表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌及其构建方法与应用.pdf

本发明公开了一种表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌及其构建方法与应用。该构建表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌的方法，是将抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因导入酵母中获得重组菌；所述抗体类似物为抗体的Fc片段与蛋白或蛋白亚基形成的融合蛋白；所述抗体的编码基因为抗体的重链编码基因和轻链编码基因，所述抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因的5′末端连接有编码信号肽核苷酸序列；所述信号肽为血清白蛋白信号肽。本发明利用所述表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌制备抗体及抗体类似物，既可以解决生产抗体比较困难、要求产品纯度高、数量大等瓶颈，又可以发挥抗体Fc段提供的功能，因而具有良好的应用前景。

1.  构建表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌的方法，是将抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因导入酵母中获得重组菌；所述抗体类似物为抗体的Fc片段与蛋白或蛋白亚基形成的融合蛋白；所述抗体的编码基因为抗体的重链编码基因和轻链编码基因，所述抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因的5′末端连接有编码信号肽核苷酸序列；所述信号肽为血清白蛋白信号肽。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血清白蛋白信号肽为哺乳动物血清白蛋白信号肽。

3.  根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述血清白蛋白信号肽为如下的1)或2)：
1)其氨基酸序列为序列表中的序列1；
2)与序列表中序列1的同源性大于50％的多肽。

4.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述血清白蛋白信号肽为序列表中的序列5或6或7。

5.  根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述抗体的Fc片段选自如下任一抗体：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE。

6.  根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述酵母菌为毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母。

7.  由权利要求1至6中任一所述的方法构建的重组酵母菌。

8.  一种制备抗体或抗体类似物的方法，是培养权利要求7所述的重组酵母菌生产完全抗体或抗体类似物。

9.  由权利要求8所述方法生产的抗体或抗体类似物。

表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌及其构建方法与应用。
背景技术
基因工程抗体和抗体类似物药物是近年来发展最快的药物之一。这类药物往往人用剂量较大，一剂达数十至数百毫克，一名病人一个疗程常需要克级量的抗体药物，因此其市场需求量巨大。抗体药物是一类结构复杂的蛋白，它的单体是对称性的分子，一个重链和一个轻链以一个分子间二硫键和非共价键结合在一起，两个重链又靠非共价键及一个或多个二硫键连接在一起形成抗体单体。有些抗体分子由一个单体组成，如IgG，有些抗体可以由多个单体连接起来形成多聚体，如IgM可为五聚体，IgA可为二聚体。因此用基因工程方法表达抗体时，需要同时表达抗体的轻链和重链两条肽链，轻重链在细胞内组装成完整的抗体分子，再分泌到胞外。抗体类似物，是由抗体重链的Fc部分与其它蛋白融合获得的，它们也能通过Fc部分的分子间二硫键形成类似抗体的结构。由于抗体蛋白结构的复杂性，基因工程抗体药物大多由哺乳动物细胞生产。虽然，近年来哺乳动物细胞的表达水平已有较大的提高，但哺乳动物细胞高昂的培养成本，及培养规模的限制依然严重制约着该类药物的发展，也是导致抗体药物治疗价格昂贵的主要原因。
酵母作为最简单的真核生物，即具有培养成本低廉，易于规模生产，表达水平高，又具有翻译后修饰功能，可以完成蛋白肽链的折叠和蛋白复合体的组装。近年来，酵母糖基工程的发展，又使酵母具备了复杂型糖基合成能力。因而酵母有望成为抗体药物制备的廉价平台。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌及其构建方法与应用。
本发明所提供的表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌的构建方法是将抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因导入酵母中获得重组菌；所述抗体类似物为抗体的Fc片段与蛋白或蛋白亚基形成的融合蛋白；所述抗体的编码基因为抗体的重链编码基因和轻链编码基因，所述抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因的5′末端连接有编码信号肽的序列；所述信号肽为血清白蛋白信号肽。
所述血清白蛋白信号肽可为如下的1)或2)：
1)其氨基酸序列为序列表中的序列1；
2)与序列表中序列1的同源性大于50％的多肽。
所述血清白蛋白信号肽具体可为序列表中的序列5或6或7。研究发现，酵母中影响抗体表达水平的一个重要因素是抗体分泌能力的不足，尤其是重链的分泌是影响整个抗体表达的重要因素，这种现象不仅在全抗体表达时存在，在抗体片段的表达中也发现有类似现象(Gasser B，Maurer M，Gach J，et a1.Engineering ofPichia pastoris for improved production of antibody fragments.BiotechnolBioeng.2006，94(2)：353-61)。
本发明所述抗体的编码基因或抗体类似物的编码基因的5′末端连接有编码血清白蛋白信号肽的核苷酸序列，从而提高抗体及抗体类似物表达水平，因而具有重要的应用前景。不同动物来源的血清白蛋白信号肽序列上有一定的差异，如人血清白蛋白与非洲爪蛙血清白蛋白信号肽序列同源性只有50％，但都有促进抗体分泌的作用，因此上述血清白蛋白信号肽可以来源于各种动物，优选的是哺乳动物血清白蛋白信号肽，如人、牛等血清白蛋白的信号肽。这些序列可以在许多公开数据库，如可以从公开的美国国立生物技术信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者欧洲分子生物实验室EMBL(http://www.embl.org)公开的数据库中获得，编码这些信号肽的DNA，可以采用PCR、酶切等方法从相应物种的cDNA或其文库等获得，也可以采用人工合成的方法获得，这些DNA序列可以是天然序列，也可以用同义密码子替换的序列，尤其是采用酵母偏爱密码子替换原密码子往往有利于抗体的表达。上述血清白蛋白信号肽也可以是来源于各物种的血清白蛋白信号肽，通过物种间重组、突变、缺失等获得的变异体。这些变异体是指与上述信号肽同源性大于50％，并具有促进抗体或抗体类似物分泌的多肽，较优的是同源性大于80％、最优的是同源性大于95％的多肽。这些变异体的构建可以采用定点突变、随机突变、致错PCR、DNA重排等本领域已知的各种方法。血清白蛋白信号肽编码序列可以与抗体的重链基因和/或轻链基因融合，也可以与抗体类似物中Fc融合蛋白基因融合。也可以在信号肽编码序列与基因之间加入接头序列。血清白蛋白信号肽与抗体的一个基因融合，即对抗体的分泌具有明显的促进作用。
抗体由轻、重链两个基因编码，转录后的两条重链和两条轻链在细胞内组装成完整的抗体单体分子。实现抗体高效表达可将两个基因分别置于同一启动子的下游，然后将这两个含有不同基因的表达盒克隆在质粒上，转化酵母后同时表达两个基因。为了使这两个基因在同一个酵母中同时协调表达，还可将两个基因分别置于不同启动子下游，从而明显提高抗体的表达量。避免了由于存在两个相同的启动子，而引起的启动子间同源重组而导致的基因不稳定。这些启动子可以是适合在酵母中使用的各种启动子，如醇氧化酶(AOX)、FLD、甘油醛脱氢酶(GAP)、PMA、乳糖启动子(LAC)、ADH、乙醇氧化酶、PH05、PGK等。优选的是用两种具有相同诱导条件或均为组成型的启动子，如AOX与FLD，均可以用甲醇诱导；GAP与PMA均为组成型启动子等，这些启动子的序列可以从各种文献和公开的数据库，如从美国国立生物技术信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)或者欧洲分子生物实验室EMBL(http://www.embl.org)公开的数据库中获得。根据这些序列，可以用本领域周知的方法，如PCR、人工合成等方法获得这些基因，其中PCR所用模板，可以是各种酵母的基因组DNA、或者含有这些启动子的商业化载体。如美国Invitrogen公司的质粒pPIC9(含AOX1启动子)、pGAP(含GAP启动子)等。用不同启动子控制抗体轻、重链表达的载体的构建，可以用本领域共知的各种方法、如酶切连接、PCR等方法。载体上的其它元件，如载体的复制区、筛选标记等可来源于各种商业化的载体，如PUC19(上海生工公司)、pPIC9(美国Invitrogen公司)等。
抗体类似物为抗体的Fc片段与蛋白或蛋白亚基形成融合蛋白，所述融合蛋白通过Fc上的二硫键形成类似抗体的二聚体结构的蛋白。构建抗体类似物时可以利用Fc段所特有的生物学效应功能，将某些具有特异识别及结合功能的蛋白(如细胞膜受体)与抗体Fc段融合。
所述抗体的Fc片段选自如下任一抗体：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE。
编码上述信号肽的核酸序列与编码抗体重链、轻链或抗体类似物中Fc融合蛋白基因，在保持各自编码氨基酸序列的阅读框不变的条件下融合(同框融合)，获得带有上述信号肽的抗体或抗体类似物的编码基因。该基因插入合适的酵母表达载体获得抗体或抗体类似物的表达载体。该载体转化酵母获得表达抗体或抗体类似物的基因工程酵母，培养该工程酵母，即可制备抗体或抗体类似物。
