一种检测下呼吸道致病菌的基因芯片和试剂盒 【技术领域】
本发明涉及一种基因芯片和检测用试剂盒，尤其涉及一种检测下呼吸道致病菌的基因芯片和试剂盒。
背景技术
呼吸道感染是感染性疾病中最常见种类之一，约占感染性疾病的30％～40％，了解引起该类疾病的病原菌种类，特别是及时地培养、分离出致病菌，对疾病的临床诊断、药物选择及预后具有重要意义。
下呼吸道感染(气管炎、支气管炎、细支气管炎及肺炎)是严重威胁当今社会人群健康的感染性疾病。对于老年人和儿童这些免疫功能较弱者的危害尤其严重。流行病学研究表明，每年急性呼吸道感染造成约200万5岁以下的儿童死亡，是这个年龄组儿童的主要死亡原因。约75％肺炎死亡病例发生于1岁以下的婴儿，而约1％的肺炎病例会留下后遗症(如支气管扩张)，这些后遗症增加再次感染的危险性。在美国，肺炎在所有死亡原因中列第6位，是最常见的致命性院内获得性感染。
根据关于下呼吸道发表文献和医院下呼吸道感染数据分析，引起下呼吸道感染的最常见细菌为：金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌和卡他莫拉菌。
国标中临床致病菌的方法多是采用传统的分离培养和生化鉴定的方法，报告检验结果大致需5～7天，加之检验方法繁琐、费时费力。与实验诊断的其他科学相比，临床微生物诊断方法的发展相对滞后。
1997年7月，Affymetrics，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.等人发明的第6,228,575号美国专利公开了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的核酸分析检测技术建立起来，并随着人类基因组计划的开展而逐步发展。该技术综合运用了分子生物学、集成电路制造、计算机、半导体、共聚焦激光扫描、荧光标记等技术，使检测过程具有敏感性高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便快捷、效率高等特点，在基因表达相关研究和生物制药研究等方面得到普遍应用。因此，如果将基因芯片技术用于细菌的鉴定，不仅可以大大简化检测手段，提高检测速度，而且具有高准确性、高灵敏度、高通量、可重复性强等诸多优点。
目前最常使用的微生物鉴定的靶分子是16S rRNA和23S rRNA，国内外已有很多文献报道。利用16S rRNA和23S rRNA可将细菌微生物鉴定至种或属，但是对于亲缘关系较近的细菌种或属的鉴定十分困难(BodrossyL，Sessitsch A.2004.Oligonucleotide microarrays in microbial diagnostics.Current Opinion in Microbiology.7：245-25)。目前利用16S-23S rRNA间区作为靶分子进行细菌的鉴定已经逐渐成为研究的热点(Nubel U，SchmidtPM，ReiβE，et al.2004.Oligonucleotide microarray for identification ofBacillus anthracis based on intergenic transcribed spacers in ribosomal DNA.FEMS Microbiology Letters 240：215-223.)，它的变异速率相当于16SrRNA或者23S rRNA的十倍，因此具有更高的分辨率，甚至可将细菌区分到型，对于亲缘关系较近的种属的区分具有16S rRNA和23S rRNA不可比拟的优势。同时两端是保守的16S rRNA基因和23S rRNA基因区，可在两端的保守区设计通用引物可避免了多对引物带来的引物二聚体的问题，长度在200bp-1000bp之间，大小易于操作，因而靶序列的扩增和标记过程更加简化，也更容易控制，符合操作简便快捷的实际要求。
【发明内容】
本发明的一个目的是提供一种检测下呼吸道致病菌的基因芯片，以弥补传统临床下呼吸道致病菌检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。
本发明所述的检测下呼吸道致病菌的基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡聚核苷酸探针，其中所述的该寡聚核苷酸探针包含从以下序列中选取的一种或多种序列：
(1)从金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌或鲍曼不动杆菌的16S-23SrDNA间区、铜绿假单胞菌或流感嗜血杆菌的16S基因、肺炎链球菌或嗜肺军团菌的gyrB基因、卡他莫拉的copB基因的一种或多种DNA序列中选取的序列；
(2)上述(1)中选取的DNA序列的互补DNA序列；
(3)上述(1)或(2)中选取的DNA序列的互补RNA序列。
