症治疗的研究。
本发明的技术方案是：提供一种保藏号为CGMCCNO.1908的杂交瘤细胞株。
所述的保藏号为CGMCCNO.1908的杂交瘤细胞株用于分泌抗URG4单抗的杂交瘤细胞株。
所述的保藏号为CGMCCNO.1908的杂交瘤细胞株的制备方法是：根据已发表的文献(Lian Z，Liu J，Li L，Li X，Tufan NL，Clayton M，Wu MC，Wang HY，Arbuthnot P，Kew M，and Feitelson MA：Upregulated expression ofa unique gene by hepatitis B_antigen promotes hepatocellular growth andtumorigenesis.Neoplasia 2003；5：229-244.)中的多肽序列(PRPRDKRQLLDPPGDLSRC)，通过人工合成多肽如图1所示，并将此多肽分别连接血蓝蛋白(简称：peptide-KLH)或牛血清蛋白(简称：peptide-BSA)，并以连接血蓝蛋白的多肽作为抗原免疫BALB/C小鼠，经三次免疫后用酶联免疫吸附试验检测被免疫小鼠尾静脉，取血清效价大于1∶10000的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按小鼠淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术中(《细胞和分子免疫学实验技术》第二章，金伯泉主编。第四军医大学出版社，2002.11，ISBN 7-81086-027-5)的方法用50％的聚乙二醇(分子量4000，PEG-4000)进行融合；用含次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)选择性培养液(HAT，购于SIGMA公司)加入含20％小牛血清的RPMI-1640(购于HYCLONE公司)培养液中培养，融合后三天开始出现融合细胞，以连接牛血清蛋白的多肽(peptide-BSA)包被，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)筛选；同时配合用蛋白质印迹法(Western blot)，凡上述两种方法阳性的杂交瘤细胞予保留，用有限稀释法(参照《细胞和分子免疫学实验技术》第二章，金伯泉主编。第四军医大学出版社，2002.11，ISBN 7-81086-027-5)通过四次克隆化，最后获得一株稳定分泌抗URG4单克隆抗体的保藏号为CGMCCNO.1908的杂交瘤细胞株，标记为1A8。
本发明通过以URG4蛋白的多肽为免疫原，应用现有的单克隆抗体制备技术(参照《细胞和分子免疫学实验技术》第二章，金伯泉主编。第四军医大学出版社，2002.11，ISBN 7-81086-027-5)得到一株能稳定分泌抗URG4单克隆抗体的保藏号为CGMCCNO.1908杂交瘤细胞株(1A8)。应用此株杂交瘤细胞以1×106个/只的量腹腔注射预先用液体石蜡致敏的8-10周龄的BALB/C雌性小鼠，10-14天后采集腹水，以连接牛血清蛋白的多肽包被，通过酶联免疫吸附试验检测腹水阳性，并用此腹水行蛋白质印迹法证明其能识别变异的URG4蛋白，同时将此腹水用于行免疫组化证明其能识别自然的URG4蛋白。此株杂交瘤细胞分泌的单抗为进一步研究新基因URG4奠定了基础，同时拟进一步研究此单抗的功能，以期能根据此单抗通过人工合成治疗癌症的抗人URG4蛋白的单抗片断，达到扩大临床癌症治疗方法的目的。
【附图说明】
下面结合实施例附图对本发明做进一步说明。
图1是URG4多肽质谱图；
图2是用蛋白质印迹法检测URG4在不同细胞中的表达；
