人源乙肝病毒表面抗体的制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种抗体制备方法，具体的说，涉及一种针对乙肝病毒的表面抗体的制备方法。
背景技术
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的一种世界性疾病。发展中国家发病率高，据统计，全世界无症状乙肝病毒携带者(HBsAg携带者)超过2.8亿，我国约占9300万。多数无症状，其中1/3出现肝损害的临床表现。目前我国有乙肝患者3000万。乙肝的特点为起病较缓，以亚临床型及慢性型较常见。
正因为乙型肝炎的广泛性和危害性，人们长期以来一直在研究乙肝的诊断、预防和治疗。目前乙肝两对半是国内医院最常用的乙肝病毒(HBV)感染检测血清标志物。乙型肝炎病毒免疫学标记一共3对，即表面抗原(HBsAg)和表面抗体(抗HBs或HBsAb)、e抗原(HBeAg)和e抗体(抗HBe或HBeAb)、核心抗原(HBcAg)和核心抗体(抗HBc或HBcAb)。
两对半检查是用来判断是否感染乙肝或粗略估计病毒复制水平的初步检查，两对半对于乙肝诊断的有很大评估参考性。
乙肝两对半包括：
1、HBsAg(表面抗原)，为已经感染病毒的标志，并不反映病毒有无复制、复制程度、传染性强弱；
2、HBsAb(表面抗体)，为中和性抗体标志，是是否康复或是否有抵抗力的主要标志。乙肝疫苗接种者，若仅此项阳性，应视为乙肝疫苗接种后正常现象；
3、HBeAg(e抗原)，为病毒复制标志。持续阳性3个月以上则有慢性化倾向；
4、HBeAb(e抗体)，为病毒复制停止标志。病毒复制减少，传染性较弱，但并非完全没有传染性；
5、HBcAb(核心抗体)，为曾感染过或正在感染者都会出现的标志。核心抗体IgM是新近感染或病毒复制标志，核心抗体IgG是感染后就会产生的，对于辅助两对半检查有一定意义。
血清中HBsAg阳性是HBV感染的标志。HBsAg本身具有抗原性，无传染性，但由于HBsAg常与HBV同时存在，故认为是传染性标志之一。HBsAb是两对半的检测指标，同时也是用来检测HBsAg的底物，故对于乙肝病毒检测有十分重要的意义；另外HBsAb在制备乙肝疫苗上也有很大帮助。因此人们一直在研究制备HBsAb。
早期的多克隆抗体制备法是直接用抗原(具有多个抗原决定簇)免疫动物获得血清抗体。这种抗体虽然制备比较方便，但是往往特异性差，浓度低，针对多个抗原决定簇，易出现交叉反应，所以使用范围有限。到了70年代人们发展出了单克隆抗体制备法，利用小鼠进行B细胞杂交瘤技术，特异性地制备针对单一抗原决定簇的抗体。虽然这种方法较多克隆抗体技术有了很大的进步，但是这种方法有三个缺陷：1、只能制备鼠源的抗体，在人体使用会引起人抗小鼠抗体反应。2、对于特异性抗原决定簇较少的疾病，就比较难制备单克隆抗体，容易出现交叉反应。3、这种技术操作繁琐。
随着基因工程技术的发展，制备特异性更高、结合能力更强、纯度更高的抗体成为可能。人们对Ig基因结构与功能深入剖析，结合DNA重组技术，对免疫蛋白(Ig)分子进行切割、拼接或修饰，甚至是人工全合后导入受体细胞表达，产生新型抗体，这种抗体制备方法称为第三代抗体制备法。本发明正是在第三代抗体制备法的基础上，采用了多种基因工程技术，提供一种新型的制备人源乙肝病毒表面抗体的方法。
【发明内容】
本发明提供一种人源乙肝病毒表面抗体的新制备方法，以克服传统多克隆抗体制备技术制备的乙肝病毒表面抗体不纯；而用单克隆抗体技术制备的抗体由于其鼠源特性在人体会产生较大排斥，同时又很难全面反映体内免疫反应情况的复杂性，导致制备的抗体针对性不强的缺点；提供一种采用基因工程技术，制备出高特异性、高纯度、高结合性的人源乙肝病毒表面抗体的方法。
本发明提供的方法步骤如下：
(1)使用乙肝患者外周血，分离淋巴细胞，提取它们的总RNA为模版；
(2)用建立噬菌体文库所设计的引物，扩增抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因；所述的轻链可变区基因包括κ链基因和λ链基因；
(3)用得到的扩增产物构建重链可变区基因和轻链可变区基因的噬菌体载体，经转化培养获得噬菌体文库；
(4)用乙肝病毒表面抗原包被的酶标板筛选表达特异性乙肝表面抗体的噬菌体；
(5)以双酶切剔出筛选所得的噬菌体载体上的gIII基因(一个决定噬菌体是否进入裂解途径的关键基因)，从而得到可溶性的表达载体；
(6)转化大肠杆菌后诱导表达，获取高特异性的抗体。
所述的建立噬菌体文库所需的引物序列如下：
扩增乙肝病毒表面抗体重链可变区基因的引物序列如下：
上游引物：
VH135 5-AG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3，
VH2 5-CAG(A/G)TC ACC TTG CTC GAG TGT GG-3，
VH4 5-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3，
VH4b 5-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG-3，
VH6 5-CAG GTA CAG CTG CTC GAG TCA GG-3，
下游引物：
CGId 5-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GG-3；
扩增乙肝病毒表面抗体轻链可变区基因的引物序列如下：
扩增κ链基因上游引物：
Vκ1 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC CAG ATG ACC CAG TCT CC-3，
Vκ3 5-GAG CCG CACGAG CCC GAG CTC GTG(A/T)TG AC(A/G)CAG TCT CC-3，
Vκ2/4 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG ATG AC(C/T)CAG TCT CC-3，
Vκ5 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC ACA CTC ACG CAG TCT CC-3，
