一种芳香族多烯抗生素的发酵生产工艺 【技术领域】
本发明涉及发酵领域，更具体地涉及一种芳香族多烯抗生素的发酵生产方法。
背景技术
芳香族多烯抗生素是一类抗生素，它主要通过与真核细胞膜的固醇相互作用，形成通道从而引起小分子丢失而导致细胞死亡。
芳香族多烯大环内酯抗真菌抗生素如两性霉素在应用中受到限制，其主要因素是它的毒性太强，尤其是肾毒性。
在芳香族多烯大环内酯抗真菌抗生素如两性霉素的药理研究中发现，化学合成的C-16位为甲基侧链的两性霉素衍生物比两性霉素(其C-16位为羧基侧链)的毒性大大降低。
梁蓉芳等人在研究农抗5192产生菌原生质体融合育种的过程中发现了一种新的能够产生抗生素的链霉菌菌株，即链霉菌FR-008。经过化学结构分析表明，该链霉菌菌株的次级代谢产物FR-008，与杀念菌素(Candicidin)的化学结构是相同的(梁蓉芳，周启.农抗5102产生菌原生质体融合育种的研究。生物工程学报，1987，3，130-136；申请号为CN200310108746.6的中国专利申请“七烯大环内酯聚酮抗生素FR-008复合物”)。
与两性霉素相比，代谢产物FR-008或杀念菌素除多了芳香环侧链外，38元大环内酯及侧链以及糖基都很相似，因此，FR-008或杀念菌素环外羧基脱掉以后，其衍生聚酮抗生素的毒性亦大大降低。
上海交通大学邓子新院士等人采用组合生物合成方法，合成了一系列抗生素FR-008或杀念菌素基因工程衍生化合物。其中包括糖基转移酶基因fscMI中断突变菌株CS101、酮糖转氨酶基因fscMII中断突变菌株CS102和细胞色素P450单氧化酶基因fscP基因中断突变株CS103分别发酵培养得到的基因工程衍生物CS101、CS102和CS103。这些化合物有较强的抗真菌活性，而且其中有些化合物毒性较FR-008或杀念菌素大大降低，具有较高的临床开发前景。参见申请号为CN200310108746.6的中国专利申请“七烯大环内酯聚酮抗生素FR-008复合物”、申请号为CN200310108745.1的中国专利申请“脱糖和脱氨糖FR-008衍生聚酮抗生素”和申请号为CN200710037060.0的中国专利申请“脱羧FR-008衍生聚酮抗生素及其应用”。这些化合物可用来防止前列腺肿大和杀灭蚊子幼虫以及用来防止阴道滴虫感染和念珠菌阴道炎(又称霉菌性阴道炎)。这些七烯大环内酯聚酮抗生素还可抗细菌。
然而，通过基因工程来生产这些芳香族多烯抗生素的产量很低，通常仅10mg/L发酵液左右，因而制约了这些芳香族多烯抗生素的临床试验和产业化的进程。
综上所述，本领域迫切需要开发一种高效地、通过发酵生产芳香族多烯抗生素的方法。
【发明内容】
本发明的目的就是提供一种高效地、通过发酵生产芳香族多烯抗生素的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种发酵生产芳香族多烯抗生素的方法，所述方法包括：
(1)将生产芳香族多烯抗生素的工程菌接种于发酵培养基，并在pH7.6-8.5下进行发酵培养12-60小时，从而使所述工程菌发酵产生对氨基苯甲酸；
(2)调节pH，并在pH6.4-7.4下继续发酵培养所述的工程菌，从而使所述工程菌将对氨基苯甲酸转化为芳香族多烯抗生素；和
(3)从发酵液中分离出所述的芳香族多烯抗生素。
在另一优选例中，在所述步骤(1)中pH维持在7.8-8.2；和/或
在所述步骤(2)中，pH维持在6.5-7.2。
在另一优选例中，在步骤(1)中，并在pH7.6-8.5下进行发酵培养18-48小时，更佳地培养20-36小时。
在另一优选例中，在步骤(2)中还包括向发酵体系中补加对氨基苯甲酸。