图3是用免疫组化检测URG4蛋白在胃癌组织中的表达。
【具体实施方式】
1材料和仪器
1.1细胞株、组织标本和动物
a.骨髓瘤细胞(SP2/0)引自第四军医大学免疫教研室。
b.细胞系HepG2-Pc，HepG2-HBx，3T3，3T3-URG4，MKN28，本所保藏。
c.组织来源：西京医院2002-2004年手术病例，经病理诊断。
d.BALB/c小鼠：第四军医大学实验动物中心。
1.2主要试剂
a.福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、HAT、HT、ABTS、PEG(分子量4000)、抗β-actin单抗、焦碳酸二乙酯(DEPC)和溴化乙锭(EB)：Sigma公司；
b.HRP标记兔抗鼠IgG：Percin公司；
c.RPMI1640培养基：HyClone公司；
d.醋酸纤维膜(NC)：Hybond公司；
e.小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；
f.鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒：HyCult分司；
g.包被缓冲液：(每500ml去离子水中加入0.795g的碳酸钠和1.465g的碳酸氢钠组成，PH值为9.6。)；
h.底物缓冲液：(每500ml去离子水中加入9.2g的十二水磷酸氢二钠和2.55g的柠檬酸组成，PH值为5.0。)；
i.ABTS显色液：(每10ml底物缓冲液中加入5mg的ABTS和3％的双氧水20ul组成。)；
j.1640培养液原液：(每500ml去离子水中加入5.2g的1640干粉、1.7ul的二疏基乙醇和23.83g的HEPES组成，氢氧化钠调PH值7.2。)；
k.不完全1640培养液：(每500ml的1640培养液原液中加入7.5％地碳酸氢钠15ml组成。)；
l.完全1640培养液：(每80ml不完全1640培养液中加入20ml的小牛血清组成。)；
m.抗体稀释液：(每100ml的PBS加入0.1g的BSA组成。)；
n.洗涤缓冲液：(每100ml的PBS加入0.5ml的Tween-20组成。)；
o.PEG配制液：(每8.9ml不完全1640培养液中加入1ml的DMSO和0.1ml的7.5％碳酸氢钠组成。)；
1.3主要仪器
a.二氧化碳培养箱：Forma Scientific公司；
b.超净工作台：苏州净化设备仪器厂；
c.倒置显微镜：Olympus公司；
d.37℃恒温水育箱：余姚市东方电工仪器厂；
e.聚笨乙烯塑料板(酶标板)96孔、细胞培养板(96孔及24孔)：NUNC公司；
f.台式高速离心机：湖南湘雅仪器表厂
g.核酸蛋白检测仪：Shimadzu公司
h.纯水仪：Milipore公司
i.微型垂直平板电泳槽：Bio-Rad公司
j.电转移仪：Bio-Rad公司
2方法
2.1细胞培养：细胞HepG2-Pc，HepG2-HBx，3T3，3T3-URG4，MKN28，培养于含10％小牛血清的不完全1640培养液中，骨髓瘤细胞及杂交瘤细胞培养于完全1640培养液中，置于37℃、5％的二氧化碳细胞培养箱，隔天换液1次，3-4天传代1次。
2.2抗原制备：根据已发表文献[1]中多肽序列(PRPRDKRQLLDPPGDLSRC)，通过人工合成多肽，并将此多肽分别连接血蓝蛋白(简称：peptide-KLH)或牛血清蛋白(简称：peptide-BSA)，并以peptide-KLH作为免疫抗原，以peptide-BSA作为检测抗原。(此部分由西安华辰生物技术有限公司完成)
