在基因转换的原核细胞中生物合成蛋白质，得到具有连在氨基末端的一个N-甲酰基-蛋氨酸的蛋白质表达。因为N-甲酰基-蛋氨酸加到天然蛋白质上，可以改变其生物活性，结构稳定性，抗原性等等，所以，若有可能，最好是除去它。 通过在氨基末端蛋氨酸和所要得到的天然肽之间引入一个断裂位置，从而得到所需要的天然肽产物，这从理论上讲，可供选择的方法是灵活多样的。但是事实上，要得到有选择的断裂的可行方法却是非常有限的。
例如，对于不含蛋氨酸的那些天然蛋白质，引起产生断裂（蛋氨酸是选择的断裂位置）的溴化氰，已经证明是产生天然蛋白质的有效方法。但是在事实上，在中等大小的肽和蛋白质中，不含蛋氨酸的情况是十分罕见的。因此，一个最重要的任务是去发现一种方法，可以断开氨基末端的蛋氨酸，制备天然的生物合成的蛋白质。
确定任何从氨基末端蛋氨酰蛋白质产生天然蛋白质的方法的一个关键和意想不到的发现是，生物合成的表达产物的α-氨基，例如Nα-蛋氨酰-（人类生长激素），不被甲酰化。这个事实首先是通过用氰酸盐对表达产物进行化学改造才发现的，后来又为自动埃德曼（Edman）序列分析所证实。虽然不会断裂起始的蛋氨酸，但是可以假定由于酶的作用，E.Coli表达的有机体却可有效地去除Nα-甲酰基。因此，氨基末端蛋氨酸表达产物的α-氨基可以（至少是可能）直接用于断裂。
在氨基末端蛋氨酰表达产物上有一个游离的α-氨基，导致了除去蛋氨酰的其它方法的可能性。一种方法是使用异硫氰酸苯酯进行有选择的埃德曼型氨基末端顺序断裂，实际应用中要求在天然蛋白质中不含有赖氨酸残基。但是，只有极少数蛋白质中没有赖氨酸。
另外可能的方法是用肽链端解酶，原则上，这样能够分段将氨基酸断开。但是，由于种种理由，包括它们的非均匀性，价格高昂，对变性作用的敏感性，更为重要的是它们对不同基质的特征的和非特征的作用有很大差别，所以在合成研究中，很少见到成功使用肽链端解酶的报道。
已经发现了一种新方法，这种方法代表新的化学方法，同时提供新的化合物，以用于进行有选择的氨基末端断裂，从而产生所需的最终肽产物。本发明指的正是这一方法和具有上述用途的化合物。
因此，本发明涉及具有下列结构式的一类化合物。
H-X-脯-肽
此处，X是一种天然存在的氨基酸残基;肽是指一个有确定生物活性的肽或蛋白质的氨基酸残基链。
本发明提供一种方法，从而可由如下结构式的化合物生产一种具有氨基酸链的化合物，该氨基酸链表示一种具有生物活性的肽或蛋白质，
H-X-脯-肽
其中，X是一种天然存在的氨基酸残基，肽是指有确定生物活性的肽或蛋白质的氨基酸链。在第一种实施方案中，方法包括使H-X-脯-肽在一种质子惰性溶剂中，经受弱酸条件处理。在第二种实施方案中，H-X-脯-肽在含水缓冲溶液介质中，经受酸性，中性或碱性条件处理。无论在哪一种实施方案中，伴随断裂，H-X-脯-部分形成二酮哌嗪，同时释放出肽。
已经发现的、能提供本发明的物质的方法包括为生产下式化合物设计的生物合成过程，
H-X-脯-肽
其中，X和肽的意义规定如上。化合物能够用现在通用的重组DNA技术制备，同时能够作为直接表达产物或作为一种前身表达产物的处理结果而间接得到。
为了得到所需要的，但尚不能用重组DNA方法直接制备的、术语“肽”所特指的化合物，此时化合物H-X-脯-肽是非常有用的。根据本发明的方法处理化合物H-X-脯-肽时，通过形成中间体二酮哌嗪，而得到所需产物（肽）。在质子惰性溶剂中的断裂过程：通常用下列顺序来描述：