在另一优选例中，所述生产芳香族多烯抗生素的工程菌选自下组：链霉菌FR-008、糖基转移酶基因fscMI中断突变菌株CS101、酮糖转氨酶基因fscMII中断突变菌株CS102、或细胞色素P450单氧化酶基因fscP中断突变株CS103。
在另一优选例中，所述芳香族多烯抗生素包括芳香族多烯大环内酯抗生素；更佳地所述的芳香族多烯抗生素包括七烯大环内酯聚酮抗生素。
在另一优选例中，所述的芳香族多烯抗生素选自下组：抗生素FR-008、杀念菌素、糖基转移酶基因fscMI中断突变菌株CS101培养得到的脱糖基化合物CS101、酮糖转氨酶基因fscMII中断突变菌株CS102培养得到的脱氨糖化合物CS102、或细胞色素P450单氧化酶基因fscP中断突变株CS103培养得到的FR-008脱羧衍生聚酮抗生素CS103。
在另一优选例中，在步骤(1)中，还包括测定发酵液中所述芳香族多烯抗生素的浓度，从而判断所述工程菌是否开始生产芳香族多烯抗生素。
在另一优选例中，对氨基苯甲酸的总共添加量为0.002-0.2g/L发酵液，更佳地为0.01-0.1g/L。
在另一优选例中，步骤(1)和(2)的发酵总时间≤160小时，更佳地≤120小时。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【附图说明】
图1显示了在不控制pH值的情况下，CS103菌株的发酵过程曲线。
图2显示了将pH值控制在6.9时，CS103菌株的发酵过程曲线。
图3显示了分阶段控制pH值时，CS103菌株的发酵过程曲线。
图4显示了分阶段控制pH值，并在发酵初期添加合成前体抗生素情况下，CS103菌株的发酵过程曲线。
图5显示了常规的分离纯化芳香族多烯抗生素的方法。
【具体实施方式】
本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现了一种有效提高芳香族多烯抗生素或其衍生物产量的发酵方法，即通过在发酵过程的不同阶段中控制发酵液不同pH的方法，使得工程菌的生长、代谢和生产处于理想的状态，从而大大提高了芳香族多烯抗生素或其衍生物的发酵产量。
具体而言，在工程菌的生长初始阶段，在pH7.6-8.5的培养条件下，培养工程菌，从而促进抗生素芳香侧链前体——对氨基苯甲酸地合成；当工程菌开始或即将开始合成芳香族多烯抗生素时，迅速将pH调至6.4-7.4并在pH下继续发酵，将对氨基苯甲酸转化为芳香族多烯抗生素，从而极其有效地提高了芳香族多烯抗生素的产量，并减少了副产物。
在本发明的一个优选例中，还包括步骤：在芳香族多烯抗生素合成阶段补加前体物质对氨基苯甲酸。
工程菌
如本发明所用，“发酵”即指培养所述携带表达载体的重组菌株，使其生产芳香族多烯抗生素及其衍生物。更特别的，“发酵”为一种较大规模的生产过程，如发酵规模为2-10000升，更佳地发酵规模为5-5000升，如发酵规模可以是50升、100升、1000升或更高。
可用于本发明的工程菌没有特别限制，可以是本领域用于生产芳香族多烯抗生素的工程菌。这些工程菌可以是筛选获得的，也可以是经过基因工程改造的。通常，这些工程菌在合成芳香族多烯抗生素中需要前体物质对氨基苯甲酸或类似物质。