其中，上述的从金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌或鲍曼不动杆菌的16S-23S rDNA间区、铜绿假单胞菌或流感嗜血杆菌的16S基因、肺炎链球菌或嗜肺军团菌的gyrB基因、卡他莫拉的copB基因中选取的DNA片段具有SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：28所示地DNA序列中的一种或多种DNA序列。
其中，上述的寡聚核苷酸探针还包含阳性对照探针和阴性对照探针。上述的阳性对照探针优选具有SEQ ID NO：1和/或SEQ ID NO：2所示的DNA序列。
本发明的另一目的是提供上述的基因芯片的应用，其可用于金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌或卡他莫拉菌中至少一种致病菌的检测。
其中，所应用的检测引物具有SEQ ID NO：29-SEQ ID NO：36所示的DNA序列或其互补DNA序列的至少一种。
本发明的再一目的是提供一种检测下呼吸道致病菌的试剂盒，该试剂盒包含上述的基因芯片，所述基因芯片包含SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：28所示的DNA序列中的一种或多种DNA序列。该试剂盒还包含检测引物，该检测引物优选具有SEQ ID NO：29-SEQ ID NO：36所示的DNA序列或其互补DNA序列的至少一种。
本发明的试剂盒还包含杂交盒、杂交液或分析鉴定结果用的判读软件以及说明书。
本发明的再一目的是提供上述的试剂盒的应用，其可用于金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌和卡他莫拉菌中至少一种致病菌的检测。
由上述的技术方案可见，本发明首次将基因芯片技术引入下呼吸道常见致病菌检测领域，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的下呼吸道常见致病菌检测基因芯片及其检测方法，利用本发明的基因芯片可以达到检测下呼吸道常见的致病菌的目的，由于操作简便，准确性高，重复性强，对于医院临床检验部门有重要的应用价值。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
【附图说明】
图1为本发明基因芯片的一个实施例的外形示意图。
图2为本发明基因芯片的一个实施例上单一点阵探针排布规律示意图。
图3A为利用本发明的基因芯片检测下呼吸道金黄色葡萄球菌时的杂交结果。
图3B为利用本发明的基因芯片检测下呼吸道肺炎克雷伯菌时的杂交结果。
图3C为利用本发明的基因芯片检测下呼吸道铜绿假单胞菌时的杂交结果。
图3D为利用本发明的基因芯片检测下呼吸道卡他莫拉菌时的杂交结果。
图3E为利用本发明的基因芯片检测下呼吸道流感嗜血杆菌时的杂交结果。
图3F为利用本发明的基因芯片检测下呼吸道肺炎链球菌菌时的杂交结果。
图3G为利用本发明的基因芯片检测下呼吸道鲍曼不动杆菌时的杂交结果。
图3H为利用本发明的基因芯片检测下呼吸道嗜肺军团菌时的杂交结果。
【具体实施方式】
实施例1探针的设计和制备
1.序列获得：
(1)细菌16s rDNA序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到八种菌(金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌和卡他莫拉菌)的全部16srDNA序列。
(2)16S-23S rDNA间区序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌及他们的近缘菌的所有16S-23S rDNA间区序列。
肺炎克雷伯氏菌的间区序列公共数据库中仅有9株菌的21条间区序列，产酸克雷伯氏菌的间区序列只有1株菌的1条序列，满足不了筛选特异探针的需求。本实验室对22株肺炎克雷伯氏菌，3株臭鼻克雷伯氏菌，2株鼻硬结克雷伯氏菌，4株产酸克雷伯氏菌，1株土生克雷伯氏菌和1株植生克雷伯氏菌和2株解鸟氨酸克雷伯氏菌进行了间区的测序。用上述从16s rDNA和23s rDNA序列设计的引物扩增间区，PCR产物纯化后连接到T载体上，后电转进DH5α感受态中，挑取含500bp-1kbp的质粒测序，测序仪ABI 3700。测得的序列用Staden Package软件拼接，从而得到肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌及其近缘菌的间区序列。
(3)copB基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到卡他莫拉菌的全部copB基因序列。
(4)gyrB基因序列的获得：从GenBank公共数据库下载得到肺炎链球菌和嗜肺军团菌的全部gyrB基因序列。
2.探针设计：
(1)细菌的通用探针：八种菌全部的16s rDNA序列及其他菌的16srDNA序列导入Glustal X软件中，选取靠近间区的一段16s rDNA保守序列作为探针，满足长度27bp±2bp，Tm值68℃±3℃。