如前所述，基团γ是天然存在的氨基酸侧链。
在H-X-脯-肽中，基团X表示任何天然存在的氨基酸的一个残基。但是，X代表的氨基酸残基最好不是脯氨酸，因为脯-脯顺序只能很慢地形成断裂过程所需的二酮哌嗪中间体。最常见的是用重组DNA方法产生H-X-脯-肽。当化合物直接作为表达产物产生时，基团X将是蛋氨酰;因此，本发明所指的X最好是蛋氨酰。但是，当基团X不是蛋氨酰时，化合物的来源也可以是生物合成的。但是，表达产物将首先被一种能产生H-X-脯-肽的方法处理。
这里的“脯”项指的是天然存在的氨基酸脯氨酸的氨基酸残基。
表示“肽”的基团指的是氨基酸残基链，代表任一种具有生物活性的肽和蛋白质，包括：例如，胰岛素原，人类生长激素，牛生长激素，α-干扰素，β-干扰素，γ-干扰素，联白细胞素-1，联白细胞素-2，生长激素释放因子，类胰岛素生长因子，组织血纤维蛋白溶酶原激活剂，蛋白质C等，以及已知生物活性的肽和蛋白质的改进形式。
H-X-脯-肽的实例有：
蛋-脯-（人类生长激素）;
丙-脯-（α-干扰素）;
蛋-脯-（联白细胞素-2）;
蛋-脯-（γ-干扰素）;
蛋-脯-（牛生长激素）;
蛋-脯-（组织血纤维蛋白溶酶原激活剂）;
丝-脯-（人类生长激素）;
天门冬-脯-（人类生长激素）;
蛋-脯-（生长激素释放因子）;
蛋-脯-（蛋白质C）;
亮-脯-（类胰岛素生长因子）;
等等。
以上述为例的化合物，已经把两种确定了的氨基酸残基结构加到所需要的最终产物肽上，使生成其他无用的有生物活性的多肽和蛋白质。在氨基末端有一个由天然氨基酸残基及其后连接脯氨酸组成的二肽化合物，整理该化合物，使其中二肽易于断裂，并生成所需要的最终产物。倒数第二位的脯氨酸在氨基末端的二肽产生顺式-构型，同时将最终α-氨基固定在一个更有利的位置上以进攻脯氨酸的羰基〔见Gisin，B.F.，和Merrifield，R.B.，J.Am.Chem.Soc.24卷，3102-3106页（1972）〕。形成很有利的环状氨基酸一脯氨酸二酮哌嗪，同时以离去基团的形式，释出所需要的肽，在这一点上进行亲核进攻是有利的。在质子惰性溶剂中，反应的基本特征是被弱酸催化。本发明的方法具体可行性的关键和不能预先回答的问题，是要得到的最终产物的氨基末端残基是否能够并将作为一个合适的离去基团，以便在期望的最终产物能够稳定又可溶解的条件下离去，并形成二酮哌嗪。虽然已经发表了大量合成固相肽的文献，但是似乎关于二酮哌嗪的形成尚只报道过合成二肽基阶段，在这一阶段，水解是在功能树脂酯键上进行的。
和酯类比较，酰胺的酸稳定性增加，这一原则已被普遍接受，所以，没有报道过在X-脯链上形成二酮哌嗪（这需要酰胺水解），这是不足为怪的。这种沉默强有力地表明本发明的方法可能成功。
根据本发明方法的第一种形式，H-X-脯-肽化合物反应是在质子惰性溶剂（最好不含水）中进行的。总之，只有避免任何肯定的加水才能合乎反应条件。质子惰性溶剂的实例有：1-甲基吡咯烷酮（NMP），N，N-二甲基甲酰胺（DMF），二甲基亚砜（DMSO），甲酰胺，六甲基磷酰胺（HMPA）等等。较好的是NMP，DMF和DMSO，其中以NMP为最好。
在质子惰性溶剂中的反应，在弱酸条件下进行，使用乙酸、磷酸、亚磷酸、硫酸、三氟乙酸、甲酸，顺丁烯二酸，酒石酸、甘氨酸等。最为适宜的是乙酸。
断裂反应也能在缓冲溶液水介质中进行。当水作为反应介质时，反应最好在磷酸盐缓冲液中进行。