2.3单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备具体过程参照《细胞和分子免疫学实验技术》第二章(金伯泉主编。第四军医大学出版社，2002.11，ISBN 7-81086-027-5)进行，具体分述如下：
2.3.1小鼠免疫
以peptide-KLH免疫BALB/c小鼠(4-8周龄，雌性)，具体步骤如下：
a.第一次免疫：peptide-KLH 150ug/只，加等体积福氏完全佐剂充分混匀后以1ml/只皮下多点注射BALB/c小鼠，0.2ml/点；间隔3周。
b.第二次免疫：剂量及途径同上，此次加等体积福氏不完全佐剂，间隔3周。
c.第三次免疫：剂量同上，不加佐剂，改用等体积的生理盐水，腹腔注射BALB/c小鼠；10天后取被免疫小鼠的尾静脉血(采集后即置4℃冰箱过夜，次日以2000转/分离心10分钟后留上清备用)以peptide-BSA包被，通过ELISA测定血清效价。
d.第四次免疫：剂量及途径同第三次免疫，取血清效价大于1∶10000的小鼠于融合前3天腹腔注射。
2.3.2ELISA法检测被免疫小鼠血清效价流程：
a.检测前一天，用包被缓冲液稀释peptide-BSA至15ug/ml，加入酶联免疫吸附板中，每孔100ul，置4℃冰箱过夜；
b.次日倒出已包被的酶联板孔内的液体，以洗涤缓冲液洗涤共3次，每次拍干；
c.分别加入用PBS行梯度稀释的待检血清(血清：PBS分别为1∶100；1∶1000；1∶2000；1∶4000；1∶8000；1∶16000)100ul/孔，以未免疫的BLAB/c小鼠的血清为阴性对照，置37℃恒温水浴箱1小时；
d.倒出酶联板孔内的液体，以洗涤缓冲液洗涤共3次，每次拍干；
e.每孔加入HRP标记的兔抗鼠IgG抗体(用抗体稀释液行1∶5000的稀释)100ul，，置37℃恒温水浴箱1小时；
f.倒出酶联板孔内的液体，以洗涤缓冲液洗涤共3次，每次拍干；
g.显色，每孔加入ABTS显色液(现配现用)100ul，置37℃恒温水浴箱10-15分钟。
h.结果判定：于白色背景上，直接用肉眼观察反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
2.3.3饲养细胞的制备(融合前一天取小鼠腹腔巨噬细胞)：
采用6周龄的BALB/c雌性小鼠；拉颈处死，浸泡于75％酒精中消毒5分钟，用无菌剪刀剪开腹部皮肤以暴露腹膜，用无菌注射器每次注射8ml不完全1640培养液，反复冲洗，吸出冲洗液放入50ml离心管中(共用约40ml)，以1300转/分离心5分钟；弃上清后以完全1640培养液重悬沉淀，调整细胞数为1×105个/ml，加入96孔细胞培养板，100ul/孔，放入37℃、5％的二氧化碳细胞培养箱培养。
2.3.4细胞融合过程
a.观察骨髓瘤细胞SP2/0状态(要求在对数生长期最佳)，将配制好的45％PEG及20ml不完全1640培养液放入37℃细胞培养箱预热；(45％PEG的配制：于融合前一天配制好45％的PEG置4℃冰箱备用，1g的PEG放入青霉素小瓶后置高压锅内高压灭菌后约得液体0.9ml，于其内加入1.1ml的PEG配制液即得45％的PEG)；
b.将SP2/0收集于50ml无菌离心管并计数(要求细胞总数为1×106个)，离心1300转/分，共7分钟；
c.准备好无菌平皿、筛网、青霉素小瓶，拉颈处死已被四次免疫的BLAB/c小鼠，置75％酒精中浸泡5分钟；
d.无菌条件下取出被免疫小鼠脾脏放入青霉素小瓶中，用5ml不完全1640培养液冲洗后即将脾脏移于筛网内(此筛网置于平皿中)，加入约40ml不完全1640培养液，以无菌的5ml玻璃注射器针芯研磨至脾脏为细末状，取平皿中的研磨液于50ml无菌离心管中(计数脾细胞，要求细胞总数为1×107个)，离心1300转/分，7分钟；