(2)间区探针：分别将金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌的所有16S-23S rDNA间区序列导入Glustal X软件中，从而得知该菌的间区序列有几种类型，每种类型选取一条代表序列在公共数据NCBI中作blastn比对，确定可否作为特异靶点以及特异靶点的位置。对照GlustalX比对结果，选取满足不同株间该区段都保守的性质，同时长度27bp±3bp，Tm值68℃±3℃。
(3)copB基因探针：将上述从GenBank公共数据库下载得到的卡他莫拉菌的copB基因序列用序列比对软件Glustal X比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入OligoArray2.0软件中，参数设定如下：-n 20；-l 30；-L 40；-D 3000；-t 79；-T 90；-s 65℃；-x 65℃；-N 2；-p 33，-P 65；-m GGGGG CCCCC TTTTT AAAAA；-g 15。运行程序在线设计探针。从输出结果中选择长度在27bp±2bp，Tm值68℃±3℃的探针。
(4)gyrB基因探针：将上述下载肺炎链球菌和嗜肺军团菌的gyrB序列导入Glustal X软件中，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入OligoArray2.0软件中，参数设定如下：-n 20；-l 30；-L 40；-D 3000；-t 79；-T 90；-s 65℃；-x 65℃；-N 2；-p 33，-P 65；-m GGGGG CCCCC TTTTTAAAAA；-g 15。运行程序在线设计探针。从输出结果中选择长度在27bp±2bp，Tm值68℃±3℃的探针。
3.探针合成：将下表1中的探针序列的5’端延长15个T(表1所示的荧光探针序列中没有包含延长的10个T)并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。
4.探针筛选：将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在玻璃片基上制成基因芯片，通过杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的探针。
在本发明的优选实施例中，选择了30条长度在35bp±2bp、Tm75℃±2℃的探针，并通过269次杂交实验进行探针筛选，最终得到如表1所示的探针。其中，编号为NO.1(SEQ ID NO：1)的探针序列选自所有细菌的16s rDNA，作为阳性对照用来检测是否有细菌，编号为NO.2的探针作为荧光探针，编号为NO.3(SEQ ID NO：2)负对照用来检测是否有细菌，编号为NO.4的探针为50％的DMSO，用作空白对照，编号NO.5-NO.11的7条探针序列(SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：9)选自金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和鲍曼不动杆菌的16S-23S rDNA间区，编号NO.12-NO.18的7条探针序列(SEQ ID NO：10-SEQ ID NO：16)选自铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌的16S基因，编号NO.19-NO.22的4条探针序列(SEQ IDNO：17-SEQ ID NO：20)选自肺炎链球菌的gyrB基因，编号NO.23-NO.26的4条探针序列(SEQ ID NO：21-SEQ ID NO：24)选自卡他莫拉的copB基因中，编号NO.27-NO.30的4条探针序列(SEQ ID NO：25-SEQ IDNO：28)选自嗜肺军团菌的gyrB基因中。
表1：本发明基因芯片上选用的寡核苷酸探针序列及可检测出的致病菌
探针 编号 SEQ ID 探针序列(5’-3’) 可检测出 的致病菌 NO.1 NO：1 TTGTACACACCGCCCGTCACACCAT 细菌正对照 NO.2 Cy3_TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 荧光探针 NO.3 NO：2 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 细菌负对照 NO.4 50％DMSO 空白对照 NO.5 NO：3 GCTTATGCGAGCGCTTGACAATCTA TTCT 金黄色葡萄 球菌 NO.6 NO：4 TAAAGCAGTATGCGAGCGCTTGACT AAA 金黄色葡萄 球菌 NO.7 NO：5 ATGTGAACGTTTGACTTATAAAAAT GGTGG 金黄色葡萄 球菌 NO.8 NO：6 ATTTGAAGAGGTTGCAAACGATGG G 肺炎克雷伯 氏菌 NO.9 NO：7 GGCCTACCAAATTTGCGAAGCAA 肺炎克雷伯 氏菌 NO.1 0 NO：8 TCATTATCACGGTAATTAGTGTGAT CTGACG 鲍曼不动杆 菌 NO.1 1 NO：9 AGTGTGATCTGACGAAGACACATTA ACTCATT 鲍曼不动杆 菌 NO.1 2 NO：10 TCATACGTCCTGAGGGAGAAAGTG 铜绿假单胞 菌 NO.1 3 NO：11 GGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGT 铜绿假单胞 菌 NO.1 4 NO：12 ATGAAGGGAGCTTGCTCCTGGAT 铜绿假单胞 菌