一类优选的工程菌是可发酵生产芳香族多烯大环内酯抗生素(更佳地七烯大环内酯聚酮抗生素)的工程菌。代表性的工程菌包括(但并不限于)：链霉菌FR-008(申请号为CN200310108746.6的中国专利申请“七烯大环内酯聚酮抗生素FR-008复合物”)、糖基转移酶基因fscMI中断突变菌株CS101(申请号为CN200310108745.1的中国专利申请“脱糖和脱氨糖FR-008衍生聚酮抗生素”)、酮糖转氨酶基因fscMII中断突变菌株CS102(申请号为CN200310108745.1的中国专利申请“脱糖和脱氨糖FR-008衍生聚酮抗生素”)、或细胞色素P450单氧化酶基因fscP中断突变株CS103(见申请号为CN200710037060.0的中国专利申请“脱羧FR-008衍生聚酮抗生素及其应用”)或其衍生菌株。
适用于本发明的工程菌通常为链霉菌，但也可以是其他菌株，例如大肠杆菌、放线菌、真菌等。
芳香族多烯抗生素
可用本发明方法生产的芳香族多烯抗生素没有特别限制，可以是任何在合成过程中需要前体物质对氨基苯甲酸或类似物质作为芳香侧链的芳香族多烯抗生素。优选的芳香族多烯抗生素是芳香族多烯大环内酯抗生素，更佳地是七烯大环内酯聚酮抗生素(参见CN200310108746.6、CN200310108745.1和CN200710037060.0)。
代表性的芳香族多烯抗生素包括(但并不限于)：
1)抗生素FR-008或杀念菌素及其衍生物；
2)糖基转移酶基因fscM I中断突变菌株CS101培养得到的脱糖基的化合物CS101；
3)酮糖转氨酶基因fscMII中断突变菌株CS102培养得到的脱氨糖的化合物CS102；
4)细胞色素P450单氧化酶基因fscP中断突变株CS103培养得到的毒性降低FR-008脱羧衍生聚酮抗生素CS103；
5)抗生素FR-008或杀念菌素；和
6)其他的通过组合生物合成技术得到的FR-008或杀念菌素的基因工程衍生物。
培养基和发酵条件
适用于本发明方法的培养基、以及培养条件(除了pH值和补加对氨基苯甲酸之外)没有特别限制，可以是本领域常规用于所述工程菌的培养基和培养条件。当然，根据不同的发酵规模和需要，本领域技术人员可以根据经验或试验对通气量、搅拌速度等条件进行调整。
与现有的发酵条件相比，本发明的主要区别在于分阶段控制pH，从而促进抗生索芳香侧链前体和抗生素本身的合成。
为了确定调控pH的时间，可以在发酵过程中，定期测定发酵液中所述芳香族多烯抗生素的浓度，从而判断所述工程菌是否开始生产芳香族多烯抗生素。一旦工程菌开始或即将开始生产芳香族多烯抗生素，则可调节pH至6.4-7.4。
当然，在发酵条件和接种量等因素确定的情况下，一旦通过测定确定了工程菌开始生产芳香族多烯抗生素的时间，则可以不必测定发酵液中所述芳香族多烯抗生素的浓度。
在本发明中，步骤(1)所对应的发酵初始阶段通常为12-60小时，较佳地为18-48小时，更佳地为20-36小时。
在发酵培养结束后，可从常规方法从发酵液中分离或纯化所述的芳香族多烯抗生素及其衍生物。从培养产物中分离或纯化芳香族多烯抗生素及其衍生物可采用本领域技术人员熟知的各种分离纯化技术，其中包括(但并不限于)：溶媒萃取加沉淀法。一种常规的初步分离纯化过程如图5所示。
本发明的主要优点在于：
(1)根据芳香类多烯聚酮抗生素结构和合成的特点，通过分阶段控制pH调节抗生素芳香侧链前体和抗生素本身的合成，在合成初期提高pH来促进抗生素芳香侧链前体——对氨基苯甲酸的合成，进而提高抗生素发酵水平。
与以前的发酵工艺相比，本发明方法可使芳香族多烯抗生素产量大幅提高约200％，单位菌体抗生素产量明显提高，单位体积发酵液的产率提高约280％，
(2)减少了副产物，利于下游的分离纯化工作。
(3)发酵过程易于控制，便于大规模生产，因而具有极好的产业应用价值。
(4)发酵周期明显缩短，生产成本大幅降低。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
实施例1