为了使这种载体能方便地转化同一酵母，这种载体上一般应具有不同的筛选标记基因，这些载体的构建可以用PCR、酶切、连接等本领域共知的方法，筛选标记可以是氨基酸、核苷酸等酵母生长必需成分的合成基因，如HIS4、ADE、ARG、URA3等(Lin Cereghino，G.P.，Lin Cereghino，J.，Sunga，A.J.，Johnson，M.A.，Lim，M.，Gleeson，M.A.and Cregg，J.M.(2001)New selectable marker/auxotrophichost strain combinations for molecular genetic manipulation of Pichiapastoris.Gene，263，159-69.)，也可以是各种抗生素的抗性基因，如Zeocin、Kana等。这些基因的序列在许多文献和Pubmed上都已公开，利用这些序列，以酵母基因组为模板，可以用PCR、文库筛选等方法获得上述氨基酸、核苷酸等酵母生长必需成分的合成基因。而各种抗生素的抗性基因则可以从一些抗性菌株，或一些商业化的载体上获得。如果采用氨基酸、核苷酸等酵母生长必需成分的合成基因作为筛选标记，则需要具有对应基因缺陷的酵母宿主，这些基因缺陷的酵母宿主可以用常规的筛选突变株的方法获得(如，现代生物技术译丛·酵母遗传学实验指南，A.亚当斯等著，刘子铎译，2000，北京，科学出版社)，也可以通过定位敲除基因的部分或全部序列的方法获得。
所述酵母菌可以是任何酵母菌，如乳酸克鲁维酵母、酿酒酵母、毕赤酵母、汉逊酵母菌株。毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母均是一种易于遗传操作，能高效表达异源蛋白并且具备工业规模发酵特性的生产宿主菌。它们既具有原核生物易于培养、培养成本低廉、繁殖快、便于大规模培养和高密度发酵等特性，同时又具有真核生物的蛋白翻译后修饰功能，例如糖基化过程等。因此，本发明中的宿主菌株优选毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母菌。本发明的毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母可以是野生型的，也可以是甘露糖转移酶基因灭活的重组酵母菌。所述毕赤酵母可以为α-1，6-甘露糖转移酶基因(OCH1)灭活的重组酵母菌。一种优选的α-1，6-甘露糖转移酶基因灭活的重组毕赤酵母是敲除了α-1，6-甘露糖转移酶基因约1000bp编码序列的毕赤酵母GJK0601 CGMCC No.1853，其详细构建方法已在专利《α-1，6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株及其构建方法》中公开，专利公开号：CN 101195809 A。所述克鲁维酵母菌可为α-1，6-甘露糖转移酶基因(OCH1)或/和α-1，3-甘露糖转移酶基因(MNN1)灭活的重组克鲁维酵母菌。具体可为乳酸克鲁维酵母α-1，6-甘露糖转移酶(OCH1)缺陷菌(KLGE02，保藏号为CGMCC No.2400)，或α-1，6-甘露糖转移酶和α-1，3-甘露糖转移酶(MNN1)基因双缺陷酵母菌(KLGE03，保藏号为CGMCCNo.2401)，其详细构建方法已在专利《一种重组克鲁维酵母菌及其构建方法和应用》中公开，专利公开号：CN 101285045 A。上述重组酵母突变菌表达的糖蛋白不存在过度糖基化现象，即菌株表达的糖蛋白为低糖基化蛋白，与野生型克鲁维酵母菌表达的过度糖基化蛋白相比，N-糖链上的糖基明显减少。该低糖基化糖蛋白避免了过度糖基化引起的高免疫原性、对活性位点的遮蔽等问题，且消除了不均一性，因而在临床医疗和工业上有更广泛的应用前景。这种通过敲除甘露糖转移酶基因的部分序列获得的菌株不易产生回复突变，菌株的稳定性比利用点突变等方法构建的稳定性更高，更有利于应用于医疗和工业。
所述方法构建的表达抗体及抗体类似物的重组酵母菌也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种制备抗体或抗体类似物的方法。
本发明所提供的制备抗体或抗体类似物的方法，是培养所述表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌生产抗体或抗体类似物。
培养所述表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌，可以用摇瓶或生物反应器等，生产时优选的为生物反应器，如发酵罐。培养基应能提供菌体(或细胞)生长和产物表达所需的物质，应包含氮源、碳源、维生素、微量元素、pH缓冲成分等，培养基配方一般应根据不同培养对象，通过试验获得。培养可以用一阶段培养，即菌体生长的同时，合成目的蛋白。也可以分两个阶段，第一阶段主要用于菌体的生长，第二阶段主要用于蛋白合成。所述纯化制备抗体及抗体类似物的方法为液相层析，优选蛋白A亲和层析。可以用各种蛋白分离的方法分离、纯化抗体或抗体类似物，可以根据待纯化特定蛋白的性质决定纯化方案。如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。
本发明的表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌，是将抗体或抗体类似物的基因导入酵母中获得能够生产完全抗体或抗体类似物的重组酵母菌。酵母作为单细胞低等真核生物，即具有原核生物易于培养、培养成本低廉、繁殖快、便于大规模培养和高密度发酵等特性，又具有真核生物的蛋白折叠、糖基化等翻译后修饰过程，还能将外源蛋白分泌到培养液中，利于纯化的特性。其中乳酸克鲁维酵母和毕赤酵母又是其中比较成熟的表达系统之一，因此本发明优选乳酸克鲁维酵母和毕赤酵母。本发明利用所述表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌制备抗体及抗体类似物，既可以解决生产抗体比较困难、要求产品纯度高、数量大等瓶颈，又可以发挥抗体Fc段提供的功能，如增加抗体及抗体类似物在血液中的半衰期，发挥Fc段介导的靶细胞杀伤和促进细胞吞噬以及诱发生物活性物质释放等生物学效应，因而具有良好的应用前景。
附图说明
图1为带有人血清白蛋白(HSA)信号肽的重链或轻链表达载体。
图2为毕赤酵母表达的抗HER2单克隆抗体。
图3为抗HER2人源化单克隆抗体的含量测定结果。
图4为抗HER2人源化单克隆抗体2的非还原SDS-PAGE分析
图5为抗HER2人源化单克隆抗体1的非还原SDS-PAGE分析。
图6为MTT比色法检测抗HER2人源化单克隆抗体1的活性。
图7为MTT比色法检测抗HER2人源化单克隆抗体2的活性
图8为毕赤酵母表达sTNFRII-IgGFc的还原与非还原SDS-PAGE。
图9为MTT比色法检测抗体类似物sTNFRII-IgGFc的活性。
图10为乳酸克鲁维酵母表达的抗HER2人源化单克隆抗体3的SDS-PAGE。
图11为MTT比色法检测抗HER2人源化单克隆抗体3的活性。
图12为pKLAC1-sTNFRII-IgGFc表达载体示意图。
图13为乳酸克鲁维酵母表达抗体类似物sTNFRII-IgGFc的还原SDS-PAGE。
图14为MTT比色法检测乳酸克鲁维酵母表达抗体类似物sTNFRII-IgGFc的活性。
具体实施方式
下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。下述百分量如无特殊说明均为质量百分含量。
本发明中使用的Pyrobest酶、LA Taq酶、dNTPs、限制性内切酶、T4连接酶、去磷酸化酶等购自大连宝生物工程有限公司，pfu酶、试剂盒、DH5α感受态细胞、引物合成、测序等由上海生工生物工程技术服务有限公司提供和北京博大泰克生物基因技术有限公司提供，PNGF糖苷酶、pKLAC1质粒等购自New England BioLabs(NEB，Ipswich，MA)，pPIC9、pA0815、pPICZaA购自美国Invitrogen公司。
实施例1：抗HER2人源化单克隆抗体在毕赤酵母中的表达
1.抗HER2人源化单克隆抗体全基因的获得
按照Genbank上报道的抗HER2人源化抗体轻、重链序列(Genbank：AAB49171.4，和AAB48814.1)以及毕赤酵母偏爱密码子，设计轻、重链的基因。轻链的核苷酸序列为序列表中的序列3，重链的核苷酸序列为序列表中的序列4。
利用一步PCR的方法设计引物，即将基因分成两段，前一段，分段合成59bp的正向片段，每个片段间重叠20bp，后一段，分段合成59bp的反向片段，所有DNA片段各取1pmol，混合，头尾引物作为正向和反向引物，PCR扩增拼接基因，获得轻链基因L片段(Chain Light，简写为CL或L)和重链基因H片段(Chain Heavy，简写为CH或H)。一步PCR方法参见J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》(第二版，科学出版社，1995)。
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸(轻链基因片段扩增延伸时间40sec；重链基因片段扩增延伸时间1min30sec)，共进行55个循环，最后72℃延伸10min。
抗HER2抗体的轻重链基因目的片段大小分别为650bp和1200bp。
PCR扩增的产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的片段用DNA片段纯化回收试剂盒回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)，然后分别连接于pEASY-Blunt载体(购自北京全式金生物技术有限公司，北京)，构建克隆载体pEASY-L和pEASY-H。
2.带有人血清白蛋白(HSA)信号肽的重链表达载体的构建
用引物HSA1
(5’-CGGGATCCCAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGC-3’)和CH03-1(5’-CGGAATTCTTACTTACCTGGAGACAAAGACAAAG-3’)，以及HSA2(5’-CCAGATTCAACCAATTGAACTTCTCGACGAAACACACCCCTGGAATAAGCCGAGCTAAAGAGAAAAAG-3’)，以重链基因片段为模板，重叠延伸PCR扩增带有HSA信号肽的重链基因。
BamHI和EcoRI双酶切(本试验所用的限制性内切酶均购自宝生物工程有限公司，大连)PCR扩增产物与同样双酶切的pPIC9载体连接，构建带有AOX1启动子和HSA信号肽的重链表达载体pPIC9-HH(图1A)。
用引物KAR2-1
(5’-CGGGATCCAAACGATGCTGTCGTTAAAACCATCTTGGCTGACTTTGGCGGCATTAATGT-3’)，KAR2-2：
(5’-CTGACTTTGGCGGCATTAATGTATGCCATGCTATTGGTCGTAGTGCCATTTGCTAAACC-3’)，KAR2-3
(5’-CCAGATTCAACCAATTGAACTTCAGCTCTAACAGGTTTAGCAAATGGCACTACGACC-3’)和CH03-1以重链基因片段为模板，重叠延伸PCR扩增带有KAR2信号肽的重链基因。
用LS1
(5’-CGGGATCCAAACGATGCTGGGTAAGAACGACCCAATGTGTCTTGTTTTGGTCTTGTTGG-3’)，LS2(5’-TGTCTTGTTTTGGTCTTGTTGGGATTGACTGCTTTGTTGGGTATCTGTC-3’)，LS3(5’-CCAGATTCAACCAATTGAACTTCACCTTGACAGATACCCAACAAAGCAG-3’)和CH03-1以重链基因片段为模板，重叠延伸PCR扩增带有鸡溶菌酶信号肽信号肽的重链基因。