探针 编号 SEQ ID 探针序列(5’-3’) 可检测出 的致病菌 NO.1 5 NO：13 TCCGTTGGGATCCTTGAGATC 铜绿假单胞 菌 NO.1 6 NO：14 CGGTAGCAGGAGAAAGCTTGCTTTC TTG 流感嗜血杆 菌 NO.1 7 NO：15 TTTGGGGGTTGGGGTTTAACTCTGG CG 流感嗜血杆 菌 NO.1 8 NO：16 GTTGGGGTTTAACTCTGGCGCCCGT A 流感嗜血杆 菌 NO.1 9 NO：17 AAGCGCCAAGGTTTGGAACAAACC AAG 肺炎链球菌 NO.2 0 NO：18 GCGCCAAGGTTTGGAACAAACCAA GC 肺炎链球菌 NO.2 1 NO：19 AGCGCCAAGGTTTGGAACAAACCA AG 肺炎链球菌 NO.2 NO：20 GGACCCAAAAATCTTCACTGAAACA 肺炎链球菌 2 ACAATC NO.2 3 NO：21 GCCATTGACCTAAAAATTGACAACG CTTA 卡他莫拉菌 NO.2 4 NO：22 CACCAAGGTCGCTTTATGCTAGACC CT 卡他莫拉菌 NO.2 5 NO：23 AGACGAAAGCACGGCTACAGATTT GCG 卡他莫拉菌 NO.2 6 NO：24 TACTTCTCAATTTGTCAGCATTCGTG GCA 卡他莫拉菌 NO.2 7 NO：25 GCATTTGCTAGTGCGTAGACATGGA A 嗜肺军团菌
探针 编号 SEQ ID 探针序列(5’-3’) 可检测出 的致病菌 NO.2 8 NO：26 CTAGCTAAAAGATTACGTGAATTGT C 嗜肺军团菌 NO.2 9 NO：27 GAGCACTTAAATAAAAATAAAACA CCAGT 嗜肺军团菌 NO.3 0 NO：28 GTATCTCCAACAGGTGATGATGCTC G 嗜肺军团菌
实施例2引物的设计和制备
1.序列获得：同前设计探针的序列。
2.设计引物：
(1)扩增间区序列引物的设计：从公共数据库NCBI中下载得到的8种细菌的16S rDNA用序列比对软件Glustal X比对后，选取靠近间区的一段16s rDNA保守序列作为上游引物，长度符合Tm值50℃±5℃、长度17bp±2bp、Hairpin：NONE、Dimer：NONE、False Priming：NONE、Cross Dimer：NONE，且包含细菌通用探针序列在内。
(2)扩增copB基因序列引物的设计：将上述从GenBank公共数据库下载得到的卡他莫拉copB基因序列用序列比对软件Glustal X比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入引物设计软件Primer Premier 5.0软件中，相应参数设定如下：Search For：PCR Primers，Search types：Both.Search Ranges：Sense Primer 1to 672，Anti-sense Primer 1to 672，PCRProduct Size：100bp to 1000bp.Primer Length：20bp±2bp.Search Mode：Automatic。从输出结果中选取Tm值50℃±5℃、长度17bp±2bp、Hairpin：NONE、Dimer：NONE、False Priming：NONE、Cross Dimer：NONE且包含探针序列在内的引物。
(3)扩增gyrB基因序列引物的设计：将上述下载得到的所有肺炎链球和嗜肺军团菌菌gyrB基因序列用序列比对软件Glustal X比对，找到该基因的保守区段，将该保守区段导入引物设计软件Primer Premier 5.0软件中，相应参数设定如下：Search For：PCR Primers，Search types：Both.SearchRanges：Sense Primer 1to 2415，Anti-sense Primer 1to 2415，PCR ProductSize：100bp to 1000bp.Primer Length：20bp±2bp.Search Mode：Automatic。从输出结果中选取Tm值50℃±5℃、长度17bp±2bp、Hairpin：NONE、Dimer：NONE、False Priming：NONE、Cross Dimer：NONE且包含探针序列在内的引物。