e.分别去除离心后的SP2/0的上清和脾细胞的上清，以不完1640培养液重悬两种细胞沉淀后将两细胞混匀于同一个50ml无菌离心管中，离心1300转/分，7分钟；
f.去除混合细胞的上清后，再次以不完1640培养液重悬细胞沉淀，离心1300转/分，7分钟；
h.去除混合细胞上清后，保持离心管口向下，吸干残留液体；
i.轻弹离心管底，使细胞沉淀略为松动；
j.于室温下，30秒内沿管壁加入预热的45％PEG，轻轻搅拌后吸入1ml吸管内静置90秒；
k.将吸管内液体轻柔地打入离心管底，用预热的不完全1640培养液终止：吸1ml不完全1640培养液，2分钟内沿管壁加入；接着以每分钟1ml加入持续2分钟，改为每分钟2ml持续2分钟；再改为每分钟4ml直到20ml预热的不完全1640培养液加入完全，即离心800转/分，6分钟；
l.弃上清，先用6ml的1640完全培养液轻轻混悬沉淀，补加完全培养液至40ml左右；
m.将融合后的细胞悬液加入含饲养细胞的96孔板内，100ul/孔，置37℃、5％的二氧化碳细胞培养箱内。
2.3.5杂交瘤的选择
融合24小时后开始加入选择培养液，具体过程如下：
a.融合24小时后，以HAT 1.6ml及HT 0.4ml加入20ml完全1640培养液中混匀，加入96孔板内，50ul/孔；
b.隔2天后换液，将96孔板内每孔吸出150ul后，加入拟换的完全1640培养液(每60ml完全1640培养液中加入0.6ml的HAT和0.6ml的HT组成。)；
c.再隔2天后换液，将96孔板内每孔吸出150ul后，加入拟换的完全1640培养液(每60ml的完全1640培养液中加入1.2ml的HT组成。)；
d.2天后ELISA法检测杂交瘤上清：检测前一天，用包被缓冲液稀释peptide-BSA至15ug/ml，加入酶联免疫吸附板中，每孔100ul，置4℃冰箱过夜→用洗涤缓冲液洗涤包被板共3次，每次拍干→分别加入96孔细胞板内的上清，以未免疫的BLAB/c小鼠的血清为阴性对照，以效佳大于1∶10000的小鼠的血清为阳性对照，置37℃恒温水浴箱1小时→用洗涤缓冲液洗涤包被板共3次，每次拍干→每孔加入HRP标记的抗鼠IgG抗体100ul，以抗体稀释液稀释为1∶5000，置37度水浴箱1小时→用洗涤缓冲液洗涤包被板共3次，每次拍干→显色，每孔加入ABTS显色液100ul，置37℃恒温水浴箱10-15分钟→结果判定：于白色背景上，直接用肉眼观察反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅；
f.标记阳性孔，选用阳性孔内的细胞进行克隆化。
2.3.6杂交瘤的克隆化、扩大培养及冻存
杂交瘤的克隆化采用有限稀释法进行，具体方法如下：
a.制备饲养细胞悬液(脾细胞悬液)：拉颈处死未免疫的BLCB/c小鼠，置75％酒精中浸泡5分钟；无菌条件下取出小鼠脾脏放入青霉素小瓶中，用5ml不完全1640培养液冲洗后即将脾脏移于筛网内(此筛网置于平皿中)，加入约20ml完全1640培养液，以无菌的5ml玻璃注射器针芯研磨至脾脏为细末状，取平皿中的研磨液于无菌坡璃瓶中，加入完全1640培养液至80ml后再加入3.2ml的HT混匀，将此混匀的悬液分别加入96孔细胞培板内，100ul/孔，每块板的右下角的最后三孔(H10、H11、H12)不加饲养细胞悬液以备稀释用，将加好的板放入37℃、5％的二氧化碳细胞培养箱；
b.将要克隆化的孔里的细胞悬浮(以200ul枪轻吹即可)并计数，将此细胞悬液移于有饲养细胞的板中的稀释孔H10中，从H10孔中取出20ul细胞悬液放入H11孔中用完全1640培养液做10倍稀释，再从H11孔中取出20ul放入H12孔中做10倍稀释；
