一种儿童逆商基因检测评估试剂盒 【技术领域】
本发明涉及一种易感基因检测产品，具体的说，涉及一种有关儿童逆商基因检测评估的试剂盒。
背景技术
除了智商、情商外，近年来又流行一个新概念：挫折商(逆商)。每个人在生活中都不同程度地受到挫折，人们在受挫折后恢复的能力却各不相同，有些人弹性实足，有些人受挫后一蹶不振，而大多数人则介于两者之间。保罗.斯托茨在20世纪90年代中期率先提出了“逆境商数”(Adversity Quotient，缩写为“AQ”)，用于衡量一个人应对挫折、逆境的能力。
俗语说：不如意事常八九。人生前进的路没有一帆风顺的，而一个人在逆境中的表现往往决定了个体的人生走向。从个体角度看，有相似智商、情商和教育背景的同学，数年之后，成功的程度往往会有天壤之别。究其原因，排除机遇的因素，往往取决于一个人逆商的高低。
智商、情商、逆商这三个心商的主要组成要素相互影响、相互作用，共同决定了一个人的成功与否。人们认为在生活中这三者的作用是这样分配的：能使一个人被企业录用的往往是智商，而真正能使他在职业道路发展构成中得到晋升的往往是情商，而面对逆境使他/她披荆斩棘，勇往直前，最终达到目标的却靠的是逆商。
目前人们对逆商的测试主要是心理测试。保罗·史托兹教授将逆商划分为四个部分，用来测量每个人面对逆境时的应变和适应能力的大小。即：
一、控制感
表现为一个人认为能否改善这种情况？认为自身有多少控制力？
在面对逆境时，AQ较高的人比AQ较低的人认为自己能表现出更多的控制力和影响力，即使当情况显得无法抵抗，或者超出他们的控制范围时，拥有较高AQ的人总是能够找到一些他们能够控制的方面。而AQ较低的人则倾向于作出很少或根本无法控制的反应，然后放弃。
二、起因和责任归属
表现为一个人认为自己应为改善这种状况承担多少责任？
自身在多大程度上起到了使状况变好的作用？
承担责任是行事的关键部分。具有较高AQ的人会主动负责处理事务，而不管这件事是否和他们有关。相反，AQ较低的人会避开承担责任，并常常感到无奈和受伤害。
三、影响范围
这种境况是否会影响到个体的生活或工作的的其他领域？
所处的逆境会在多大程度上波及其他事情？
有效解决问题的基本条件之一是把逆境控制在一定的范围之内。具有较高AQ的人将挫折和挑战控制在一定范围之内，不让它们干扰到自己工作、生活的其他领域。而AQ较低的人则倾向于将逆境认定为灾难性的失败，并将这种挫折迁移至其他无关领域，构成破坏。
四、持续时间
个体认为逆境会持续多久？
能够超越当前的困难看待问题是维持希望的一项重要能力。具有较高AQ的人拥有不可思议的能力，既能够留心过去的接踵而至的困难，又能够拥有希望、保持乐观。而AQ较低的人则认为逆境会无休止的延续下去，即便事实并非如此。
通过对上述四个方面的进行设计测试，心理医生会大致得出一个人的逆商值。
现在人们发现影响逆商的因素主要有两个方面：先天的遗传因素和后天的环境因素。从后天环境因素的影响来讲，对一个人逆商的培养是累积和持续的。并且象很多技能一样，从小培养会起到事半功倍的效果。
另外最新的生物学研究已经发现数个可能与逆商有关的基因，这些基因构成了个人逆商的先天因素。其中比较明确且重要的一个基因是NPY基因。该基因编码的蛋白NPY是一类重要的神经肽，有神经递质及神经调节剂作用，是参与抗压地一类重要物质。NPY能作用于心脑血管系统，且能增强其它内源性血管物质及抑制舒血管物质的效应。其含量与应激反应程度有关，且直接关系到机体抵抗外部压力程度。如果该基因发生突变，会影响到个人的逆商天赋。对有基因缺陷的人而言，早期发现和积极培训对他的一生尤其重要。
尽管逆商对于一个人的发展很重要，但目前而言，人们很少做这方面的测试。一方面心理测试在我国的推广度偏低。除非在孩子性格出现极端问题之后，或者在企业招聘需要测试时才会有进行针对逆商的测试。另外，心理学测试一方面对测试者要求高，另一方面对被测者的配合程度，精神状态有严格要求，否则容易得出错误结论。即心理测试的准确性受外界环境影响较大。孩童的心智尚未发育成熟，做这类测试是不可靠的。
在目前社会普遍注重早教，甚至胎教的情况下，提供一种简便而客观的方法，进行儿童先天逆商遗传学特性的测试是顺应潮流，很有必要的。
【发明内容】
为了可以简便而客观地对儿童逆商进行测试，本发明提供一种儿童逆商基因检测评估试剂盒，可以以儿童DNA样本为测试样本，对儿童逆商的基因进行检测，从而简便快捷地测试其逆商遗传特性。
该试剂盒由DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品组成。使用时以被测儿童的DNA样本为检测对象，经过样本DNA抽提后，使用试剂盒在荧光定量PCR仪上进行反应，结合反应结果进行诊断。
上述的预混PCR反应液含有SYBR green I，以及与儿童逆商相关的NPY基因突变位点的扩增引物；扩增NPY基因的引物为正常型的上游引物和包含突变位点下游引物，序列如下：
上游引物F 5-GAT AGG AGC AGC CCA GAC GA-3 20bp，
下游引物RT 5-ACT CCG GCA CCC AGT GTG T-3 19bp，
下游引物RC 5-TCC GGC ACC CAG TGT GC-3 17bp。
上述的儿童逆商基因检测评估试剂盒，所述的阳性对照品有2个，分别包含如下的序列：
SEQ1：
GGATTCAGGT GCTTCCTACT CCGGCACCCA GTGGGTTGGT AGTCCTGTTG
GCAGGAGACA AGAATCGTCT GGGCTGCTCC TATCTCTGGC AGGACTAGAC
GGGGCG，
SEQ2：
GGATTCAGGT GCTTCCTACT CCGGCACCCA GTGGGCTGGT AGTCCTGTTG
GCAGGAGACA AGAATCGTCT GGGCTGCTCC TATCTCTGGC AGGACTAGAC
GGGGCG。
上述的儿童逆商基因检测评估试剂盒，所述的阴性对照品包含的序列为：
SEQ3：
TTCGTTATTG AATCTTGTTT TGGTTCTCTT GTGTGGAATG CATTGTTCTT
