小麦条锈菌与叶锈菌的复合PCR检测鉴定试剂盒 【技术领域】
本发明属于生物技术、农作物病害防治和植物检疫领域，具体涉及一种小麦条锈菌与叶锈菌的复合PCR检测鉴定试剂盒。
背景技术
小麦锈病属世界性禾谷类病害，发生范围广，流行成灾率高，危害严重，是影响小麦安全生产的重要生物灾害，大流行年份可导致小麦减产30％左右，特大流行年份则可减产50％～60％，甚至绝收。作为我国第二大粮食作物，小麦生产直接关系到我国的粮食安全问题。但在我国不同小麦种植区内，锈菌菌源大规模交流扩散、锈病流行循环往复。
小麦条锈病和叶锈病在症状上的共同特点是发病初期麦叶上出现褪绿斑点，继而在发病部位产生铁锈色的粉疱(夏孢子堆)，后期再产生黑色疱斑(冬孢子堆)。小麦锈菌寄生专化性强，无法人工培养，且尚未发现有性世代，长期以来，病菌常规的小种鉴定及监测均基于鉴别寄主来进行，锈病发生种类与状况的预测预报也主要基于定期、大规模的田间病情调查和室内病原菌的活体分离、培养和鉴定。不仅耗时费工，而且其结果的准确性和可信度也在很大程度上取决于调查测报人员的经验技术，难以满足快速、高通量诊断检测的实际需求。通常，小麦锈菌成功侵染寄主小麦后，一般具有9-14天甚至更长时间的潜育扩展阶段。在此期间，寄主小麦的发病症状不易观察，因此初侵染的时期和规模难以界定；在苗期小麦上，条锈病和叶锈病的典型症状不明显，一些基层植保人员常常将二者混淆，不能准确区分，因此难以开展及时有效的化学防治工作。而锈病症状一旦显现、病原菌即可在小麦叶片上大量繁殖产生夏孢子。这些病原菌孢子可随气流进行大范围的传播扩散，导致病害的流行爆发。
开展锈菌不同种的早期诊断与监测，可以解决常规病原菌检测鉴定方法繁杂、费工费时的实践难题。同时，在病害侵染循环的早期阶段，界定发病的初始时期与规模，有助于提高病害中长期测报水平，正确评判病害的流行趋势；也有助于制定合理的防治阈值，科学决策防治时机，并确定杀菌剂的使用剂量与时期，在最大限度降低病害防治成本的基础上，规避病害流行风险。
在病害预测预报和病原菌鉴定检疫方面，国际上多采用血清学检测(如ELISA和免疫荧光)和DNA杂交、PCR分析等技术。其中，PCR技术是利用特异引物，在DNA聚合酶的催化下，对靶标DNA序列进行体外扩增，根据预期DNA条带的有无来判断检测结果。与传统的病原菌检测分析技术相比，PCR试剂盒分析技术具有灵敏度高，特异性强、使用简单、操作迅捷等特点。
目前国内外尚无小麦条锈菌和叶锈菌检测区分的PCR专用试剂盒。
【发明内容】
本发明目的是提供用于检测区分小麦锈菌不同种的PCR试剂盒。该试剂盒利用源自真菌β-微管蛋白基因保守序列和小麦条锈菌、叶锈菌特异序列的三条引物，在同一PCR反应体系中同时检测小麦条锈菌和叶锈菌。
本发明的技术方案如下：
本发明为小麦条锈菌与叶锈菌的复合PCR检测鉴定试剂盒，该试剂盒由以下几种试剂组成：
(1)PCR-SMART反应液：
其中含有10×PCR Buffer，dNTP Mixture以及小麦锈菌不同种的PCR检测专用引物Primer A、Primer B和Primer C。
Primer A序列(5’-ACCCACAACCGCCAACATGCGTGA-3’)源自小麦秆枯菌(Septoria nodorum)的β-微管蛋白基因的保守序列(EMBLS56922)；PrimerB序列(5’-CTCATCAGGTAGCCCATCGT-3’)源自小麦叶锈菌的SCAR标记(GenBank accession EU084038)；Primer C序列(5’-TTAAGACTACCGGTGTGAAC-3’)源自小麦条锈菌的SCAR标记(GenBank accession EF666109)。
Primer A/B可以专化性扩增出小麦叶锈菌226bp的特异性条带，而PrimerA/C可以专化性扩增出小麦条锈菌171bp的特异性条带。
(2)Taq酶；
(3)条锈菌阳性对照；
(4)叶锈菌阳性对照；
(5)分子量标记；
(6)超纯水；
(7)凝胶上样缓冲液。
试剂盒具体组成可以为(100次)
(1)PCR-SMART反应液1.0ml 1支
内含10×PCR Buffer(tris-cl 100mmol/L，Kcl 500mmol/L，Mgcl2 25mmol/L)0.33ml，dNTP Mixture(10mmol/L)0.27ml，Primer A(10μmol/L)0.20ml，Primer B(10μmol/L)0.10ml，Primer C(10μmol/L)0.10ml。
(2)Taq酶 5U/μl 50μl 1支
(3)条锈菌阳性对照 1ml 1支
(4)叶锈菌阳性对照 1ml 1支
(5)分子量标记 1ml 1支
(6)ddH2O 5ml 1支
(7)6×凝胶上样缓冲液1ml 1支试剂盒的储存及有效期：储存于-20℃；避免反复冻融；有效期为12个月。