c.取H12孔中的细胞悬液用完全1640液稀释至理论上为1个细胞/100ul，再将此稀释液分别滴入含有饲养细胞悬液的96孔板中(每孔稀释后分滴为48孔)，每孔100ul；置37℃、5％的二氧化碳细胞培养箱培养；
d.1周后标记单克隆孔，以ELISA法(同前2.5.2.d)对单克隆孔的上清进行检测，选阳性孔内的细胞进行下一次的克隆化，如此反复三次后得到能稳定分泌单抗的杂交瘤(进行克隆化的一株细胞下一次克隆化的所有单克隆孔均为阳性)；
f.选取阳性最强的单克隆孔中的细胞转入24孔板中培养(1孔转1孔)，3天后于24孔板中分成2孔，再3天后分成4孔，再隔2天后将此4孔的细胞一并转入50ml细胞培养瓶扩大培养。
g.杂交瘤细胞的冻存：待50ml培养瓶内细胞铺满瓶底面积约70％时→将培养瓶中的细胞用吸管砍打，使其完全悬浮，将细胞悬液移于50ml无菌离心管内并计数，离心1200转/分，6分钟→弃上清，以细胞冻存液(细胞冻存液成份：50％小牛血清；40％不完全1640培养液；10％DMSO)重悬沉淀，调节细胞密度为1×107/L→分装于冻存管，1ml/支→置4℃冰箱1小时→转入-20℃冰箱放置2小时→再转入-70℃冰箱过夜→次日将冻存的细胞收藏于液氮缸内。
2.3.7单克隆抗体的大量生产
取10只8-10周龄的BALB/c雌性小鼠先用液体石蜡0.3ml/只腹腔注射预致敏，1周后收集杂交瘤细胞以1×106个/只(等量生理盐水稀释成1ml/只)的量腹腔注射上述预致敏的小鼠，10-14天后观察小鼠腹胀明显、行动迟缓、不思饮食且毛发错乱时即收集腹水，拉颈处死小鼠，用干净滴管将腹水吸入离心管中，离心2000转/分，5分钟，取中间液即得含大量单克隆抗体的腹水，置4℃冰箱备用。
2.4单克隆抗体亚类的鉴定
采用鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒，具体步骤参照其说明书如下：
a.每1ml包被液中加入9ml去离子水释稀成拟用的每块酶联板的包被液，再向此液体每10ml中加入100ul羊抗鼠免疫球蛋白；
b.向96孔酶联免疫吸附板中加入上一步配好的液体，100ul/孔，置4℃冰箱过夜；
c.次日倒出包被板孔内的液体，用干毛巾将包被板拍干，再以洗涤缓冲液洗涤包被板共3次，每次均用干毛巾拍干；
d.将封闭血清用PBS稀释4倍后加入拍干的包被板内，200ul/孔，置37℃恒温水浴箱1小时；
e.倒出包被板孔内的液体，以洗涤缓冲液洗涤包被板共3次，每次均用干毛巾拍干；
f.每孔加入待检的杂交瘤细胞培养液上清50ul，以未免疫的BLAB/c的血清为阴性对照，置37℃恒温水浴箱1小时；
g.倒出包被板孔内的液体，以PBS洗涤包被板共3次，每次均用干毛巾拍干；
h.向待检孔内加入抗不同亚类抗体的血清各100ul/孔，再向阴性对照孔内加入PBS，100ul/孔，置37℃恒温水浴箱1小时；
i.倒出包被板孔内的液体，以PBS洗涤包被板共3次，每次均用干毛巾拍干；
j.向每孔中加入稀释好的已用过氧化物酶标记的轭合物(用PBS稀释4000倍)，100ul/孔，置37℃恒温水浴箱1小时；
k.倒出包被板孔内的液体，以PBS洗涤包被板共3次，每次均用干毛巾拍干；
l.显色，每孔加入ABTS显色液100ul，置37℃恒温水浴箱10分钟。
n.结果判定：于白色背景上，直接用肉眼观察反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。
2.5免疫组织化学
2.5.1实验过程
a.二甲苯及梯度酒精脱水；
b.PBS洗共2次，5分钟/次；
c.加入3％的双氧水，置室温20分钟；
d.PBS洗共3次，5分钟/次；
e.湿盒预先在37℃中平衡30分钟，加10％正常山羊血清封闭液37℃于湿盒20分钟；