GCTTCTCTGG AACTTGGGAT ATGATGACAA AAATACGATA TCTCTAAGGC
TAATTGCTGT GCGGATGAAA TATATTTGCA CGTCAGTCTG ATCCCATTAT
GTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC。
本发明的使用方便快捷，不需要儿童本人到场，只需取其DNA样本，比如口腔样本，更有效保护对方隐私。不用问答形式，减少人为因素对诊断结果的影响。可以对儿童逆商遗传特性进行简便而客观地检测，便于推广应用，有助于在儿童发育早期辅助判断其逆商基因的遗传特性。
【附图说明】
图1，图2，图3，图4，图5，图6为荧光定量PCR仪上的扩增曲线图。各图上方的DeltaRnvs Cycle，是指ΔRn随循环变化的对数扩增图谱；ΔRn(Delta Rn)是指在给定的一组PCR条件下所生成荧光信号的对数值。该图的横坐标表示循环数(Cycle Number)，纵坐标表示荧光值(Delta Rn)。横线表示荧光域值，曲线与荧光域值线的交叉点所对应的循环数即为Ct值。
图1、图2、图3中横线3表示荧光域值；曲线1表示为扩增NPY基因的引物对F+RT，扩增样本所生成的扩增曲线；曲线2为扩增NPY基因的引物对F+RC，这对引物扩增样本所生成的扩增曲线。
图1表示NPY基因TT纯合型样本的产物扩增曲线图：曲线1与荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环数值为C1，曲线2与荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环数值为C2。
图2表示NPY基因TC杂合型样本的产物扩增曲线图：曲线1与荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环数值为C3，曲线2与荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环数值为C4。
图3表示NPY基因CC纯合型样本的产物扩增曲线图：曲线2与荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环数值为C5，曲线1与荧光域值线的交叉点表示达到域值的Ct循环数值为C6。
具体实施例：
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1：
试剂盒的制备。包括(1)探针的准备；(2)DNA抽提试剂；(3)预混反应液；(4)标准阳性对照；(5)标准阴性对照。
(1)探针的准备；
由通常的核苷酸引物合成仪合成。序列如下：
上游引物F 5-GAT AGG AGC AGC CCA GAC GA-3 20bp，
下游引物RT 5-ACT CCG GCA CCC AGT GTG T-3 19bp，
下游引物RC 5-TCC GGC ACC CAG TGT GC-3 17bp。
使用前按每OD引物稀释为100μmol/L(即100pmol/μl)浓度的加水量，开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟的转速下离心1分钟，防止开盖时引物散失。使用前，将浓溶液稀释成工作液10pmol/ml后进行实验。
(2)DNA抽提试剂：
(3)预混PCR反应液
预混反应液包括2种，每种内含一对上下游扩增引物，各对应一个基因型。按1ml配比量计算，共同的成分配制为：100μM的dNTP，20μl；500U/μl Taq DNA Polymerase20μl；2×Quant One Step SYBR 1300μl；10μM的上游引物50μl；10μM的下游引物50μl；RNase-free ddH2O 860μl。
管1的1对引物为：
上游引物F 5-GAT AGG AGC AGC CCA GAC GA-3 20bp，
下游引物RT 5-ACT CCG GCA CCC AGT GTG T-3 19bp。
管2的1对引物为：
上游引物F 5-GAT AGG AGC AGC CCA GAC GA-3 20bp，
下游引物RC 5-TCC GGC ACC CAG TGT GC-3 17bp。
(4)标准阳性对照：
标准阳性模板是含有COMT和MCPH1基因中含突变核苷酸片段构成的Puc18-T重组质粒，该重组质料转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释到109Copy/μl，-20℃保存。贮存存为109Copy/μl，使用浓度为105Copy/μl。
标准阳性模板提供2种，每种浓度为105Copy/μl。序列如下：
SEQ1：
GGATTCAGGT GCTTCCTACT CCGGCACCCA GTGGGTTGGT AGTCCTGTTG
GCAGGAGACA AGAATCGTCT GGGCTGCTCC TATCTCTGGC AGGACTAGAC
GGGGCG，
SEQ2：
GGATTCAGGT GCTTCCTACT CCGGCACCCA GTGGGCTGGT AGTCCTGTTG
GCAGGAGACA AGAATCGTCT GGGCTGCTCC TATCTCTGGC AGGACTAGAC
GGGGCG。
(5)标准阴性对照：
标准阴性模板是含有拟南芥基因片断180个核苷酸构成的Puc18-T重组质粒。该重组质料转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释到109Copy/μl，-20℃保存。贮存存为109Copy/μl，使用浓度为105Copy/μl。序列如下：
SEQ3：
TTCGTTATTG AATCTTGTTT TGGTTCTCTT GTGTGGAATG CATTGTTCTT
GCTTCTCTGG AACTTGGGAT ATGATGACAA AAATACGATA TCTCTAAGGC