分别用BamHI、EcoRI双酶切(本试验所用的限制性内切酶均购自宝生物工程有限公司，大连)PCR扩增产物与同样双酶切的pPIC9载体连接，分别构建带有AOX1启动子和Kar2信号肽的重链表达载体pPIC9-KH、带有AOX1启动子和鸡溶菌酶信号肽的重链表达载体pPIC9-LH。
PCR扩增带有XhoI酶切位点的重链基因，以重链基因片段为模板，引物为a-factor-1(5’-ATACTCGAGAAAAGAGAAGTTCAATTGGTTGAATCTGG-3’，划线部分为XhoI酶切位点)和CH03-1(5’-CGGAATTCTTACTTACCTGGAGACAAAGACAAAG-3’)。用XhoI和EcoRI双酶切PCR扩增产物与同样双酶切的pPIC9载体连接，构建带有AOX1启动子和α交配因子信号肽的重链表达载体pPIC9-αH。
3.带有人血清白蛋白(HSA)信号肽的轻链表达载体的构建
以轻链基因片段为模板，重叠延伸PCR扩增带有HSA信号肽的轻链基因，引物为HSA1、HSA3
(5’-GGAGATTGAGTCATTTGAATGTCTCGACGAAACACACCCCTGGAATAAGCCGAGCTAAAGAGAAAAAG-3’)和CL03-2(5’-CGGAATTCTTAACACTCACCTCTGTTGAAAGACTTAGTA-3’，划线部分为EcoRI)。
用BamHI、EcoRI双酶切PCR扩增产物与同样双酶切的pPIC9载体连接，构建带有AOX1启动子和HSA信号肽的轻链表达载体pPIC9-HL。
以轻链基因片段为模板，重叠延伸PCR扩增带有Kar2信号肽的轻链基因，引物为KAR2-1
(5’-CGGGATCCAAACGATGCTGTCGTTAAAACCATCTTGGCTGACTTTGGCGGCATTAATGT-3’)，KAR2-2
(5’-CTGACTTTGGCGGCATTAATGTATGCCATGCTATTGGTCGTAGTGCCATTTGCTAAACC-3’)，KAR2-4(5’-GGAGATTGAGTCATTTGAATGTCAGCTCTAACAGGTTTAGCAAATGGCACTACGACC-3’)和CL03-2。
以轻链基因片段为模板，重叠延伸PCR扩增带有鸡溶菌酶信号肽的轻链基因，引物为LS1：
(5’-CGGGATCCAAACGATGCTGGGTAAGAACGACCCAATGTGTCTTGTTTTGGTCTTGTTGG-3’)，LS2(5’-TGTCTTGTTTTGGTCTTGTTGGGATTGACTGCTTTGTTGGGTATCTGTC-3’)和LS4(5’-GGAGATTGAGTCATTTGAATGTCACCTTGACAGATACCCAACAAAGCAG-3’)和CL03-2。
用BamHI和EcoRI双酶切PCR扩增产物与同样双酶切的pPIC9载体连接，分别构建带有AOX1启动子Kar2信号肽的轻链表达载体pPIC9-KL，带有AOX1启动子和鸡溶菌酶信号肽的轻链表达载体pPIC9-LL。
以轻链基因片段为模板，PCR扩增带有XhoI酶切位点的轻链基因，引物为a-factor-1和CL03-2。
用XhoI和EcoRI双酶切PCR扩增产物与同样双酶切的pPIC9载体连接，构建带有AOX1启动子和α交配因子信号肽的轻链表达载体pPIC9-αL。
为了使轻链载体上含有与重链不同的筛选标记基因，选择以Zeocin为抗性筛选标记。按照商业化载体pPICZaA(Invitrogen)上提供的Zeocin抗性基因序列，设计引物zeo-01(5’-TATGATATCCCCACACACCATAGCTTCAAAAT-3’划线部分为EcoRV)和zeo-02(5’-TTAGATATCTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGC-3’划线部分为EcoRV)，PCR扩增获得Zeocin基因。
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR扩增的产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的片段用DNA片段纯化回收试剂盒回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。
回收后的PCR产物用EcoRV酶切，酶切后的片段分别插入同样EcoRV酶切处理的载体pPIC9-L、pPIC9-KL、pPIC9-LL和pPIC9-αL四个载体中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，在含零霉素zeocin(25μg/m1)的LB平板上筛选阳性克隆，重组载体命名为pPIC9Z-L(图1B)、pPIC9Z-KL、pPIC9Z-LL和pPIC9Z-αL。
4.抗HER2单克隆抗体在毕赤酵母中的表达
pPIC9Z-L、pPIC9Z-KL、pPIC9Z-LL和pPIC9Z-αL分别用BglII线性化，线性化后转化毕赤酵母GS115(购自Invitrogen Corp.USA)，转化产物涂布YPDS/Zeocin培养基(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml葡萄糖，1M山梨醇，25μg/ml Zeocin)平板上，30℃培养3-5天，待培养基上长出克隆后，随机挑取转化子提取基因组DNA PCR鉴定阳性克隆，鉴定引物分别为HSA1和CL03-2(含HSA信号肽的轻链基因鉴定引物)，KAR2-1和CL03-2(Kar2信号肽的轻链基因鉴定引物)，LS1和CL03-2(鸡溶菌酶信号肽的轻链基因鉴定引物)，a-factor-1和CL03-2(含α交配因子信号肽的轻链基因鉴定引物)，获得阳性克隆Z-L、Z-KL、Z-LL和Z-αL，制备Z-L、Z-KL、Z-LL和Z-αL感受态细胞，pPIC9-HH用BglII线性化转入Z-L、pPIC9-KH用BglII线性化转入Z-KL、pPIC9-LH用BglII线性化转入Z-LL和pPIC9-αH用BglII线性化转入Z-αL。转化后的菌涂布于MD(YNB 1.34g/100mL，生物素4×10^-5g/100mL，葡萄糖2g/100mL，琼脂1.5g/100mL)平板进行初步筛选。30℃培养3-5天，获得转入pPIC9Z-L和pPIC9-HH的阳性克隆命名为HLL，获得转入pPIC9Z-KL和pPIC9-KH的阳性克隆命名为KHL，获得转入pPIC9-LH和pPIC9Z-LL的阳性克隆命名为LHL，获得转入pPIC9Z-αL和pPIC9-αH的阳性克隆命名为αHL。
随机挑选的多个HLL、KHL、LHL和αHL克隆用如下的方法培养和分析抗体的表达水平。
将MD平板上长出的重组克隆接种到2mL YPD(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml葡萄糖)液体培养基中，28℃ 200rpm振摇培养24h。取1mL培养物转接到20mL BMGY培养基(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，1g/100ml甘油，1.34g/100mL YNB，4×10^-5g/100mL生物素，100mM pB，pH6.0)中(接种量5％)，28℃ 200rpm振摇培养24h，加入100μL甲醇进行诱导(终浓度为0.5mL/100mL)，之后每隔12h补加100μL甲醇，诱导72h后，4℃，7000rpm离心10min，收集上清。
将上清用抗原包被液(碳酸钠缓冲液pH 9.6)稀释25倍，然后各取100μL样品加入酶联板中，4℃包被过夜，弃上清，TBST(10mmol/L Tris·HCl pH7.5，150mmol/LNaCL，0.05％Tween20)洗三次，加入含5％奶粉的TBST，于37℃温育2h，TBST洗三次，羊抗人IgG-HRP(购自华美生物工程公司，中国，洛阳)用含5％奶粉的TBST，1∶1000稀释，每孔加入50μL，37℃温育1h；再用TBST洗五次，每次尽量弃去残液，每孔各加100μL显色液(1.84％Na₂HPO₄·12H₂O，0.5％柠檬酸，临用前再加0.04％邻苯二胺和0.15％H₂O₂)，37℃避光温育15min，最后每孔加20μL终止液(2M H₂SO₄)以终止显色，于492nm处比色。用已知浓度的IgG蛋白(购自华美生物工程公司，中国，洛阳)作为外标，用相同方法分析，以其浓度和OD值制作标准曲线用于计算各重组毕赤酵母培养上清中抗HER2人源化单克隆抗体的含量。
上清中抗HER2人源化单克隆抗体的含量结果如图3，αHL克隆上清液中抗HER2人源化单克隆抗体的含量为72.9±4.2mg/L；HHL克隆上清液中抗HER2人源化单克隆抗体的含量为93.4±9.1mg/L，KHL克隆上清液中抗HER2人源化单克隆抗体的含量为17.3±2.1mg/L，LHL克隆上清液中抗HER2人源化单克隆抗体的含量为11.1±1.1mg/L。同酵母中常用的α交配因子信号肽相比，HSA的信号肽可以使抗体的表达量提高28％，差异显著(P＜0.05)，而Kar2信号肽和鸡溶菌酶信号肽用于抗体表达时，较HSA的信号肽差，差异极显著(P＜0.01)。
图3中为不同信号肽下各培养上清表达抗体水平，A：αHL克隆上清液B：HHL克隆上清液C：KHL克隆上清液D：LHL克隆上清液。表达水平分别为5个独立克隆的平均值，*表示B与对照A相比差异显著(P＜0.05)，料表示C、D与对照A相比差异极显著(P＜0.01)。
表达上清进行SDS-PAGE，可明显看到轻链和重链的表达带(图2)。
图2中，“1”为HHL克隆表达上清，“2”为人免疫球蛋白，“M”为蛋白分子量标准，“H”和“L”所对应的条带为抗体的重链(H)和轻链(L)。
HHL克隆采用如下的方法培养，并纯化抗体，获得的抗体经SDS-PAGE后，电转PVDF膜，考马斯亮兰染色后，切下重链对应条带，送国家生物医学分析中心用Edman降解法测定N-端的5个氨基酸序列为EVQLV。其氨基酸序列与重链N-端的理论序列一致，说明HSA信号肽已经被正确切除了。
除了人血清白蛋白信号肽具有促进抗体表达作用外，其它物种的血清白蛋白信号肽也具有类似的作用，表1例举了一些其它物种信号肽，其中以非洲爪蛙(Xenopuslaevis)血清白蛋白(XSA)信号肽为例，说明其促进抗体表达的作用。
引物为XSA1、CH03-1和XSA2以重链基因片段为模板，重叠延伸PCR扩增带有非洲爪蛙血清白蛋白(XSA)信号肽的重链基因。
XSA1：5’-CGGGATCCCAAACGATGAAGTGGATCACCCTGATTTGTCTGTTAATTAGCTCCTCTTTCAT-3’；
XSA2：5’-CCAGATTCAACCAATTGAACTTCTCTTTTGAAAAGTATCCTTGATTCAATGAAAGAGGAGCTAATTAA-3’。
用引物XSA1、XSA3和CL03-2，以轻链基因片段为模板，重叠延伸PCR扩增带有XSA信号肽的轻链基因。
XSA3：5’-GGAGATTGAGTCATTTGAATGTCTCTTTTGAAAAGTATCCTTGATTCAATGAAAGAGGAGCTAATTAA-3’。