扩增κ链基因下游引物：
CκId 5-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGACGG GCG AAC TCA G-3；
扩增λ链基因上游引物：
Vλ1a 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG TTG ACG CAG CCG CCC TC-3，
Vλ1b 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG CTG ACT CAG CCA CCC TC-3，
Vλ2 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GCC CTG ACT CAG CCT(C/G)CCTCC GT-3，
Vλ3/9 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC G(A/T)G CTG ACT CAG CCACC(C/T)TC-3，
Vλ7/8 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG CTGAC(T/C)CAG GAGCC(C/A)TC-3，
扩增λ链基因下游引物：
Cλ2d 5-G CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3。
本方法提供的一个优选例为所述的噬菌体载体为pComb3H载体。
本发明通过直接从乙肝病毒患者的外周血中取得乙肝表面抗体基因，然后制备抗体可变区基因的噬菌体文库，再通过噬菌体特异性富集和扩增与原核表达，获得有功能的人源抗体。这种制备方法能够得到高特异性、高浓度的人源抗体；而且由于直接从患者身上获得基因，省去了人工免疫动物的步骤，避免了动物抗体的缺点。噬菌体文库能够很全面地展示体内免疫反应的结果，也可以多次使用，操作也相对于单克隆抗体简单。
具体实施例：
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1：乙肝病毒表面抗体文库建立
(1)淋巴细胞提取
取乙型肝炎患者地外周血，加于5mL淋巴细胞的分离液上，室温，3000g离心10min，吸取淋巴细胞层，PBS洗涤2次。
(2)抽提淋巴细胞总RNA
1、取分离所得的淋巴细胞，加入1ml Trizol，室温充分匀浆，静置5分钟。
2、加入0.2ml氯仿，振荡15秒，静置2分钟。
3、4℃，12000g×15分钟，取上清。
4、加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟。
5、4℃，12000g×10分钟，弃上清。
6、加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5分钟，弃上清。
7、晾干，加入适量的DEPC水溶解(65℃促溶15min)。
8、定量：在紫外分光光度计上测定OD260和OD280。
(3)扩增抗体重链可变区基因和轻链可变区基因
这一部的RT-PCR分为两步进行，
第一步：逆转录反应
1、RNA 11.5μl加上Oligo(dT)150.05μg/μl 2μl混匀，离心，70℃水浴5min，立即冰水浴，稍离心。
2、按照20ul体积配方(试剂，用量：M-MLV Buffer 5×，4μl；dNTP 10mM，1μl；RNasin40U/μl，0.5μl；M-MLV 200U/μl，1μl；前一步的混合液)混匀，离心，42℃水浴60min，再95℃水浴10min(破坏MLV)，4℃保存。
第二步：PCR反应
1、按照20μl体系(试剂，用量：TaqBuffer 10×，2μl；MgCl2 25mM，1.2μl；dNTP 10mM，0.2μl；上游引物10pmol/μl，0.3μl；下游引物10pmol/μl，0.3μl；cDNA模板，5μl；DEPC水，10.7μl；Taq酶2.5U/μl，0.3μl)，混匀，97℃水浴5分钟，然后在立即冰水浴。
2、95℃5分预变性；
94℃30秒变性；
60℃40秒退火；
72℃30秒延伸；
72℃7分终末延伸；
35个循环，4℃保温。一共需要14个体系对应的引物对为：
a、VH135 5-AG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GG-3；
CGId 5-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GG-3；
b、VH2 5-CAG RTC ACC TTG CTC GAG TGT GG-3；
CGId 5-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GG-3；
c、VH4 5-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3；
CGId 5-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GG-3；
d、VH4b 5-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG-3；
CGId 5-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GG-3；
e、VH6 5-CAG GTA CAG CTG CTC GAG TCA GG-3；
CGId 5-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GG-3；
f、Vκ1 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC CAG ATG ACC CAG TCT CC-3；
CκId 5-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGACGG GCG AAC TCA G-3；
g、Vκ3 5-GAG CCG CACGAG CCC GAG CTC GTG WTG ACR CAG TCT CC-3；