f.吸弃封闭液，勿洗，按1∶800加入新制备的单克隆抗体，湿盒中4℃过夜；g.PBS洗共3次，5分钟/次；
h.加生物素标记的羊抗鼠IgG，37℃于湿盒中30分钟；
i.PBS洗共3次，5分钟/次；
j.滴加SP工作液，湿盒中37℃孵育30分钟；
k.PBS洗共3次，5分钟/次；
l.DAB显色，自来水反复冲洗中止反应；
m.苏木精衬染；
n.梯度酒精及二甲苯透明封片。
2.5.2结果判定
a.显微镜下观察组织染色结果，参考文献的方法，分别根据染色强度和阳性细胞数比率给组织赋值：
染色强度：细胞膜、细胞浆呈淡棕色为弱阳性(1)，呈棕色为阳性(2)，深棕色为强阳性(3)，无信号为阴性(0)
阳性细胞数比率：无阳性细胞(0)；阳性细胞比率＜33％(0.33分)；阳性细胞比率＞33％，＜67％(0.67)；阳性细胞比率＞67-100％(1分)。
b.然后根据染色强度和阳性细胞比率得分的乘积判定各标本的染色得分。
2.6蛋白质印迹法(Western blotting)
2.6.1细胞总蛋白的制备
a.收获对数生长期的细胞约5×106，并以0.1MpH7.4的冷PBS离心洗涤并重悬两次；
b.以50μl细胞裂解液(含20mmol/l Tris base、150mmol/l NaCl、1％NP40、1mMEDTA、20mMNaF、1mMNa3VO4、0.1mmol/lPMSF和1mg/lAprotinin、1mg/lLeupeptin)重悬细胞并反复吹打3-5分钟，混匀后4℃冰浴30分钟；
c.于4℃离心机12000转/分，离心10分钟；
d.取上清作为细胞总蛋白，分装后储于-70℃备用；
e.以牛血清白蛋白作为标准品，测定样品蛋白质的浓度。
2.6.2十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)
a.按照常规方法制备分离胶和积层胶；
b.取一定量的蛋白质样品与等体积的2×SDS上样缓冲液(100mmol/lTrisbase、200mmol/l二硫苏糖醇、4％SDS、0.2溴芬兰、20％Glycerol)混合，于100℃变性5分钟；
c.按照每泳道100ug加载于不连续聚丙烯酰胺凝胶样品孔中；
d.以恒压50V(积层胶)/100V(分离胶)电泳至溴芬兰抵达凝胶底边；
e.取出凝胶用于Western blotting。
2.6.3Western blotting
a.SDS-PAGE凝胶经转移缓冲液(25mmol/lTris base、192mmpl/lDlycin、20％甲醛)浸泡10-20分钟；
b.按照3张滤纸、凝胶、NC膜、3张滤纸的顺序组装盒式转移塔，并将其以NC膜向阳极的方向装入转移装置；
c.于室温条件下，稳流0.8mA/cm2电转移，时间90分钟；
d.用丽春红染液对NC膜进行染色，标记笔标记蛋白分子量标准量各条带所在位置，再用去离子水洗去丽春红；
e.NC膜经10％脱脂奶粉于室温封闭2小时；
f.与稀释于5％脱脂奶粉抗体(新制备的单克隆抗体1∶1000，抗β-actin 1∶5000)4℃孵育过夜，TBST(10mmol/l Tris base、150mmol/lNaCl、0.05％Tween20、pH8.0)摇洗4次×15分钟；
g.与稀释于4％脱脂奶粉的HRP标记的羊抗兔IgG于室温孵育4小时；
h.TBST摇洗共4次，15分钟/次；
i.等量混合ECL显色系统中A+B液，滴加至NC膜；
j.X-ray胶片感光。
本发明说明书中所用的菌种是申请人在2007年1月11日在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》保藏的用于分泌抗URG4单抗的杂交瘤细胞株，分类命名为：杂交瘤细胞，它的保藏中心登记入册编号是：CGMCCNO.1908。