当反应在质子惰性溶剂中进行时，本发明的方法一般在大约15℃到50℃的温度范围内进行，最好从约25℃到大约40℃之间。酸的浓度通常在大约0.1M到大约1M之间，更好是在大约0.25M到约0.5M，最好为约0.30M到约0.35M，尤其以大约0.33M为佳。
当在水介质中进行时，温度需要稍高一点。例如一般反应温度范围是从大约25℃到大约60℃，更为合适的是从大约35℃到大约50℃。温度的选择是根据“肽”的稳定性和H-X-脯-肽中第三个氨基酸的性质确定的。若稳定性和第三个氨基酸残基的性质允许的话，尽量提高温度是适宜的。缓冲液的浓度一般从大约0.1M到大约2M，从约0.5M到约1M更好，最好是从大约0.8M到大约1M。最适宜的缓冲剂盐类是用磷酸盐。以PH值约为8最适宜，因为在更高的PH值时，断裂反应的收率提高很少，而不需要的副反应增加很多〔见Mckerrow，J.H.，和Robinson，A.B.，AnalyticalBiochem.42卷，565-568页（1972）〕。
断裂反应进行中，定时监测二酮哌嗪的形成。当认为适宜时终止反应，同时使用已知的分离方法，从反应混合物中回收断裂产物。
以下提供说明本发明的例子。这些实例不是试图限制本发明的广宽范围。
本发明选用的典型肽类是由固相合成方法制备的。其纯度用高效液相色谱分析证实。断裂反应之前，该肽类以无定形冻干的固体形式贮存。改变了一些实验参数，并报告了它们对断裂的影响。
下面分别叙述使用有机介质和水介质的最优条件，并应用于肽（蛋-脯-甘-甘-NH2）的反应，其中“-NH2”表示肽的C-末端有一个酰胺碎片。
A.有机相断裂反应条件
将10毫克蛋-脯-甘-甘-NH2溶于在4分子筛上干燥脱水一星期的1毫升N-甲基吡咯烷酮中。将混合物在25℃下不断搅拌，加入冰乙酸（HOAC）至浓度为0.33M使反应开始。用反相色谱分析测量蛋氨酰-脯氨酸二酮哌嗪形成和反应物肽的消失来监测断裂速度。色谱分析用0.46×25厘米的Ultrosphere C18柱，在0.1%三氟乙酸中，用乙腈进行梯度洗脱，在每次分析时，用0.1%三氟乙酸稀释10倍，使反应停止。收集二酮哌嗪，并用氨基酸和质谱分析来确证。
表1-8列出有机断裂条件下，改变选择的参数时，得到的结果。
表1列出在DMF中25℃进行断裂反应时，当改变酸浓度时，二酮哌嗪生成的数量。记录了可估价的反应速度，观察到依赖于弱酸浓度。在DMSO中，用相似的弱酸处理，则断裂速度降低。在DMSO中提高断裂反应温度到40℃，和在DMF中25℃进行的反应速度相类似，结果列于表2。
表1
酸浓度
（从蛋-脯-甘-甘-NH2在2-5℃生成
蛋氨酸-脯氨酸 二酮哌嗪）
试剂 反应时间（小时）
2 4 6
10 M HOAc/DMF 2% 8% 40%
1 M HOAc/DMF 26% 44% 55%
0.1 M HOAc/DMF 13% 28% 34%
0.01 M HOAc/DMF 3% 6% 8%
100% DMF 0% 3% 4%
100% HOAc ＜1% ＜1% 2%
100% TFA 0% ＜1% ＜1%
表2
酸浓度
（从蛋-脯-甘-甘-NH2于40℃形成
蛋氨酸-脯氨酸 二酮哌嗪）
反应时间（小时）
试剂 2 4 24
0.1 M HOAc/DMSO 25% 45% 95%
0.33 M HOAc/DMSO 38% 61% 100%