TAATTGCTGT GCGGATGAAA TATATTTGCA CGTCAGTCTG ATCCCATTAT
GTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC。
实施例2：试剂盒的使用
(1)样本的制备
取样方式：使用棉签在面颊内擦拭10次。
注意：为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前30分钟内请勿进食和饮水。
a)处理材料：将在面颊内擦拭过的棉签转置于2ml离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆上剪下，加入400μl缓冲液GA。
b)加入20μl蛋白酶K溶液，涡旋10秒混匀，56℃放置60分钟，其间每15分钟涡旋混匀数次。
c)加入400μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，此时溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
d)加200μl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
e)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR中(吸附柱CR放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。
f)向吸附柱CR中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。
g)向吸附柱CR中加入700μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管。
h)向吸附柱CR中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液。
i)将吸附柱CR放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CR室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗。
j)将吸附柱CR转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟。重复一次。
(2)实验过程
a)按样品数n(样品数＝待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个)取预混PCR反应液每管23μl分装于反应管中。
b)将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照(务必振荡混匀数秒)各取2ul分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，立即进行PCR扩增反应。
c)PCR条件
95℃10sec
(95℃15sec，60℃60sec)×40个循环
(3)结果分析与判断：
a)定量检测SNP的判断标准：
两曲线的Ct值之差的绝对值记为|ΔCt|，当|ΔCt|≤1，判断为杂合型；当|ΔCt|≥5，判断为纯合型。
如图，图1中|ΔCt|≥5，表示该样本为NPY基因TT纯合型样本。图2中，|ΔCt|≤1，表示该样本为NPY基因TC杂合型样本。图3中，|ΔCt|≥5，表示该样本为NPY基因CC纯合型样本。
b)结果分析：
【序列表】
<110>上海裕隆生物科技有限公司
<120>一种儿童逆商基因检测评估试剂盒
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童逆商基因检测评估试剂盒中检测NPY基因序列相关突变的DNA引物，命名为上游引物F。
<400>1
gataggagca gcccagacga 20
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童逆商基因检测评估试剂盒中检测NPY基因序列相关突变的DNA引物，命名为下游引物RT。
<400>2
actccggcac ccagtgtgt 19
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童逆商基因检测评估试剂盒中检测NPY基因序列相关突变的DNA引物，命名为下游引物RC。
<400>3
tccggcaccc agtgtgc 17
<210>4
<211>106
<212>DNA
<213>人属(Homo)
<400>4
ggattcaggt gcttcctact ccggcaccca gtgggttggt agtcctgttg gcaggagaca 60
agaatcgtct gggctgctcc tatctctggc aggactagac ggggcg 106
<210>5
<211>106
<212>DNA
<213>人属(Homo)
<400>5
ggattcaggt gcttcctact ccggcaccca gtgggctggt agtcctgttg gcaggagaca 60
agaatcgtct gggctgctcc tatctctggc aggactagac ggggcg 106
<210>6
<211>180
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>6
ttcgttattg aatcttgttt tggttctctt gtgtggaatg cattgttctt gcttctctgg 60
aacttgggat atgatgacaa aaatacgata tctctaaggc taattgctgt gcggatgaaa 120
tatatttgca cgtcagtctg atcccattat gtatataaca ttaggagttg gtgcatgctc 180