分别用BamHI和EcoRI双酶切带有XSA信号肽的重链基因和带有XSA信号肽的轻链基因，与同样双酶切的pPIC9载体连接，分别构建带有AOX1启动子XSA信号肽的轻链表达载体pPIC9Z-XL，带有AOX1启动子XSA信号肽的重链表达载体pPIC9-XH。
pPIC9Z-XL用BglII线性化，线性化后转化毕赤酵母GS115，获得重组菌，再将pPIC9-XH用BglII线性化转入上述重组菌，获得毕赤酵母XHL。
毕赤酵母XHL接种到2mL YPD(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml葡萄糖)液体培养基中，28℃200rpm振摇培养24h。取1mL培养物转接到20mL BMGY培养基(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，1g/100ml甘油，1.34g/100mL YNB，4×10^-5g/100mL生物素，100mM pB，pH6.0)中(接种量5％)，28℃200rpm振摇培养24h，加入100μL甲醇进行诱导(终浓度为0.5mL/100mL)，之后每隔12h补加100μL甲醇，诱导72h后，4℃，7000rpm离心10min，收集上清。
毕赤酵母XHL表达上清进行SDS-PAGE，可明显看到轻链和重链的表达带(图4)。XHL克隆上清中抗HER2人源化单克隆抗体的含量为88.2±2.0mg/L。其他信号肽引导的抗体的表达水平如表1所示。
图4中，“1”为XHL克隆表达上清，“2”为人免疫球蛋白，“M”为蛋白分子量标准，“H”和“L”所对应的条带为抗体的重链(H)和轻链(L)。
表1.不同物种的血清白蛋白信号肽引导的抗体的表达水平


同源性是指各信号肽序列与人血清白蛋白信号肽序列相比的同源性。
5.表达上清中抗体的纯化
将HHL克隆和XHL克隆培养上清分别用NaOH调pH至7.0后，用HiTraprProteinA FF亲合柱进行纯化(购自GE healthcare)：层析柱先用20mM pH7.0的磷酸钠缓冲液平衡，以1mL/min的流速上样，上样结束后，先用5倍柱体积的20mMpH7.0的磷酸钠缓冲液洗柱，然后再用0.1M柠檬酸溶液(pH3.0)进行洗脱，洗脱液pH值用1M Tris-HCl(pH9.0)调至中性。
将HHL克隆和XHL克隆培养上清中纯化后所获得的蛋白命名为抗HER2人源化单克隆抗体1和2。
对抗HER2人源化单克隆抗体1进行非还原SDS-PAGE分析。
非还原SDS-PAGE如图5，其大小与非还原的对照IgG的相对分子量一致，纯化样品中为完整的抗体分子，这说明酵母表达的轻重链能够自发通过分子间二硫键正确装配成完整的抗体分子。
图5中，1为人免疫球蛋白，2为纯化的毕赤酵母表达抗体1，M为蛋白分子量标准。
用羊抗人IgG ELISA分析。将上清用抗原包被液(碳酸钠缓冲液pH 9.6)稀释25倍，然后各取100μL样品加入酶联板中，4℃包被过夜，弃上清，TBST(10mmol/LTris·HCl pH7.5，150mmol/L NaCL，0.05％Tween20)洗三次，加入含5％奶粉的TBST，于37℃温育2h，TBST洗三次，羊抗人IgG-HRP(购自华美生物工程公司，中国，洛阳)用含5％奶粉的TBST，1∶1000稀释，每孔加入50μL，37℃温育1h；再用TBST洗五次，每次尽量弃去残液，每孔各加100μL显色液(1.84％Na₂HPO₄·12H₂O，0.5％柠檬酸，临用前再加0.04％邻苯二胺和0.15％H₂O₂)，37℃避光温育15min，最后每孔加20μL终止液(2M H₂SO₄)以终止显色，于492nm处比色。
抗HER2人源化单克隆抗体1和2分别与羊抗人抗体有特异性结合，为人抗体。抗HER2人源化单克隆抗体1的浓度为0.2mg/mL。
6.酵母表达抗体的活性测定
用MTT比色法检测抗HER2人源化单克隆抗体1和2分别对高表达p185^erbB2的乳腺癌细胞系SKBR3和低表达p185^erbB2的乳腺癌细胞系MCF7生长的作用(两株细胞均购自购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，中国上海)。两种细胞均以含10％FBS的DMEM培养液在37℃及体积分数5％CO₂的湿化培养箱中培养。两种细胞按1×10⁴个/孔铺96孔板，培养至细胞贴壁，分别加入0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2和0.4μg/ml的抗HER2人源化单克隆抗体1，设阳性、阴性和空白对照，阴性对照加入相应量的正常人血清IgG，空白对照加入相应量的DMEM培养液，培养一定时间后加入10μl 5mg/ml的MTT/孔，培养4-5h后，加入10％SDS和0.1N HCl80μl/孔。37℃放置过夜后，于波长570nm处测光密度值。
抗HER2人源化单克隆抗体1的MTT比色法结果如图6，表明纯化抗HER2人源化单克隆抗体1对高表达p185^erbB2的SKBR3细胞有明显的生长抑制作用，半数有效浓度为0.17mg/L，而对低表达p185^erbB2的MCF7细胞无明显生长抑制作用。而非特异性的人IgG对两种细胞均无作用。说明抗HER2人源化单克隆抗体1具有针对其抗原p185^erbB2的特异性细胞杀伤作用。
图6中，A为不同浓度的抗HER2人源化单克隆抗体1对高表达p185^erbB2的SKBR3细胞的作用，B为不同浓度的抗HER2人源化单克隆抗体1对低表达p185^erbB2的MCF7细胞作用。
抗HER2人源化单克隆抗体2的MTT比色法结果如图7，表明纯化抗HER2人源化单克隆抗体2对高表达p185^erbB2的SKBR3细胞有明显的生长抑制作用，半数有效浓度为0.17mg/L，而对低表达p185^erbB2的MCF7细胞无明显生长抑制作用。而非特异性的人IgG对两种细胞均无作用。说明抗抗HER2人源化单克隆抗体2具有针对其抗原p185^erbB2的特异性细胞杀伤作用。
图7中，A为不同浓度的抗HER2人源化单克隆抗体2对高表达p185^erbB2的SKBR3细胞的作用，B为不同浓度的抗HER2人源化单克隆抗体2对低表达p185^erbB2的MCF7细胞作用。
实施例2、抗Her2人源化抗体在乳酸克鲁维酵母中的表达
1.含不同信号肽的抗HER2人源化抗体轻链、重链基因的获得
以实施例1构建的载体pPIC9-HL，PCR扩增含HSA信号肽的抗体重链基因H(Heavy chain)片段，引物为HSA-KL-01(5’-CGACTAGTCAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGC-3’，划线部分为SpeI酶切位点)和引物Her2-03：(5’-CGGCGGCCGCTTACTTACCTGGAGACAAAGACAAAG-3’，划线部分为NotI酶切位点)。
PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR产物经DNA片段纯化回收试剂盒回收。
以实施例1构建的载体pPIC9-HH为模板，PCR扩增含HSA信号肽的抗体轻链基因(Light chain)L片段，引物为HSA-KL-01和Her2-04(5’-CGGCGGCCGCTTAACACTCACCTCTGTTGAAAGACTTAGTA-3’，划线部分为NotI酶切位点)。
PCR产物经DNA片段纯化回收试剂盒回收。
含Kar2信号肽、鸡溶菌酶信号肽和α交配因子信号肽的重链基因和轻链基因获得方法同上，引物分别如下：
含Kar2信号肽重链基因的扩增利用引物KAR2-KL-01：(5’-CGACTAGTAAACGATGCTGTCGTTAAAACCATCTTGGC-3’，划线部分为SpeI酶切位点)和引物Her2-03；
含Kar2信号肽轻链基因的扩增利用引物KAR2-KL-01和引物Her2-04。
含鸡溶菌酶信号肽重链基因的扩增利用引物SL-KL-01：(5’-CGACTAGTAAACGATGCTGGGTAAGAACGACCCAATG-3’，划线部分为SpeI酶切位点)和引物Her2-03；
含鸡溶菌酶信号肽轻链基因的扩增利用引物SL-KL-01和引物Her2-04。
含α交配因子信号肽重链基因的扩增利用引物a-factor-KL-01：(5’-CGACTAGTAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTG-3’，划线部分为SpeI酶切位点)和引物Her2-03；
含α交配因子信号肽轻链基因的扩增利用引物a-factor-KL-01和引物Her2-04。
2.抗体轻重链表达载体的构建
(1)含表达框、整合位点的抗体轻链表达载体的构建
用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取乳酸克鲁维酵母ATCC8585(American Type Culture Collection，美国典型微生物菌种保藏中心，Manassas，VA 20108 USA)的基因组DNA，以该基因组DNA为模板扩增α-1，6-甘露糖转移酶(OCH1)基因两侧的同源臂，作为抗体轻链表达载体在染色体上的整合位点，OCH1两侧的同源区分别为2kb。
扩增OCH1上游侧翼区同源臂(OCH1 5′同源臂)所用的引物为KLOCH01和KLOCH02，引物序列为：5′-ACTGCTAGCATGTGGAAGTGATCTGTGGAGA-3′(划线部分为NheI识别位点)和5′-ATCTAGGTACCTGAGAGCTCGTTGGAAAGACTGAAGATGAAAGCA-3′；
扩增OCH1下游侧翼区同源臂(OCH1 3′同源臂)所用的引物为KLOCH03和KLOCH04，引物序列为：5′-CCAACGAGCTCTCAGGTACCTAGATCCATCAAATGATCACCGT-3′和5′-GATACGCGTGTCACATACCGATTGATCGATAC-3′(划线部分为MluI识别位点)。
两个同源臂的PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸2min30sec进行30次循环，最后72℃延伸10min；目的片段大小在2kb左右。将PCR产物用DNA回收纯化试剂盒纯化回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。利用重叠延伸PCR的方法融合OCH1 5′同源臂和3′同源臂(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)，以OCH1 5′同源臂和3′同源臂PCR产物为模板，以KLOCH01/04为引物，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性1min、55℃复性1min、72℃延伸4min30sec进行30次循环，最后72℃延伸10min；目的片段大小在4kb左右。PCR产物用DNA回收纯化试剂盒纯化回收。NheI/MluI双酶切(宝生物工程有限公司，大连)嵌合体片段，酶切后的嵌合体片段插入同样双酶切处理的载体pYES2(购自Invitrogen Corp.USA)中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上筛选阳性克隆。用NheI/MluI双酶切鉴定阳性克隆，将NheI和MluI酶切得到4000bp左右和3000bp左右片段的重组载体命名为pYES2-och1。