3.引物合成：将下表2中的引物序列委托引物合成公司(北京奥科)合成，备用。
4.引物筛选：将合成好的引物溶解并适量稀释，一方面通过PCR反应分别扩增16S-23S rDNA间区、16S基因、卡他莫拉copB基因和肺炎链球菌、嗜肺军团菌的gyrB基因序列检测引物的扩增性，另一发面，四对引物同时对8种菌的不同菌株进行扩增检测四对引物的相容性，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的引物。
在本发明的优选实施例中，选取了既包含探针又适合同时使用4对引物扩增8种下呼吸道常见致病菌(金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌和卡他莫拉菌的)DNA的引物8条，为适应同时四对引物的PCR，经生物信息学初筛并通过大量PCR实验筛选，筛选出如表2所示的适用引物。
表2用于下呼吸道中8种常见致病菌检测DNA的PCR扩增的引物序列
引物编号 SEQ ID 引物序列(5’-3’) 扩增作用 P-1 NO：29 TGTACACACCGCCCGTC 16S-23S rDNA 间区上游引物 P-2 NO：30 GGTACTTAGATGTTTCAGTTC 16S-23S rDNA 间区下游引物 P-3 NO：31 AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 16S基因上游 引物 P-4 NO：32 CCGTCAATTCMTTTRAGTTT 16S基因上游 引物 P-5 NO：33 GAAAGGGCATTMACMACWGA 肺炎链球菌和 嗜肺军团菌 gyrB基因上游 引物 P-6 NO：34 GWGTSAYTTCACGMGCACGC 肺炎链球菌和 嗜肺军团菌 gyrB基因下游 引物 P-7 NO：35 GGTGAGTGCCGCTTTTACA 卡他莫拉copB 基因上游引物 P-8 NO：36 GARTYRCGYCCATGYTCTAA 卡他莫拉copB 基因下游引物
实施例3基因芯片制备——芯片点样
1.溶解探针：将实施例1中合成的探针分别溶解于50％DMSO溶液中，稀释使探针的终浓度达到1μg/μl。
2.加板：将溶解好的探针加入384孔板的相应位置，每孔10μl。
3.点样：将如图1所示的57.5mm×25.5mm×1mm(长×宽×高)的洁净的醛基化玻片(CELAssociates，Inc.)放到芯片点样仪(Spotarray 72)的载物台上，使用SpotArray的控制软件(Tele chem SMP3 stealth pin)，运行程序，按图2所示的排布方式点在醛基化的玻片上4.5mm×4.5mm的点样区内，构成中低密度DNA微矩阵，玻片上的六个点阵区内阵列排布规律相同。点阵区域尺寸3mm×2.25mm，该点阵内点间距250μm，矩阵：12×9，12×250μm＝3mm，9×250μm＝2.25mm，标准片基尺寸：75.5mm×25.5mm×1mm。
4.干燥：将点好的芯片室温下过夜干燥，然后在45℃烘箱干燥2小时。
5.交联：用交联仪(uvpcl-2000M ultraciolet Crosslinker)600J交联2次。将交联好的芯片放回洁净芯片盒中，备用。
由图2可见，每个点样区内为12(行)×8(列)个探针点。NO.1框区示意的位置为检测细菌16S基因的正对照探针，NO.2框区示意的位置为荧光探针，NO.3框区示意的位置为检测细菌ITS基因的正对照探针，其它为各致病菌的特异探针(对应于表1中的相应探针编号)。
实施例4利用基因芯片快速检测下呼吸道样品中常见致病菌
1.样品处理：医院采集痰样，标本接于预先配制好的225ml 2YT培养基中，37℃，200rpm过夜振荡培养。
2.提取基因组：1ml过夜培养的样品8000rpm离心5分钟沉淀可能存在的致病菌菌体，弃上清(尽量空干)。向沉淀中加入100ul去离子水重悬，8000rpm，离心5分钟，去除上清。加入100ul的裂解液(配方如下)，100℃沸水浴15分钟，12000rpm离心3分钟，上清即为粗提的DNA模板。
附：裂解液配方：
1×PCR缓冲液(含Mg+)
0.5％的NP 40
0.5％的Tween 20
3.扩增靶序列：取上述基因组提取方法提取的3ul中层上清作为模板加入PCR反应混合液中，PCR反应混合液配方如下表3所示。(注：以下表3-表4中的PCR缓冲液、MgCl2、dNTP混合物，Taq酶均购自Sangon公司)
表3Multiplex PCR反应混合液配方
注：表中P-1至P-2以及P-3和P-4为表2中所列的引物。将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃5分钟
94℃30秒
52℃45秒
72℃1分钟回到第二步，共35个循环
72℃5分钟
4℃20分钟
3.纯化：将上述获得的PCR扩增产物用纯化柱(MILIPORE公司)纯化，具体步骤如下：