1.0 M HOAc/DMSO 27% 44% 94%
3.3 M HOAc/DMSO 7% 12% 41%
10.0 M HOAc/DMSO 2% 4% 14%
如前所述，最适宜的酸浓度是大约0.25M到大约0.5M。
表3列出了温度对一系列肽的影响的研究结果，这些肽的区别只是第三个残基的侧链不同。十分清楚，在这个位置上增加位阻现象，将减慢反应速度。但是在各种情况下，都明显发生断裂。
表3
温度效应
（在两种温度下，1M乙酸/DMF中
蛋氨酸-脯氨酸 二酮哌嗪的形成）
反应时间（小时） 反应时间（小时）
在25℃ 在40℃
肽b2 24 2 24
MPGG-NH227% 100% 76% 100%
MPTG-NH2N.D.aN.D. 22% 88%
MPPG-NH2N.D. N.D. 20% 95%
MPFG-NH22% 17% 10% 68%
a N.D.，没有测定
b MPGG-NH2＝蛋-脯-甘-甘-NH2
MPTG-NH2＝蛋-脯-苏-甘-NH2
MPPG-NH2＝蛋-脯-脯-甘-NH2
MPFG-NH2＝蛋-脯-苯丙-甘-NH2
重要的因素是选取质子惰性溶剂。溶剂必须是一种促进或至少不抑制伴随断裂反应生成二酮哌嗪，以生成需要的最终产物，并同时对最终肽产物只有最少的降解作用。表4-8列出了在有机断裂条件下，改变溶剂性质得到的结果。
表4提供了在进行有机断裂条件下，几种蛋白质和肽类的稳定性资料。列出了用反相高效液相色谱（HPLC）测得的百分含量，即在某一限定的反应介质中，在指定的时间（小时）内，处理所选择的蛋白质或肽，其剩余量列于表中，并表明DMF和DMSO相比，DMSO相对要好一些。
表4
蛋白质的稳定性 （h＝小时）
蛋白质a1M HOAc/DMF，40℃ 1M HOAc/DMSO，40℃
2h 24h 48h 2h 24h 48h
胰高血糖素 100%b49% 37% 124% 117% 119%
bPP 42% 40% 32% 52% 90% 86%
GRF 79% 26% 0% 98% 89% 86%
A（SO-3）4100% 58% 36% 100% 100% 96%
B（SO-3）297% 62% 37% 94% 106% 68%
胰岛素原 86% 43% 30% 97% 70% 86%
a bpp＝牛胰多肽
GRF＝生长激素释放因子
A（SO-3）4＝胰岛素A链S-磺酸盐
B（SO-3）2＝胰岛素B链S-磺酸盐
b 反应剩余量的相对百分数是对未经处理的对照样品测定的。
类似于表4、表5提供的蛋氨酰人类生长激素稳定性结果，证明和DMF比起来，NMP得到的结果和DMSO的结果更相近。
表5
蛋氨酰人类生长激素的稳定性
反应时间（小时），40℃
试剂 2 4 24
0.33 M HOAc/DMF 78a/78b65/68 45/34
0.33 M HOAc/DMSO 91/100 77/99 75/86
0.33 M HOAc/NMP 85/90 70/89 77/75
a 反相HPLC测定的
b 阴离子交换HPLC测定的
表6详细列出几种溶剂对蛋-脯-甘-甘-NH2断裂反应影响的结果。
表6
溶剂效应
（作为蛋-脯 二酮哌嗪生成的指标，
蛋-脯-甘-甘-NH2消失情况）
反应时间（小时），25℃
溶剂 0 2 4 6 24
1M HOAc/CH3CN 100%a114% 105% 99% 66%
1M HOAc/nPrOH N.D.b100% 97% 94% 72%