构建含LAC4启动子的表达盒：
在重组载体pYES2-och1基础上，以质粒pKLAC1(New England BioLabs(NEB，Ipswich，MA)为模板扩增LAC4启动子，约1.1kb，及终止子片段，约700bp，两端带有XbaI和SalI酶切位点。该启动子可以用半乳糖进行诱导表达，属于强诱导型启动子。通过PCR方法融合了这两个片段，从而获得约1.8kb LAC4表达盒。LAC4启动子和终止子之间带有一个多克隆位点SpeI-AscI-NotI，以利于分泌信号和目的基因的插入和替换。
扩增LAC4启动子所用的引物为PLAC4-01和PLAC4-02，引物序列分别为：   5′-TGCTCTAGACGGATGAAAGGGGAATCGTAT-3′(划线部分为XbaI识别位点)和5′-CCACTAGTCTCGATGAGTATGTGTGTTTA-3′(划线部分为SpeI识别位点)。
扩增LAC4终止子所用的引物为PLAC4-03和PLAC4-04，引物序列分别为：
5′-TAAACACACATACTCATCGAGACTAGTACGGCGCGCCTGCGGCCGCTT-3′(划线部分分别为SpeI-AscI-NotI识别位点)和5′-TATGAGCTCTCCCGATGTATGGGTTTGGTTGCCA-3′(划线部分为SacI识别位点)。
PCR扩增启动子条件如下：95℃预变性5min，然后25个循环(94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min 30s)，72℃延伸10min，4℃保存。
PCR扩增终止子条件如下：95℃预变性5min，然后25个循环(94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min，4℃保存。
1％琼脂糖进行电泳回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。
以LAC4启动子和LAC4终止子PCR产物为模板，以PLAC4-01/04为引物，利用重叠延伸PCR的方法融合LAC4启动子和终止子(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)。
PCR扩增条件如下：95℃预变性5min后，按照94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸2min，进行25次循环，最后72℃延伸10min。
目的片段大小在2kb左右。PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。
XbaI/SacI双酶切PCR产物插入同样双酶切处理的载体pYES2-och1中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上筛选阳性克隆。用XbaI/SacI双酶切鉴定阳性克隆，将XbaI/SacI酶切得到7000bp左右和2000bp左右片段的重组载体命名为pYES2-och1-LAC4。
SpeI/NotI双酶切含HSA信号肽的抗体轻链基因(Light chain)L片段，酶切后的抗体轻链L片段插入同样双酶切的重组载体pYES2-och1-LAC4中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上筛选阳性克隆。用SpeI/NotI双酶切鉴定阳性克隆，将SpeI/NotI酶切得到9000bp左右和700bp左右片段的重组载体命名为pYES2-och1-LAC4-HL。
在pYES2-och1-LAC4载体基础上，按照上述方法获得pYES2-och1-LAC4-KL(Kar2信号肽)、pYES2-och1-LAC4-LL(鸡溶菌酶信号肽)和pYES2-och1-LAC4-αL(α交配因子信号肽)轻链表达载体。即利用SpeI/NotI双酶切含Kar2信号肽、鸡溶菌酶信号肽和α交配因子信号肽的抗体轻链基因(Light chain)L片段，酶切后的抗体轻链L片段插入同样双酶切的重组载体pYES2-och1-LAC4中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上筛选阳性克隆。用SpeI/NotI双酶切鉴定阳性克隆，将SpeI/NotI酶切得到9000bp左右和700bp左右片段的重组载体命名为pYES2-och1-LAC4-KL、pYES2-och1-LAC4-LL、pYES2-och1-LAC4-αL。
(2)含表达框、整合位点的抗体重链表达载体的构建
用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取乳酸克鲁维酵母ATCC8585(American Type Culture Collection，美国典型微生物菌种保藏中心，Manassas，VA 20108 USA)的基因组DNA，以该基因组DNA为模板扩增URA3基因两侧的同源臂，作为抗体重链表达载体在染色体上的整合位点，URA3两侧的同源区分别为0.8kb。
扩增URA3上游侧翼区同源臂(URA3 5′同源臂)所用的引物为KLURA3-1和KLURA3-2，引物序列分别为：5′-atcagatctagcagtagcagcacccacaag-3′(划线部分为BglII识别位点)和5′-atagagctcaaatctagagtgcaactaattgacgggagt-3′(划线部分为SacI和XbaI识别位点)；
扩增URA3下游侧翼区同源臂(URA3 3′同源臂)所用的引物为KLURA3-3和KLURA3-4，引物序列为：5′-tctagatttgagctctatgagaatcagcgctccccatt-3′(划线部分为XbaI和SacI识别位点)和5′-atagtcgacggcaatgaaatgcaaacctttcta-3′(划线部分为SalI识别位点)。
两个同源臂的PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸1min进行30次循环，最后72℃延伸10min；
目的片段大小在0.8kb左右。将PCR产物用DNA回收纯化试剂盒纯化回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。
以URA3 5′同源臂和3′同源臂PCR产物为模板，以KLURA3-1和URA3-4为引物，利用重叠延伸PCR的方法融合URA3 5′同源臂和3′同源臂(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)。
PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性1min、55℃复性1min、72℃延伸2min30sec进行30次循环，最后72℃延伸10min。
目的片段大小在1.6kb左右。PCR产物用DNA回收纯化试剂盒纯化回收。
BglII/SalI双酶切(宝生物工程有限公司，大连)该PCR产物插入同样双酶切处理的pPICZαA(购自Invitrogen Corp.USA)中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，在含零霉素(Zeocin 25μg/ml，购自Invitrogen Corp.USA)的LB平板上筛选阳性克隆。用BglII/SalI双酶切鉴定阳性克隆，将BglII和SalI酶切得到约1500bp左右和2200bp左右片段的重组载体命名为pPICZαA-URA3。
在重组载体pPICZαA-URA3基础上，以质粒pKLAC1(New England BioLabs(NEB，Ipswich，MA)为模板扩增LAC4启动子，约1.1kb，及终止子片段，约700bp，两端带有XbaI和SalI酶切位点。该启动子可以用半乳糖进行诱导表达，属于强诱导型启动子。通过PCR方法融合了这两个片段，从而获得约1.8kb LAC4表达盒。LAC4启动子和终止子之间带有一个多克隆位点SpeI-AscI-NotI，以利于分泌信号和目的基因的插入和替换。
扩增LAC4启动子所用的引物为PLAC4-01和PLAC4-02，引物序列为：
5′-TGCTCTAGACGGATGAAAGGGGAATCGTAT-3′(划线部分为XbaI识别位点)和5′-CCACTAGTCTCGATGAGTATGTGTGTTTA-3′(划线部分为SpeI识别位点)。
扩增LAC4终止子所用的引物为PLAC4-03和PLAC4-04，引物序列为：
5′-TAAACACACATACTCATCGAGACTAGTACGGCGCGCCTGCGGCCGCTT-3′(划线部分分别为SpeI-AscI-NotI识别位点)和5′-TATGAGCTCTCCCGATGTATGGGTTTGGTTGCCA-3′(划线部分为SacI识别位点)。
PCR扩增启动子条件如下：95℃预变性5min，然后25个循环(94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min 30s)，72℃延伸10min，4℃保存。
PCR扩增终止子条件如下：95℃预变性5min，然后25个循环(94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min)，72℃延伸10min，4℃保存。
1％琼脂糖进行电泳回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。
以LAC4启动子和LAC4终止子PCR产物为模板，以PLAC4-01/04为引物，利用重叠延伸PCR的方法融合LAC4启动子和终止子(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)。
PCR扩增条件如下：95℃预变性5min后，按照94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸2min，进行25次循环，最后72℃延伸10min。
目的片段大小在2kb左右。PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。
XbaI/SacI双酶切该PCR产物插入同样双酶切处理的载体pYES2-och1中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，在含零霉素(Zeocin 25μg/ml)的LB平板上筛选阳性克隆。用XbaI/SacI双酶切鉴定阳性克隆，将XbaI/SacI酶切得到4000bp左右和2000bp左右片段的重组载体命名为pPICZαA-URA3-LAC4。
SpeI/NotI双酶切带有HSA信号肽抗体重链基因片段，酶切后的抗体重链基因H片段插入同样双酶切处理的重组载体pPICZαA-URA3-LAC4中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，在含Zeocin(100μg/ml)的LB平板上筛选阳性克隆。用SpeI/NotI双酶切鉴定阳性克隆，将SpeI/NotI酶切得到6000bp左右和1500bp左右片段的重组载体命名为pPICZαA-ura3-LAC4-H。