(1)将PCR产物转移至纯化柱中，加水补足至400μl。
(2)25℃、6000rpm离心15分钟，丢弃收集管。
(3)将纯化柱转移到新的1.5ml的离心管中，加入25μl的超纯水(MilliQ)，37℃放置5分钟。
(4)将纯化柱倒置放在1.5ml的离心管上，6000rpm离心2分钟，收集产物。
4.标记靶序列：取12μl纯化产物，加入标记混合液中，标记反应混合液配方如下表4所示。
表4标记混合液配方
注：表中P-2和P-4为表2中所列的引物。
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃5分钟
94℃30秒
52℃45秒
72℃1分钟回到第二步，共35个循环
72℃5分钟
4℃20分钟
5.烘干：将标记产物置65℃烘箱烘干。
6.杂交：向杂交盒(博奥公司)内预加入70μl ddH2O以保持湿度。12μl杂交液(配方如下所示)回溶烘干产物并加在实施例三中制备的下呼吸道常见致病菌检测基因芯片的探针阵列区域，盖上定制的盖片(博奥公司)(注意盖片和载玻片之间不能有气泡)，盖紧杂交盒，40℃水浴锅中杂交16小时。
7.洗涤：杂交到时，取出杂交盒，去除盖片，将基因芯片依次在洗液A中洗涤3分钟，洗液B中洗涤3分钟，洗液C中洗涤90秒，空气中风干。
杂交液配方：10％硫酸葡聚糖(dextran Sulfate)；25％甲酰胺(formamide)；0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)；6×SSPE
洗液A：1×SSC(氯化钠-柠檬酸钠溶液)；0.1％SDS
洗液B：0.05×SSC
洗液C：95％乙醇
8.扫描：用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪(AXONinstrument)扫描，所用参数如下：
软件及版本：GenePix Pro 6.0
official name：575DF35
PMT Gain：550
扫描分辨率：10μm
扫描结果存为JPG、TIF、GPR格式
用本发明的基因芯片检测下呼吸道致病菌(金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌和卡他莫拉菌)时的杂交扫描结果如图3A-3J所示。
9.分析判读：根据扫描出的杂交图像，以正对照探针的位置作为图像坐标，判断出现荧光信号的特异探针的位置，对照点阵排布图判断出致病菌。若只有正对照探针有信号，则不存在此八种致病菌。
实施例5 对基因芯片进行特异性鉴定和灵敏度检测
对实施例3中制备的下呼吸道常见致病菌检测基因芯片的特异性进行鉴定如下：
总计用141株致病菌的标准株和检出株以及他们的近缘菌株来鉴定实施例三中制备的下呼吸道中常见致病菌检测基因芯片的特异性。在该特异性鉴定试验中，使用的所有菌株情况见表5。利用本发明的基因芯片和上述检测方法进行杂交检测，均显示了正确的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有良好的特异性。
表5：特异性试验用到的菌株
a，中科院微生物研究所(As)。
b，中国医学微生物菌种保藏中心(CMCC)。
c，澳大利亚医学与兽医学研究所(IMVS)。
d，流行病学微生物学研究所(IEM)，中国预防医学研究会。
e，英国国家菌种保藏中心(NCTC)。
f，德国微生物和细胞保藏中心(DSMZ)。
g，瑞典哥德堡大学培养物保藏中心(CCUG)。
h，中国农业微生物菌种保藏中心(ACCC)。
i，中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)。
j，捷克微生物保藏中心(CCM)
k，美国典型菌种保藏中心(ATCC)。
l，德国科隆大学医学微生物学院(IMIH)。
m，澳大利亚新南威尔士州疾病感染和微生物中心(CIDM)。
n，比利时菌种中心(LMG)。
o，中国兽医学菌种国家保藏中心(CVCC)。
p，中国军事科学医学院(AMMS)。
q，来自于深圳疾病控制与预防中心的临床菌株。
r，来自于天津中医药大学的临床菌株。
s，来自于天津人民医院的临床菌株。
t，来自于天津一中心医院的临床菌株。
u，来自于天津三中心医院的临床菌株。
v，来自于天津儿童医院的临床菌株。
w，来自于天津南开医院的临床菌株。
x，来自天津出入境检验检疫局的检出株。
对实施例3中制备的下呼吸道中常见致病菌检测基因芯片的灵敏度进行检测如下：
该基因芯片的检测灵敏度经过107次杂交实验的验证，0.1ng的微量基因组DNA或每25g(ml)痰液中有(1-5)cfu就可保证上述8种致病菌具有稳定、良好的杂交结果，这说明本发明的基因芯片具有很高的检测灵敏度。
根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以做出各种可能的等同改变或替换，而所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。
【序列表】