1M HOAc/MeOH 100% 101% 99% 99% 97%
1M HOAc/CH2Cl2100% 104% 96% 99% 80%
1M HOAc/DMF 100% 88% 71% 57% 11%
1M HOAc/DMSOc100% 73% 56% N.D.b6%
a 代表起始物质剩余量
b N.D.，未测定
c 在40℃测定的
从以上结果看出，NMP，DMF和DMSO，所有质子惰性溶剂都十分合用。
表7列出了使用DMF和DMSO作溶剂时，几种肽的温度效应研究结果。
表7
温度效应
（在40℃，在选定的两种溶剂（分别和1MHOAC混合）中，
蛋氨酸-脯氨酸 二酮哌嗪的生成）
DMF DMSO
肽a时间（小时） 时间（小时）
2 24 2 24 48
MPGG-NH276% 100% 36% 100% 100%
MPTG-NH222% 88% 3% 11% 38%
MPPG-NH220% 95% 5% 43% 65%
MPFG-NH210% 68% 1% 12% 23%
a MPGG-NH2＝蛋-脯-甘-甘-NH2
MPTG-NH2＝蛋-脯-苏-甘-NH2
MPPG-NH2＝蛋-脯-脯-甘-NH2
MPFG-NH2＝蛋-脯-苯丙-甘-NH2
如表7和前面其他表的数据显示的，DMF比DMSO对于生成二酮哌嗪和伴随的断裂反应有更大的影响，它对于产物蛋白质或肽，也有较大的降解作用。为了得到最佳结果，考虑到任一特殊肽或蛋白质产物，在选用反应条件时要有综合考虑。
表8给出了把有机相断裂条件用于模型肽得到的结果。这种模型肽模拟本发明的化合物，其中基团肽是人类生长激素。值得注意的是，人类生长激素的头两个氨基酸是苯丙-脯，所以是一种特殊情况。这样，从本发明的化合物的X-Pro形成二酮哌嗪，和从得到的人类生长激素的开始的苯丙-脯中找到二酮哌嗪形式都是可能的。表8将蛋-脯-苯丙-脯-苏-异亮-NH2和苯丙-脯-苏-异亮-NH2作了比较。结果表明，从后者生成二酮哌嗪较慢。这样，能够明确确定本发明的一种化合物蛋-脯-人类生长激素的处理条件，以便最大限度生成单一的二酮哌嗪，同时发生断裂反应，生成最少的次级二酮哌嗪。关于这方面，NMP是一种最好的溶剂，因为二酮哌嗪生成量明显比在DMSO中多，在较后的几次测定中，几乎和在DMF达到的一样。当考虑到在NMP中比在DMF中生长激素的稳定性增加（表5）时，至少在这个应用中，NMP是理想的溶剂。
表8
从生长激素模型肽中生成二酮哌嗪
蛋-脯-苯丙-脯-苏-异亮-NH2
反应时间（小时）40℃
试剂 2 4 6 24
0.33M HOAc/NMP 17% 32% 47% 99%
0.33M HOAc/DMSO 4% 6% 27% 33%
0.33M HOAc/DMF 14% 47% 63% 98%
苯丙-脯-苏-异亮-NH2
反应时间（小时），40℃
试剂 2 4 6 24
0.33M HOAc/NMP 7% 12% 23% 78%
0.33M HOAc/DMSO 4% 7% 11% 27%
0.33M HOAc/DMF 15% 26% 37% 88%
B.水相断裂条件
在1M磷酸钠缓冲溶液中溶解1毫克肽，PH8，达到蛋-脯-甘-甘-NH2最佳水相断裂。为了加速断裂反应，在55℃保温24小时。用在有机相断裂时同样的方法测定断裂的程度。
下列表9到12，提供了在一缓冲水溶液介质中，使用酸性，中性或碱性条件得到的结果。