为了确定调控pH的时间，可以在发酵过程中，定期(如每5分钟或每10分钟)或实时测定发酵液中所述芳香族多烯抗生素的浓度，从而判断所述工程菌是否开始生产芳香族多烯抗生素。一旦工程菌开始或即将开始生产芳香族多烯抗生素，则可调节pH至6.4-7.4。
以FR-008脱羧衍生聚酮抗生素CS103为例，发酵初期通过以下方法检测：高效液相色谱仪(Agenlent 1100)，色谱柱为SB-C8(4.6mm*250mm)，流动相为20mM、pH4.6醋酸铵缓冲液-乙腈(60∶40)，流速为1mL/min，柱温为25℃，检测波长380nm，上述色谱条件下得到回归方程：y＝5.5015x+87.599(R2＝0.9987)。当CS103发酵水平达到10-30mg/L，最佳20mg/L的时候，即发酵24小时，可调节pH至6.4-7.4。
实施例1(对比例)
FR-008脱羧衍生聚酮抗生素CS103的发酵
将300μl细胞色素P450单氧化酶基因fscP中断突变株CS103(申请号为CN200710037060.0的中国专利申请“脱羧FR-008衍生聚酮抗生素及其应用”)孢子悬液接种至含有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，接种后置于28℃下，200rpm/min摇床上培养30h左右，按接种量10％接到3.7L发酵罐；450rpm、200L/h通气量，28℃培养。(发酵方法同申请号为CN200710037060.0的中国专利申请“脱羧FR-008衍生聚酮抗生素及其应用”)
整个发酵过程不控制pH值，培养基初始pH6.9，在0-12h，pH逐渐升高到7.5。结果如图1所示，菌体为了适应发酵初期抗生素合成前体PABA的合成而自身调节pH升高；12h以后pH逐渐下降，此时抗生素开始合成，直到96h略微有些回升，菌体开始自溶，菌体最高量达到6.5g/L；此时，放瓶检测FR-008脱羧衍生聚酮抗生素CS103的发酵水平达到最高值46μg/mL左右，不再继续合成。
实施例2
FR-008脱羧衍生聚酮抗生素CS103的发酵
同实施例1，不同点在于：接种后用盐酸和氢氧化钠维持pH6.9，培养120至发酵结束。
结果如图2所示。当发酵过程维持pH6.9时，由于发酵过程pH比较稳定，菌体生长能力也得到提高，最终细胞干重达到9.4g/L。基质消耗速率加快，葡萄糖在48-72h耗到10g/L，120h几乎耗尽，而实施例1中不控制pH的分批发酵，直到120h才耗到10g/L左右。氨基氮的消耗也明显加快。可见菌体代谢速率加快，这从溶氧和RQ值也可以明显反应出来。溶氧最低值由原来的50％降至30％左右，RQ最大值由原来的0.12提高到0.18。放瓶检测FR-008脱羧衍生聚酮抗生素CS103的发酵水平在120h达到最高值，为88.2μg/mL左右，较实施例1提高了90％。
实施例3
FR-008脱羧衍生聚酮抗生素CS103的发酵
同实施例1，不同点在于：接种后用盐酸和氢氧化钠维持pH8.0。24h后，迅速将pH调至6.9，并维持至发酵结束。
结果如图3所示。采取分阶段控制pH策略以后，培养120h，放瓶检测FR-008脱羧衍生聚酮抗生素CS103的发酵水平进一步提高到111μg/mL，较实施例1中不控制pH分批发酵提高141％，较实施例2中控制pH6.9分批发酵也提高了26％。
此外，最高菌体干重DCWMax为9.5g/L，与控制pH6.9分批发酵没有明显变化。这说明抗生素产量的提高不是因为细胞量增加影响的。
实施例4
FR-008脱羧衍生聚酮抗生素CS103的发酵