适用仪器：PCR检测仪。
本发明试剂盒的使用方法如下：
①PCR反应体系的建立
取出PCR-SMART反应液，室温融化、颠倒混匀后，向每个PCR薄壁反应管内加入7.5μl；再分别加入0.5μl Taq酶、16μl ddH2O、1μl被测样品的DNA模板(20ng/μl)，盖好PCR薄壁反应管盖。
②PCR扩增
将PCR薄壁反应管置于PCR仪中，设定PCR反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸40S，35个循环；72℃延伸5min 1个循环。
③PCR产物鉴定
取3～5μl PCR扩增产物，用质量分数2.0的琼脂糖凝胶、0.5×T BE电泳缓冲液电泳分离；同时上样5μl/孔的分子量标记与条锈菌、叶锈菌的阳性对照；电泳结束、经溴化乙锭染色后，以紫外凝胶成像系统分析判断扩增产物的有无与大小。
有益效果：本发明是用于检测小麦锈菌不同种的复合PCR试剂盒，可用于检测和区分小麦条锈菌与叶锈菌的夏孢子，也可用于检测和确定无明显发病症状的小麦材料是否被不同种的小麦锈菌所侵染。与国内外现有方法相比，本发明具有以下的技术优势：
(1)检测准确性高。本试剂盒可专化性扩增小麦条锈菌(GenBank accessionEF666109)和叶锈菌(GenBank accession EU084038)不同SCAR标记的相应序列。
(2)操作简便快捷。本发明采用复合PCR技术，三条引物在同一反应体系中同时扩增，扩增模板可以为源于锈菌孢子或感病小麦叶片的总DNA。实验操作简单、快速、高效，一般整个检测过程可在4个小时内完成。
(3)特异性强。本试剂盒可特异性检测小麦条锈菌和叶锈菌，而在其它麦类病原真菌中无扩增产物。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作详细说明，但并不以任何方式限制本发明。
实施例1感病小麦叶片与锈菌夏孢子的复合PCR检测及其特异性分析。
①在人工气候室内分别以小麦叶锈菌07-24-17、条锈菌S23单独或混合接种铭贤169小麦幼苗，7天后采集病叶提取基因组DNA；培养并采集小麦叶锈菌(07-24-17、07-18-7、07-24-3)、条锈菌(S23、07-6-3-11)、秆锈菌地夏孢子，以及赤霉、白粉、纹枯、叶枯、根腐、光腥、矮腥病菌的菌丝体，提取基因组DNA，并制备为20ng/μl的扩增反应模板。
②建立PCR反应体系
取出PCR-SMART反应液，室温融化、混合均匀，分别向每个PCR薄壁反应管内加入7.5μl；再依次加入0.5μl Taq酶、16μl ddH2O、1μl模板DNA(20ng/μl)，盖好PCR薄壁反应管盖。
③PCR扩增
将PCR薄壁反应管置于PCR仪中，设定PCR反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸40S，35个循环；72℃延伸5min 1个循环。
④PCR产物的电泳分析
取5μl PCR扩增产物，用质量分数2.0的琼脂糖凝胶、0.5×T BE电泳缓冲液电泳分离；同时上样5μl/孔的分子量标记；电泳结束、经溴化乙锭染色后，以紫外凝胶成像系统照相分析。结果表明本发明试剂盒可以从小麦叶锈菌、条锈菌的夏孢子以及小麦叶锈菌、条锈菌单独或双重侵染的小麦叶片中检测到相应的DNA分子标记，而在其它小麦病原真菌中则没有扩增产物。
实施例2小麦锈菌复合PCR检测灵敏度的测定
①分别梯度稀释叶锈菌07-24-3、条锈菌S23的夏孢子DNA，至其终浓度为1.00pg/uL、5.00pg/uL、50.00pg/uL、1.00ng/uL、20.00ng/uL和50.00ng/uL；等量混合叶锈菌07-24-3和条锈菌S23的夏孢子DNA，并梯度稀释至终浓度为5.00pg/uL、50.00pg/uL、1.00ng/uL、10.00ng/uL、20.00ng/uL和50.00ng/uL。
②建立PCR反应体系
取出PCR-SMART反应液，室温融化、混合均匀，分别向每个PCR薄壁反应管内加入7.5μl；再依次加入0.5μl Taq酶、16μl ddH2O、1μl模板DNA，盖好PCR薄壁反应管盖。
③PCR扩增
将PCR薄壁反应管置于PCR仪中，设定PCR反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸40S，35个循环；72℃延伸5min 1个循环。
④PCR产物的电泳分析
取5μl PCR扩增产物，用质量分数2.0的琼脂糖凝胶、0.5×T BE电泳缓冲液电泳分离；同时上样5μl/孔的分子量标记；电泳结束、经溴化乙锭染色后，以紫外凝胶成像系统照相分析。结果表明本试剂盒的检测灵敏度可以达到50.00pg/uL。