CκId 5-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGACGG GCG AAC TCAG-3；
h、Vκ2/4 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG ATG ACY CAG TCT CC-3；
CκId 5-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGACGG GCG AAC TCAG-3；
i、Vκ5 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC ACA CTC ACG CAG TCT CC-3；
CκId 5-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGACGG GCG AAC TCAG-3；
j、Vλ1a 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG TTG ACG CAG CCG CCC TC-3；
Cλ2d 5-G CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3
k、Vλ1b 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG CTG ACT CAG CCA CCC TC-3；
Cλ2d 5-G CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3
1、Vλ2 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GCC CTG ACT CAG CCT SCCTCC GT-3；
Cλ2d 5-G CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3
m、Vλ3/9 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GWG CTGACT CAG CCACCYTC-3；
Cλ2d 5-G CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3
n、Vλ7/8 5-GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG CTG ACY CAG GAGCCM TC-3；
Cλ2d 5-G CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3
第三步：产物回收纯化
加1-10μl PCR产物+溴酚蓝(1-2.5μl)混匀，加样，电泳。割胶回收，纯化。
(4)构建噬菌体载体
1、纯化过的轻链κ链基因和λ链基因PCR产物和pComb3H载体，分别用Sac I/XbaI双酶切后纯化回收，回收产物用T4DNA连接酶进行连接，电穿孔转化XL1-Blue菌株，并扩增培养转化的细菌，从中提取的质粒即为轻链基因文库。
2、以Xho I/Spe I双酶切重链可变区基因的PCR纯化产物，与经过同样双酶切的轻链基因文库相连接，电转化XL1-Blue菌株，迅速加入1mL SOC培养基，于37℃振荡培养1h，加入10mL SB培养基(含20mg/L Amp和10mg/LTet)，于37℃振荡培养1h后补加Amp至50mg/L，继续摇菌1h。加入100mL SB(含50mg/L Amp及10mg/L Tet)培养基和1012pfu的辅助噬菌体VCSM13，于37℃振荡培养2h后加Kana至70mg/L，37℃振荡培养过夜。次日在离心后的上清中加入40g/L PEG8000和30g/L NaCl沉淀噬菌体，将沉淀悬浮于2mL 10g/LBSA-TBS中，离心收集上清即为Fab噬菌体抗体库。
实施例2、噬菌体特异性筛选
(1)用10mg/l的人源乙肝病毒表面抗原和0.05mol/l的碳酸氢钠缓冲液，制备人源特异性乙肝病毒表面抗原包被的6孔酶标板，并且用小牛血清蛋白4℃封闭过夜。
(2)加1ml/孔Fab噬菌体抗体文库，37℃孵育2小时，用PBST(1g/l Tween-20)洗一次。(第一轮洗1次，第二轮洗5次，第三、四、五轮洗10次)。
(3)每孔加入1mL 0.1mol/L HCl(用甘氨酸调pH值至2.2，含1g/L BSA)以洗脱噬菌体，室温静置10min，稍吹打后加入2mol/LTris中和。
(4)用孔中的洗脱液感染2ml新制备的大肠杆菌XL1-blue，37℃摇动培养2小时，加入1012pfu辅助噬菌体VCSM13，继续摇动培养1小时，加卡那霉素至终浓度70mg/l，30℃摇动培养过夜。离心，收集上清。
(5)从2-4步为一轮，一共进行5轮，得到高浓度的特异性噬菌体和乙肝表面抗体融合蛋白。每轮结束都需要做滴度测定，计算产率。
实施例3：可溶性的乙肝表面抗体制备
(1)将筛选出来的特异性噬菌体扩增，提取重组噬菌体载体，用Spe I和Nhe I双酶切切去噬菌体gIII基因(一个决定噬菌体是否进入裂解途径的关键基因)，经过琼脂糖电泳回收大片段，用连接酶使其自身环化，得到可溶性Fab段表达载体，转化大肠杆菌XL1-blue，并在氨苄青霉素培养基上培养过夜。
(2)挑取培养基上的单个菌落，接种于10SB液体培养基(含50mg/l Amp，10mg/l Tet，20mmol/lMgCl2)，37℃摇动培养6个小时，加入IPTG诱导(终浓度1mmol/l)，30℃振荡培养过夜。
(3)4000rpm，4℃离心15min，回收细菌沉淀(同时也保存上清，4℃)。1ml PBS重悬细胞沉淀，于-70℃冻结，而后在37℃水浴，冻融重复4次，12000rpm 4℃离心15min收集上清。
【序列表】
<110>上海裕隆临床检验中心有限公司
<120>人源乙肝病毒表面抗体的制备方法
<160>17
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增重链可变区基因的上游引物，命名为上游引物VH135。
<400>1
aggtgcagct gctcgagtct gg 22