同实施例1中，不同点在于：(a)接种后用盐酸和氢氧化钠维持pH8.0。24h后，迅速将pH调至6.9，并维持至发酵结束；(b)将0.02g/L的对氨基苯甲酸分别在0h，12h，24h和48h四次添加到发酵罐。
结果如图4所示。添加前体以后，CS103产量进一步提高到近140μg/mL，较实施例3提高26％。
此外，最高菌体干重DCWMax为9.4g/L，与前面几批分批发酵没有明显差异。这说明，实施例3中“分阶段控制pH策略”虽然通过提高对氨基苯甲酸合成酶的活性，促进了分枝酸转化为对氨基苯甲酸，使前体量增加，但并没有达到最佳前体量；而由于菌体生长环境的限制，无法进一步提高发酵初期的pH；因此在此基础上通过一次或多次(优选分批多次)添加对氨基苯甲酸来可进一步促进CS103的积累，达到了较好的效果。而且添加外源前体后，CS103的生物合成开始的时间提前到6h。由于，合成时间提前，菌体代谢更加旺盛，溶氧进一步降低，而RQ最高值达到0.56。此时，葡萄糖和氨基氮的消耗加快，特别是葡萄糖在96h耗尽。
表1.四组实施例对比实验结果
实施例5
FR-008脱糖衍生聚酮抗生素CS101的发酵
将300μl糖基转移酶基因fscM I中断突变菌株CS101(申请号为CN200310108745.1的中国专利申请“脱糖和脱氨糖FR-008衍生聚酮抗生素”)孢子悬液接种至含有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，接种后置于28℃下，200rpm/min摇床上培养30h左右，按接种量10％接到3.7L发酵罐；450rpm、200L/h通气量，28℃培养。(发酵方法同申请号为CN200710037060.0的中国专利申请“脱羧FR-008衍生聚酮抗生素及其应用”)
整个发酵过程不控制pH值，培养基初始pH6.7，培养至96h放瓶检测FR-008脱糖衍生聚酮抗生素CS101的发酵水平达到最高值79.3μg/mL左右，不再继续合成。
实施例6
FR-008脱糖衍生聚酮抗生素CS101的发酵
同实施例5中，不同点在于：(a)接种后用盐酸和氢氧化钠维持pH7.7。24h后，迅速将pH调至6.6，并维持至发酵结束；(b)将0.02g/L的对氨基苯甲酸分别在0h，12h，24h和48h四次添加到发酵罐。培养至96h，CS101产量进一步提高到近236.8μg/mL。
实施例7
抗生素FR-008的发酵
将300μl链霉菌FR-008(申请号为CN200310108746.6的中国专利申请“七烯大环内酯聚酮抗生素FR-008复合物”)孢子悬液接种至含有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，接种后置于28℃下，200rpm/min摇床上培养30h左右，按接种量10％接到3.7L发酵罐；450rpm、200L/h通气量，28℃培养。(发酵方法同申请号为CN200710037060.0的中国专利申请“脱羧FR-008衍生聚酮抗生素及其应用”)
整个发酵过程不控制pH值，培养基初始pH6.9，培养至96h放瓶检测抗生素FR-008的发酵水平达到最高值150.9μg/mL左右，不再继续合成。
实施例8
抗生素FR-008的发酵
同实施例7中，不同点在于：(a)接种后用盐酸和氢氧化钠维持pH8.4。24h后，迅速将pH调至7.2，并维持至发酵结束；(b)将0.02g/L的对氨基苯甲酸分别在0h，12h，24h和48h四次添加到发酵罐。培养至96h，抗生素FR-008产量进一步提高到近421.3μg/mL。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。