在pPICZαA-ura3-LAC4载体基础上，按照上述方法获得pYES2-och1-LAC4-KH(Kar2信号肽)、pYES2-och1-LAC4-LH(鸡溶菌酶信号肽)和pYES2-och1-LAC4-αH(α交配因子信号肽)重链表达载体。即利用SpeI/NotI双酶切带有Kar2信号肽、鸡溶菌酶信号肽、α交配因子信号肽抗体重链基因片段，酶切后的抗体重链基因H片段插入同样双酶切处理的重组载体pPICZαA-URA3-LAC4中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，在含Zeocin(100μg/ml)的LB平板上筛选阳性克隆。用SpeI/NotI双酶切鉴定阳性克隆，将SpeI/NotI酶切得到6000bp左右和1500bp左右片段的重组载体命名为pPICZαA-ura3-LAC4-KH、pPICZαA-ura3-LAC4-LH、pPICZαA-ura3-LAC4-αH)。
3.抗HER2单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母中的表达
采用电转化法将重组载体pYES2-och1-LAC4-L和pPICZαA-ura3-LAC4-H转化入乳酸克鲁维酵母ATCC8585中，电转化的方法为本领域所共知(如A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)。电转化前，将上述表达载体pYES2-och1-LAC4-L和pPICZαA-ura3-LAC4-H用SwaI进行线性化。
pYES2-och1-LAC4-L先电转入制备好的乳酸克鲁维酵母ATCC8585感受态细胞中，涂布于MD培养基(YNB 1.34g/100mL，生物素4×10^-5g/100mL，葡萄糖2g/100mL，琼脂1.5g/100mL)平板上。30℃培养3-5天，待培养基上长出克隆后，随机挑取几个转化子提取基因组DNA进行PCR鉴定阳性克隆，PCR引物分别为HSA-KL-01和Her2-04(含HSA信号肽的抗体轻链基因鉴定引物)；KAR2-KL-01和Her2-04(含Kar2信号肽轻链基因鉴定引物)；SL-KL-01和引物Her2-04(含鸡溶菌酶信号肽轻链基因鉴定引物)；a-factor-KL-01和Her2-04(α交配因子信号肽轻链基因鉴定引物)，制备该阳性克隆感受态细胞，将线性化后的pPICZαA-ura3-LAC4-H转入制备好的整合有抗体轻链片段的感受态细胞中，涂布于YPDS/Zeocin培养基(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml葡萄糖，1M山梨醇，25μg/mlZeocin)平板上，30℃培养3-5天，待培养基上长出克隆后，随机挑选的20个克隆进行诱导表达，含有整合表达片段的每一个菌株培养物，用无菌枪头刮取约2mm²的单克隆细胞，置于2ml YPGal培养液(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml半乳糖)中重悬，30℃振荡培养(250-300rpm)，诱导72小时后离心取上清，用于融合蛋白的表达分析。以pYES2空载体和pPICZαA空载体共同转化的乳酸克鲁维酵母ATCC8585为阴性对照。
SDS-PAGE电泳结果如图10所示，经考马斯亮蓝染色后，转入重组载体pYES2-och1-LAC4-L和pPICZαA-ura3-LAC4-H的乳酸克鲁维酵母ATCC8585的培养上清在50KD和30KD处可看到明显的表达带，与阳性对照正常人血清IgG的条带大小相似，与其理论分子量相符，pYES2空载体和pPICZαA空载体共同转化的乳酸克鲁维酵母ATCC8585在50KD和30KD处无表达带。
图10中，1为转入重组载体pYES2-och1-LAC4-L和pPICZαA-ura3-LAC4-H的乳酸克鲁维酵母ATCC8585培养液，2为人免疫球蛋白对照，M为蛋白分子量标准，其各条带对应的分子量标于右侧，CH和CL所对应的条带为抗体的重链和轻链。
4.乳酸克鲁维酵母表达上清中抗体的纯化
取100ml转入重组载体pYES2-och1-LAC4-CL和pPICZαA-ura3-LAC4-H的乳酸克鲁维酵母ATCC8585的培养上清调pH至7.0后，用HiTrap rProteinA FF亲合柱(购自GE Healthcare Life Science，USA，17-5079-02)进行纯化：层析柱先用20mM pH7.0的磷酸钠缓冲液平衡，以1mL/min的流速上样，上样结束后，用5倍柱体积的20mM pH7.0的磷酸钠缓冲液洗柱，然后再用0.1M柠檬酸溶液(pH3.0)进行洗脱，洗脱液pH值用1M Tris-HCl(pH9.0)调至中性获得纯化的抗Her2人源化抗体3。抗Her2人源化抗体3进行还原及非还原SDS-PAGE分析。
还原及非还原SDS-PAGE结果与毕赤酵母表达抗体的结果一致，还原的纯化抗Her2人源化抗体3中轻重链的大小与对照IgG中轻重链的相对分子量基本上一致，在理论值55KD附近。非还原的纯化抗Her2人源化抗体3相对分子量大于96kD，与非还原的对照IgG的相对分子量一致。还原电泳结果显示纯化抗Her2人源化抗体3中分别含有抗体的轻重链，而非还原电泳结果表明，纯化抗Her2人源化抗体3中含有完整的抗体分子，这证明酵母表达的轻重链能够自发通过分子间二硫键正确装配成完整的抗体分子。
5.乳酸克鲁维酵母表达抗体的N端氨基酸测序
纯化抗Her2人源化抗体3经SDS-PAGE电泳，然后通过电转移的方法将蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜经考马斯亮蓝染色和脱色，送至军事医学科学院仪器中心实验室对重链的蛋白条带进行N-末端氨基酸残基序列分析(方法参照汪家政、范明主编《蛋白质技术手册》(科学出版社，2000年))。
利用N-端测序的方式来验证该蛋白条带的氨基酸序列，测序结果表明，该蛋白的N末端五个氨基酸的序列为：谷氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、缬氨酸(EVQLV)，同抗体重链N末端的氨基酸序列一致，说明它是抗体的重链。
6.乳酸克鲁维酵母表达的抗Her2人源化抗体3的活性测定
用MTT比色法检测酵母表达抗体分别对高表达p185^erbB2的乳腺癌细胞系SKBR3(购自中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库)和低表达p185^erbB2的乳腺癌细胞系MCF7(购自中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库)生长的作用。
用0.25％胰酶(GIBCO)将生长良好的SKBR3和MCF7细胞消化2min，倒去消化液，用DMEM培养基(GIBCO)分散细胞，用细胞计数板计数后，将细胞用含10％FBS的DMEM培养基稀释至1×10⁵/ml获得细胞悬液；取无菌洁净的96孔细胞培养板，每孔加入100μl细胞悬液，放置于37℃、5％CO₂水汽饱和的细胞培养箱中培养至细胞贴壁(约24h)。用含10％FBS的DMEM培养基稀释纯化抗Her2人源化抗体2至终浓度为4μg/ml，然后用含10％FBS的DMEM培养基在96孔板上依次进行抗Her2人源化抗体2的梯度稀释，起始为原液浓度的1/10，然后依次进行1/2稀释，共稀释七次，每个点设三个复孔。同时做阴性和空白对照，阴性孔为含相同浓度的正常人血清IgG，空白对照不加任何样品。将上述配制好的梯度抗Her2人源化抗体2转移至96孔板，盖好盖后放回细胞培养箱中继续培养一定时间(SKBR3细胞培养72h，MCF7细胞培养30h)，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，37℃继续培养4h，每孔加入80μL终止液(20％SDS，0.1N HCl)，37℃继续培养过夜，使结晶物充分溶解；在酶联免疫检测仪上570nm处测定各孔光吸收度值，记录结果。
MTT比色法检测结果如图11所示，说明乳酸克鲁维酵母表达的抗HER2人源化单克隆抗体3对高表达p185^erbB2的SKBR3细胞有抑制作用，纯化抗体与SKBR3和MCF7细胞作用一定时间后，MTT比色检测发现，纯化抗HER2人源化单克隆抗体3对高表达p185^erbB2的SKBR3细胞有明显的生长抑制作用，而对低表达p185^erbB2的MCF7细胞无明显生长抑制作用。而非特异性的人IgG对两种细胞均无作用，说明抗Her2抗体具有针对其抗原p185^erbB2的特异性细胞杀伤作用。
图11中，A：为不同浓度的抗HER2人源化单克隆抗体3对高表达p185^erbB2的SKBR3细胞的作用；B：为不同浓度的抗HER2人源化单克隆抗体3对低表达p185^erbB2的MCF7细胞作用。
实施例3、抗体类似物sTNFRII-IgGFc在毕赤酵母中的表达
1.sTNFRII-IgGFc融合蛋白基因克隆
取健康人的酸性柠檬酸葡萄糖(ACD)抗凝静脉血，Hanks液稀释后，用淋巴细胞分离液离心获得淋巴细胞，用含10％胎牛血清的(Hyclone公司)的1640培养基调细胞数为5×10⁶个/mL，置于细胞培养箱温育2h后换用脂多糖(LPS，20μg/mL)(Sigma公司)和10％胎牛血清的1640的新鲜培养基，继续培养5h后离心富集细胞；TRIzol(上海生工生物工程技术服务有限公司)法提取总RNA(按照TRIzol说明书进行操作)；总RNA经逆转录后得到cDNA(RT-PCR试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司，按照试剂盒说明进行操作)，然后以该cDNA为模板，利用引物N1(5’-ATCTCGAGAAAAGAGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCAT-3’)和C1(5’-AGTTTTGTCACAAGATTTGGGCTCGTCGCCAGTGCTCCCTTCAGC-3’)，用pfu聚合酶(上海生工生物工程技术服务有限公司)PCR分别钓取sTNFRII，并使sTNFRII的C端带上含有抗体Fc的N端部分的序列。
PCR扩增条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，循环30次；最后72℃延伸10min；
同样利用引物N2(5’-GCTGAAGGGAGCACTGGCGACGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT-3’)和C2(5’-ACGAATTCTTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’)，以该cDNA为模板PCR钓取抗体Fc，并使抗体Fc的N端带上含有sTNFRII的C端部分的序列。
PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min30sec，循环30次；最后72℃延伸10min；
以带有接头的两个PCR产物为模板，N1和C2为引物，将得到的两个PCR产物通过重叠延伸PCR的方法进行体外拼接。
PCR反应条件如下：94℃预变性5min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸3min，循环30次；最后72℃延伸10min。
测序正确的PCR产物为sTNFRII-IgGFc融合蛋白基因，将其进行XhoI/EcoRI双酶切，酶切后插入同样双酶切处理的含有α因子信号肽引导序列的酵母表达质粒pPIC9中，构建成巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPIC9-α-TNFR/Fc(简写为pPIC9-αTF)。
2.带有人血清白蛋白(HSA)信号肽的抗体类似物sTNFRII-IgGFc表达载体的构建
以pPIC9-sTNFRII-IgGFc及人工合成的片段HSA3AS(5’-ATGCCACCTGGGCGGGCAAGGCTCGACGAAACACACCCCTGGAATAAGCCGAGCTAAAGAGAAAAAG-3’)为模板，以引物HSA 1和C2为引物，重叠延伸PCR扩增带有HSA信号肽的sTNFRII-IgGFc基因。
用BamHI/EcoRI双酶切PCR扩增产物与同样酶切的pPIC9载体连接，构建带有HSA信号肽的sTNFRII-IgGFc表达载体pPIC9-H-TNFR/Fc(简写为pPIC9-HTF)。
3.表达抗体类似物sTNFRII-IgGFc的毕赤酵母的获得
将上述pPIC9-αTF和pPIC9-HTF载体分别用StuI内切酶线性化后，转化毕赤酵母GS115，并涂布于MD平板。30℃培养3-5天，分别获得毕赤酵母αTF和HTF克隆。毕赤酵母αTF和HTF克隆分别接种到2mL YPD液体培养基中，28℃ 200rpm振摇培养24h。取1mL培养物转接到20mL BMGY培养基中(接种量5％)，28℃ 200rpm振摇培养24h，加入100μL甲醇进行诱导(终浓度为0.5％)，之后每隔12h补加100μL甲醇，诱导72h后，4℃，7000rpm离心10min，收集上清。将毕赤酵母αTF和HTF表达上清分别用抗原包被液稀释25倍，然后各取100μL样品加入酶联板中，4℃包被过夜，弃上清，TBST(10mmol/L Tri s.HCl pH7.5，150mmol/L NaCL，0.05％Tween20)洗三次，加入含5％奶粉的TBST，于37℃温育2h，TBST洗三次，羊抗人IgG-HRP(购自华美生物工程公司，中国，洛阳)用含5％奶粉的TBST，1∶1000稀释，每孔加入50μL，37℃温育1h；再用TBST洗五次，每次尽量弃去残液，每孔各加100μL显色液(1.84％Na₂HPO₄·12H₂O，0.5％柠檬酸，临用前再加0.04％邻苯二胺和0.15％H₂O₂)，37℃避光温育15min，最后每孔加20μL终止液(2M H₂SO₄)以终止显色，于492nm处比色。
呈现颜色变化的毕赤酵母αTF和HTF克隆的上清用于下述实验。
4.毕赤酵母表达sTNFRII/Fc阳性克隆上清的纯化
将毕赤酵母αTF和HTF克隆的上清调pH至7.0后，用HiTrap rProteinA FF亲合柱进行纯化：层析柱先用20mM pH7.0的磷酸钠缓冲液平衡，以1mL/min的流速上样，上样结束后，先用5倍柱体积的20mM pH7.0的磷酸钠缓冲液洗柱，然后再用0.1M柠檬酸溶液(pH3.0)进行洗脱，洗脱液pH值用1M Tris-HCl(pH9.0)调至中性。纯化后的蛋白浓度采用Bradford蛋白定量试剂盒进行测定，纯化后的的蛋白即为sTNFRII-IgGFc融合蛋白。毕赤酵母αTF上清中sTNFRII-IgGFc融合蛋白浓度为2mg/L。HTF单克隆上清中sTNFRII-IgGFc融合蛋白浓度为18mg/L。
经Protein A亲和柱再一次纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白进行10％SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色结果如图8所示，从蛋白条带的位置来看，还原的融合蛋白大小在66kD与80kD之间，而非还原的融合蛋白大小小于116kD，说明该融合蛋白为通过分子间二硫键连接形成的二聚体。
图8中，1为非还原电泳，2为还原电泳，M为蛋白分子量标准。
5.毕赤酵母表达sTNFRII/Fc的Western blotting鉴定
纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白进行还原和非还原性10％SDS-PAGE后，蛋白质的SDS-PAGE方法为本领域所共知的(如D.R.马歇克等，《蛋白质纯化与鉴定实验指南》，科学出版社，1999)，再转移至硝酸纤维素膜，用羊抗人IgG-HRP检测，通过ECL显色。
Western blotting结果表明，还原的纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白中，在分子量66kD附近位置，有一特异性条带，比融合蛋白单体的理论分子量56kD稍大；在非还原纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白中该单体条带消失，而在分子量大于97kD处出现一特异性条带。
6.毕赤酵母表达融合蛋白sTNFRII/Fc抑制TNF-α细胞毒的活性分析
将生长良好的L929细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)用含10％胎牛血清的1640培养基稀释至2×10⁵个/ml，每孔加入100μL细胞悬液，放置于37℃、5％CO₂水汽饱和的细胞培养箱中培养24h。
用10％胎牛血清的1640培养基(含2μg/mL放线菌素D)稀释TNF-α(ProSciIncorporated，USA，XW-RP3118)至终浓度为50U/mL，然后在96孔板上依次进行融合蛋白sTNFRII/Fc的梯度稀释，起始为原液浓度的1/10，然后依次进行1/4稀释。吸弃96孔板中的细胞培养上清，将上述配制好的梯度融合蛋白sTNFRII/Fc转移至96孔板，继续培养24h，培养时间以阳性对照细胞基本死亡为准；每孔加入20μLMTT，在酶联免疫检测仪上570nm处测定各孔光吸收度值，记录结果。
MTT实验结果如图9所示，纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白能较好的抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用。
实施例4：抗体类似物sTNFRII-IgGFc在乳酸克鲁维酵母中的表达
1.血清白蛋白信号肽引导的sTNFRII-IgGFc表达载体的构建
以pPIC9-HTF及合成的片段HSA3AS为模板，用引物HSA5和C2重叠延伸PCR扩增带有HSA信号肽的sTNFRII-IgGFc基因。引物HSA5和C2的核苷酸序列如下：HSA5：
5’CGAAGCTTCAAACGATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGC-3’，划线部分为HindIII酶识别位点；C2：
5’ATGCCACCTGGGCGGGCAAGGCTCGACGAAACACACCCCTGGAATAAGCCGAGCTAAAGAGAAAAAG3’。用HindIII/EcoRI双酶切PCR扩增产物与同样双酶切的pKLAC1载体连接，构建带有HSA信号肽的sTNFRII-IgGFc表达载体pKLAC1-H-TNFR/Fc(简写为pKLAC1-HTF)(图12)。
以pPIC9-αTF为模板，PCR扩增带有XhoI酶切位点的sTNFRII-IgGFc基因，引物为a-factor-1(5’-ATACTCGAGAAAAGAGAAGTTCAATTGGTTGAATCTGG-3’，划线部分为XhoI酶切位点)和引物C2。
用XhoI和EcoRI双酶切PCR扩增产物与同样酶切的pKLAC1(New England BioLabs(NEB，Ipswich，MA)载体连接，构建带有LAC4启动子和α交配因子信号肽的sTNFRII-IgGFc表达载体pKLAC1-α-TNFR/Fc(简写为pKLAC1-αTF)。
2.表达抗体类似物sTNFRII/Fc的乳酸克鲁维酵母
制备乳酸克鲁维酵母ATCC8585的感受态细胞，将表达载体pKLAC1-HTF、pKLAC1-αTF和质粒pKLAC1(购自New England BioLabs(NEB，Ipswich，MA))以BstXI线性化后分别电转入乳酸克鲁维酵母ATCC8585的感受态细胞中，将电击后的菌液涂布于含有5mmol/L乙酰胺YCB琼脂培养基(1mol/L磷酸钠，1.17g/100mlYCB，2g/100ml琼脂，5mmol/L乙酰胺，其中YCB为酵母基本碳源培养基，以上均购自北京欣经科生物技术有限公司)平板上，30℃翻转培养3-4天，待培养基上长出克隆后，随机挑取几个转化子提取基因组DNA进行PCR鉴定阳性克隆，PCR鉴定引物分别为HSA1和C2(带有HSA信号肽的sTNFRII-IgGFc基因鉴定引物)；a-factor-1和C2(带有α交配因子信号肽的sTNFRII-IgGFc基因鉴定引物)，获得乳酸克鲁维酵母αTF、乳酸克鲁维酵母HTF和乳酸克鲁维酵母KLAC1(转pKLAC1载体的酵母)用无菌枪头分别刮取约2mm²的乳酸克鲁维酵母αTF、乳酸克鲁维酵母HTF和乳酸克鲁维酵母KLAC1细胞，分别置于2ml YPGal培养液(1g/100ml酵母提取物，2g/100ml蛋白胨，2g/100ml半乳糖)中重悬，30℃振荡培养(250-300rpm)，诱导72小时后离心取上清。
3.乳酸克鲁维酵母表达sTNFRII/Fc上清的纯化
乳酸克鲁维酵母αTF、乳酸克鲁维酵母HTF和乳酸克鲁维酵母KLAC1的上清调pH至7.0后，用HiTrap rProteinA FF亲合柱进行纯化：层析柱先用20mM pH7.0的磷酸钠缓冲液平衡，以1mL/min的流速上样，上样结束后，先用5倍柱体积的20mMpH7.0的磷酸钠缓冲液洗柱，然后再用0.1M柠檬酸溶液(pH3.0)进行洗脱，洗脱液pH值用1M Tris-HCl(pH9.0)调至中性纯化后的蛋白浓度采用Bradford蛋白定量试剂盒进行测定，纯化后的的蛋白即为sTNFRII-IgGFc融合蛋白，乳酸克鲁维酵母HTF上清中sTNFRII-IgGFc融合蛋白浓度为16mg/mL上清，乳酸克鲁维酵母αTF上清中sTNFRII-IgGFc融合蛋白浓度为2mg/mL。
经Protein A亲和柱再一次纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白进行10％SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色结果如图13所示，从蛋白条带的位置来看，还原的融合蛋白大小在66kD与80kD之间。
图13中，1：还原电泳；M：蛋白分子量标准。