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>一种检测下呼吸道致病菌的基因芯片和试剂盒
<130>8P13003-CN
<160>34
<170>Patent In version 3.2
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>基于细菌16SrDNA保守区设计并人工合成的正对照探针序列
<400>1
ttgtacacac cgcccgtcac accat 25
<210>2
<211>52
<212>DNA
<213>负对照
<400>2
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tt 52
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>基于金黄色葡萄球菌的16S-23S rDNA间区设计并人工合成的探针序列
<400>3
gcttatgcga gcgcttgaca atctattct 29
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>基于金黄色葡萄球菌的16S-23S rDNA间区设计并人工合成的探针序列
<400>4
taaagcagta tgcgagcgct tgactaaa 28
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>基于金黄色葡萄球菌的16S-23S rDNA间区设计并人工合成的探针序列
<400>5
atgtgaacgt ttgacttata aaaatggtgg 30
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>基于肺炎克雷伯氏菌的16S-23S rDNA间区设计并人工合成的探针序列
<400>6
atttgaagag gttgcaaacg atggg 25
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>基于肺炎克雷伯氏菌的16S-23S rDNA间区设计并人工合成的探针序列
<400>7
ggcctaccaa atttgcgaag caa 23
<210>8
<211>31
<212>DNA
<213>基于鲍曼不动杆菌的16S-23S rDNA间区设计并人工合成的探针序列
<400>8
tcattatcac ggtaattagt gtgatctgac g 31
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>基于鲍曼不动杆菌的16S-23S rDNA间区设计并人工合成的探针序列
<400>9
agtgtgatct gacgaagaca cattaactca tt 32
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>基于铜绿假单胞菌的16S DNA设计并人工合成的探针序列
<400>10
tcatacgtcc tgagggagaa agtg 24
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>基于铜绿假单胞菌的16S DNA设计并人工合成的探针序列
<400>11
gggcagtaag ttaatacctt gctgt 25
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>基于铜绿假单胞菌的16S DNA设计并人工合成的探针序列
<400>12
atgaagggag cttgctcctg gat 23
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>基于铜绿假单胞菌的16S DNA设计并人工合成的探针序列
<400>13
tccgttggga tccttgagat c 21
<210>14
<211>28
<212>DNA
<213>基于流感嗜血杆菌的16S DNA设计并人工合成的探针序列
<400>14
cggtagcagg agaaagcttg ctttcttg 28
<210>15
<211>27
<212>DNA
<213>基于流感嗜血杆菌的16S DNA设计并人工合成的探针序列
<400>15
tttgggggtt ggggtttaac tctggcg 27
<210>16
<211>26
<212>DNA
<213>基于流感嗜血杆菌的16S DNA设计并人工合成的探针序列
<400>16
gttggggttt aactctggcg cccgta 26
<210>17
<211>27
<212>DNA
<213>基于肺炎链球菌的gyrB基因设计并人工合成的探针序列
<400>17
aagcgccaag gtttggaaca aaccaag 27
<210>18
<211>26
<212>DNA
<213>基于肺炎链球菌的gyrB基因设计并人工合成的探针序列
<400>18