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>r＝a或g。根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增重链可变区基因的上游引物，命名为上游引物VH2。
<400>2
cagrtcacct tgctcgagtg tgg 23
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增重链可变区基因的上游引物，命名为上游引物VH4。
<400>3
caggtgcagc tgctcgagtc ggg 23
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增重链可变区基因的上游引物，命名为上游引物VH4b。
<400>4
caggtgcagc tactcgagtg ggg 23
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增重链可变区基因的上游引物，命名为上游引物VH6。
<400>5
caggtacagc tgctcgagtc agg 23
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增重链可变区基因的下游引物，命名为下游引物CGId。
<400>6
gcatgtacta gttttgtcac aagatttgg 29
<210>7
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增轻链可变区κ链基因的上游引物，命名为上游引物Vκ1。
<400>7
gagccgcacg agcccgagct ccagatgacc cagtctcc 38
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>w＝a或t，r＝a或g；根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增轻链可变区κ链基因的上游引物，命名为上游引物Vκ3。
<400>8
gagccgcacg agcccgagct cgtgwtgacr cagtctcc 38
<210>9
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>y＝t或c；根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增轻链可变区κ链基因的上游引物，命名为上游引物Vκ2/4。
<400>9
gagccgcacg agcccgagct cgtgatgacy cagtctcc 38
<210>10
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>y＝t或c；根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增轻链可变区κ链基因的上游引物，命名为上游引物Vκ5。
<400>10
gagccgcacg agcccgagct cacactcacg cagtctcc 38
<210>11
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增轻链可变区κ链基因的下游引物，命名为下游引物CκId。
<400>11
gcgccgtcta gaattaacac tctcccctgt tgaagctctt tgtgacgggc gaactcag 58
<210>12
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增轻链可变区λ链基因的上游引物，命名为上游引物Vλ1a。
<400>12
gagccgcacg agcccgagct cgtgttgacg cagccgccct c 41
<210>13
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增轻链可变区λ链基因的上游引物，命名为上游引物Vλ1b。
<400>13
gagccgcacg agcccgagct cgtgctgact cagccaccct c 41
<210>14
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>s＝g或c；根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增轻链可变区λ链基因的上游引物，命名为上游引物Vλ2。
<400>14
gagccgcacg agcccgagct cgccctgact cagcctscct ccgt 44
<210>15
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>w＝a或t，y＝t或c；根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增轻链可变区λ链基因的上游引物，命名为上游引物Vλ3/9。
<400>15
gagccgcacg agcccgagct cgwgctgact cagccaccyt c 41
<210>16
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>m＝a或c，y＝t或c；根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增轻链可变区λ链基因的上游引物，命名为上游引物Vλ7/8。
<400>16
gagccgcacg agcccgagct cgtgctgacy caggagccmt c 41
<210>17
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>m＝a或c，y＝t或c；根据核酸碱基配对原理和扩增条件设计，以用作人源乙肝病毒表面抗体的制备方法中扩增轻链可变区λ链基因的下游引物，命名为下游引物Cλ2d。
<400>17
gcgccgtcta gaattatgaa cattctgtag g 31