4.乳酸克鲁维酵母HTF表达的sTNFRII/Fc的Western blotting鉴定
纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白进行还原和非还原性10％SDS-PAGE后，蛋白质的SDS-PAGE方法为本领域所共知的(如D.R.马歇克等，《蛋白质纯化与鉴定实验指南》，科学出版社，1999)，再转移至硝酸纤维素膜，用羊抗人IgG-HRP检测，通过ECL显色。
Western blotting结果表明，还原的纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白中，在分子量66kD附近位置，有一特异性条带，比融合蛋白单体的理论分子量56kD稍大；在非还原纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白中该单体条带消失，而在分子量大于97kD处出现一特异性条带。
5.乳酸克鲁维酵母表达融合蛋白sTNFRII/Fc抑制TNF-α细胞毒的活性分析
将生长良好的L929细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)用含10％胎牛血清的1640培养基稀释至2×10⁵个/ml，每孔加入100μL细胞悬液，放置于37℃、5％CO₂水汽饱和的细胞培养箱中培养24h。
用10％胎牛血清的1640培养基(含2μg/mL放线菌素D)稀释TNF-α(ProSciIncorporated，USA，XW-RP3118)至终浓度为50U/mL，然后在96孔板上依次进行融合蛋白sTNFRII/Fc的梯度稀释，起始为原液浓度的1/10，然后依次进行1/4稀释。吸弃96孔板中的细胞培养上清，将上述配制好的梯度融合蛋白sTNFRII/Fc转移至96孔板，继续培养24h，培养时间以阳性对照细胞基本死亡为准；每孔加入20μLMTT，在酶联免疫检测仪上570nm处测定各孔光吸收度值，记录结果。
MTT实验结果如图14所示，纯化后的sTNFRII-IgGFc融合蛋白能较好的抑制TNF-α对L929细胞的杀伤作用。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
<120>表达抗体或抗体类似物的重组酵母菌及其构建方法与应用
<160>1
<210>1
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>1
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1               5                   10                  15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg
        20
<210>2
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>2
atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt    60
gtgtttcgtc ga                                                        72
<210>3
<211>645
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>3
gacattcaaa tgactcaatc tccatcttct ttgtctgctt ctgttggtga cagagttact    60
attacttgta gagcttctca agacgttaac actgctgttg cttggtacca acaaaagcca    120
ggtaaggctc caaagttgtt gatttactct gcttctttct tgtactctgg tgttccatct    180
agattctctg gttctagatc tggtactgac ttcactttga ctatttcttc tttgcaacca    240
gaggacttcg ctacttacta ctgtcaacaa cactacacta ctccaccaac tttcggtcaa    300
ggtactaagg ttgagattaa gagaactgtt gctgctccat ctgttttcat tttcccacca    360
tctgacgagc aattgaagtc tggtactgct tctgttgttt gtttgttgaa caacttctac    420
ccaagagagg ctaaggttca atggaaggtt gacaacgctt tgcaatctgg taactctcaa    480
gagtctgtta ctgagcaaga ctctaaggac tctacttact ctttgtcttc tactttgact    540
ttgtctaagg ctgactacga gaagcacaag gtttacgctt gtgaggttac tcaccaaggt    600
ttgtcttctc cagttactaa gtctttcaac agaggtgagt gttaa                    645
<210>4
<211>1353
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>4
gaagttcaat tggttgaatc tggtggtggt ttggttcaac caggtggttc tttgagattg    60
tcttgtgctg cttctggttt caacattaag gacacttaca ttcactgggt tagacaagct    120
ccaggtaagg gtttggaatg ggttgctaga atttacccaa ctaacggtta cactagatac    180
gctgactctg ttaagggtag attcactatt tctgctgaca cttctaagaa cactgcttac    240
ttgcaaatga actctttgag agctgaagac actgctgttt actactgttc tagatggggt    300
ggtgacggtt tctacgctat ggactactgg ggtcaaggta ctttggttac tgtttcttct    360
gcttctacta agggtccatc tgttttccca ttggctccat cttctaagtc tacttctggt    420
ggtactgctg ctttgggttg tttggttaag gactacttcc cagaaccagt tactgtttct    480
tggaactctg gtgctttgac ttctggtgtt cacactttcc cagctgtttt gcaatcttct    540
ggtttgtact ctttgtcttc tgttgttact gttccatctt cttctttggg tactcaaact    600
tacatttgta acgttaacca caagccatct aacactaagg ttgacaagaa ggttgaacca    660
aagtcttgtg acaagactca cacttgtcca ccatgtccag ctccagaatt gttgggtggt    720
ccatctgttt tcttgttccc accaaagcca aaggacactt tgatgatttc tagaactcca    780
gaagttactt gtgttgttgt tgacgtttct cacgaagacc cagaagttaa gttcaactgg    840
tacgttgacg gtgttgaagt tcacaacgct aagactaagc caagagaaga acaatacaac    900
tctacttaca gagttgtttc tgttttgact gttttgcacc aagactggtt gaacggtaag    960
gaatacaagt gtaaggtttc taacaaggct ttgccagctc caattgaaaa gactatttct    1020
aaggctaagg gtcaaccaag agaaccacaa gtttacactt tgccaccatc tagagacgaa    1080
ttgactaaga accaagtttc tttgacttgt ttggttaagg gtttctaccc atctgacatt    1140
gctgttgaat gggaatctaa cggtcaacca gaaaacaact acaagactac tccaccagtt    1200
ttggactctg acggttcttt cttcttgtac tctaagttga ctgttgacaa gtctagatgg    1260
caacaaggta acgttttctc ttgttctgtt atgcacgaag ctttgcacaa ccactacact    1320
caaaagtctt tgtctttgtc tccaggtaag taa                                 1353
<210>5
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>5
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Leu Leu Phe Ser Ser Ala
1               5                   10                  15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg
            20
<210>6
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>6
Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Val Ser Gly Ser Ala
1               5                   10                  15
Phe Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg
            20
<210>7
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<230>
<400>7
Met Lys Trp Ile Thr Leu Ile Cys Leu Leu Ile Ser Ser Ser Phe Ile
1               5                   10                  15
Glu Ser Arg Ile Leu Phe Lys Arg
            20