gcgccaaggt ttggaacaaa ccaagc 26
<210>19
<211>26
<212>DNA
<213>基于肺炎链球菌的gyrB基因设计并人工合成的探针序列
<400>19
agcgccaagg tttggaacaa accaag 26
<210>20
<211>31
<212>DNA
<213>基于肺炎链球菌的gyrB基因设计并人工合成的探针序列
<400>20
ggacccaaaa atcttcactg aaacaacaat c 31
<210>21
<211>29
<212>DNA
<213>基于卡他莫拉菌的copB基因设计并人工合成的探针序列
<400>21
gccattgacc taaaaattga caacgct 29
<210>22
<211>27
<212>DNA
<213>基于卡他莫拉菌的copB基因设计并人工合成的探针序列
<400>22
caccaaggtc gctttatgct agaccct 27
<210>23
<211>27
<212>DNA
<213>基于卡他莫拉菌的copB基因设计并人工合成的探针序列
<400>23
agacgaaagc acggctacag atttgcg 27
<210>24
<211>29
<212>DNA
<213>基于卡他莫拉菌的copB基因设计并人工合成的探针序列
<400>24
tacttctcaa tttgtcagca ttcgtggca 29
<210>25
<211>26
<212>DNA
<213>基于嗜肺军团菌的gyrB基因设计并人工合成的探针序列
<400>25
gcatttgcta gtgcgtagac atggaa 26
<210>26
<211>26
<212>DNA
<213>基于嗜肺军团菌的gyrB基因设计并人工合成的探针序列
<400>26
ctagctaaaa gattacgtga attgtc 26
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>基于嗜肺军团菌的gyrB基因设计并人工合成的探针序列
<400>27
gagcactt aa ataaaaataa aacaccagt 29
<210>28
<211>26
<212>DNA
<213>基于嗜肺军团菌的gyrB基因设计并人工合成的探针序列
<400>28
gtatctccaa caggtgatga tgctcg 26
<210>29
<211>17
<212>DNA
<213>基于金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、
卡他莫拉菌和嗜肺军团菌16S-23S rDNA间区设计并人工合成的通用检测用上游引物序列
<400>29
tgtacacacc gcccgtc 17
<210>30
<211>21
<212>DNA
<213>基于金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、
卡他莫拉菌和嗜肺军团菌16S rDNA设计并人工合成的通用检测用下游引物序列
<400>30
ggtacttaga tgtttcagtt c 21
<210>31
<211>20
<212>DNA
<213>基于金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌
卡他莫拉菌和嗜肺军团菌16S rDNA设计并人工合成的通用检测用上游引物序列
<400>31
agagtttgat cmtggctcag 20
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>基于金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、
卡他莫拉菌和嗜肺军团菌16S-23S rDNA间区设计并人工合成的通用检测用上游引物序列
<400>32
ccgtcaattc mtttragttt 20
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>基于肺炎链球菌和嗜肺军团菌gyrB基因设计并人工合成的检测用上游引物序列
<400>33
gaaagggcat tmacmacwga 20
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>基于肺炎链球菌和嗜肺军团菌gyrB基因设计并人工合成的检测用下游引物序列
<400>34
gwgtsayttc acgmgcacgc 20
<210>35
<211>19
<212>DNA
<213>基于卡他莫拉copB基因设计并人工合成的检测用上游引物序列
<400>35
ggtgagtgcc gcttttaca 19
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>基于卡他莫拉copB基因设计并人工合成的检测用下游引物序列
<400>36
gartyrcgyc catgytctaa 20