一种生物转化二醇型人参皂甙Rb1的方法 技术领域本发明涉及一种利用真菌发酵转化人参皂甙的方法，属于生物制药领域。
背景技术 人参是中国名贵中药。人参皂甙是人参重要地活性成分，具有多种生物活性。Rb1、Rd、Rg3均属于人参皂甙。Rb1的含量最多，其次是Rd，Rg3的含量最少。Rg3具有多种药理作用：预防和治疗癌症，改善心脏血管功能，抗血小板凝集，保护脑神经细胞，提高集体免疫力，抗疲劳，抗血栓，保肝，降低胆固醇，且无依赖性，对正常组织无毒性；尤其是明显的抑制肿瘤复发和转移的功能，使其成为许多国家研究的热点。利用生物转化可以将Rb1转化成Rd或者Rg3。
发明内容 本发明提供一种利用真菌将含量高的人参皂甙Rb1转化为含量低、药效高的人参皂甙Rd或者Rg3的方法。
本发明的技术解决方案是：利用番茄叶霉(Cladosporium fulvum)高效转化Rb成Rd或者Rg3。包括以下步骤：
a)活化菌种：无菌操作接种于V-8汁固体培养基、90cm培养皿，25℃恒温暗培养5-10天；
b)刮取孢子：无菌条件下，刮下平板上的菌丝和孢子，用无菌水冲洗平板若干次，将菌丝及孢子全部转移到无菌水中。向含有菌丝及孢子的无菌水中加入玻璃珠，室温振荡1-2h，使孢子充分分散。四层纱布过滤，滤液离心，弃去上清，得到孢子(沉淀)；
c)液体培养：将孢子加入到V-8液体培养基(不含琼脂)中，28℃、150r/min恒温振荡培养；
d)滤取新生菌丝：将液体培养48h-72h的孢子悬液用四层纱布过滤，得到新生菌丝；
e)生物转化：将新生菌丝加入到含有人参皂甙的醋酸缓冲液中，28℃恒温振荡培养。每隔24小时取出1组转化液离心，弃去菌体，取上清液加水饱和正丁醇终止反应，TLC检测。
f)回收皂甙：用正丁醇终止反应，同时皂甙产物被萃取至有机层中。将有机层水浴蒸干，然后用乙睛(乙睛∶水＝35∶65)溶解，进行柱层析分离制备稀有人参皂甙纯品。
【具体实施方式】
1.活化菌种：无菌操作接种于V-8汁固体培养基，25℃恒温暗培养5-10天。
2.刮取孢子：无菌条件下，刮下平板上的菌丝和孢子，用无菌水冲洗平板若干次，将菌丝及孢子全部转移到无菌水中。向含有菌丝及孢子的无菌水中加入玻璃珠，室温振荡1-2h，200rpm，使孢子充分分散。
3.液体培养：四层纱布过滤培养液，滤液离心，弃去上清，得到孢子；将孢子加入到200mL的V-8液体培养基中，稀释调整浓度为5×106个/ml，28℃、150rpm恒温振荡培养。
4.扩大培养：将液体培养48h-72h的孢子悬液用四层纱布过滤，得到新生菌丝。
5.生物转化：将新生菌丝加入到400ml醋酸缓冲液(0.2M，pH 5)中，调整其浓度为5×106个/ml，加入人参皂甙Rb1，终浓度为0.25mg/ml，，28℃恒温振荡培养8天。
6.回收皂甙：离心，6000rpm，20min，取上清液，按正丁醇与培养液体积比1∶2的比例，加水饱和正丁醇，皂甙产物被萃取至有机层中。重复三次，合并有机液。将有机层水浴蒸干，然后用乙睛(乙睛∶水＝35∶65)溶解，进行HPLC分离制备稀有人参皂甙纯品，得到人参皂甙Rd 68mg。