表9记载用肽蛋-脯-甘-甘-NH2作基质，在PH7.0时断裂反应的收率。考察了两种不同缓冲盐类和浓度下的三个不同温度的影响。结果表明，磷酸盐缓冲液比乙酸盐好，1.0M磷酸盐浓度得到的结果最好。
表9
不同的缓冲体系及浓度对从蛋-脯-甘-甘-NH2生成蛋氨酸-脯氨酸二酮哌嗪的影响，PH＝7.0
生成量＊
缓冲溶液 100℃ 40℃ 25℃
0.1M 磷酸钠 100% 70% 14%
1.0M 磷酸钠 100% 93% 25%
0.1M 乙酸钠 55% 12% 1%
1.0M 乙酸钠 86% 35% 4%
＊在100℃下蛋氨酸-脯氨酸二酮哌嗪生成情况，是在两小时时测量的;40℃和25℃下的形成情况是在72小时时测量的。
表10记载了40℃下在缓冲水介质中，PH对由蛋-脯-甘-甘-NH2生成蛋氨酸-脯氨酸二酮哌嗪的影响。磷酸钠用作缓冲盐。结果表明，PH值在碱性范围将是更好一些。因为在高PH值时，会加速不希望有的付反应，例如脱酰胺基作用和脱硫作用，故PH在8左右是适宜的。
表10
在1.0M磷酸钠溶液中，PH值对蛋氨酸-脯氨酸
二酮哌嗪生成的影响，40℃
时间（小时）
4 24 48 72
pH3 1% 30% 31% 9%
pH5 2% 9% 18% 25%
pH7 18% 29% 89% 92%
pH8 27% 80% 97% 100%
pH9 30% 86% 98% 100%
表11列出了在PH8和40℃时，不同缓冲盐溶液对由蛋-脯-甘-甘-NH2断裂的收率的影响情况。磷酸盐是较好的缓冲剂。
表11
不同缓冲盐对PH＝8和40℃时从蛋-脯-甘-甘-NH2
生成蛋氨酸-脯氨酸二酮哌嗪的影响
时间（小时）
缓冲剂 2 24
1.0M 磷酸钠 22% 86%
1.0M 亚磷酸钠 6% 40%
1.0M 亚硫酸钠 6% 35%
表12列出了温度对一系列肽生成蛋氨酸-脯氨酸二酮哌嗪的影响结果，这几种肽中只是从N-端起第三个残基侧链彼此有所不同。像前面表3中列出的情况一样，十分清楚，在第三个残基位置上增加位阻，将减慢反应。但是，除了两种情况例外，其他全都有相当的断裂发生。对于所有四种试验的四肽，温度从40℃增加到55℃，断裂的速度和程度都有明显增加。
表12
温度效应
在1.0M磷酸盐缓冲溶液和PH8时，在两种温度下蛋氨酸-
脯氨酸二酮哌嗪生成情况
反应时间（小时） 反应时间（小时）
40℃ 55℃
肽a2 24 48 2 24 48
MPGG-NH216% 84% 96% 47% 100% 100%
MPTG-NH22% 18% 26% 8% 47% 75%
MPPG-NH20% 12% 19% 6% 30% 53%
MPFG-NH20% 9% 14% 4% 28% 57%
a MPGG-NH2＝蛋-脯-甘-甘-NH2
MPTG-NH2＝蛋-脯-苏-甘-NH2
MPPG-NH2＝蛋-脯-脯-甘-NH2
MPFG-NH2＝蛋-脯-苯丙-甘-NH2
对肽和蛋白质进行有代表性的取样，用前述断裂方法得到产物，该产物用高效阴离子交换和反相色谱分析。阴离子交换色谱是在MOnoQ柱上，在0.05M三羟甲基氨基甲烷（Tris），含有30%乙腈的PH8的缓冲溶液中进行的，用氯化钠溶液线性梯度淋洗。反相分析在Zorbax C8，150孔径，柱子中进行，使用在0.1M磷酸铵中乙腈梯度淋洗，温度为45℃，PH＝7.0。
勘误表