利用 BGIos1025 基因促进植物根的生长 发明领域 本发明涉及用于促进植物根的生长的方法。特别地， 本发明利用 BGIos1025 基因 促进植物根的生长。
发明背景
水稻是我国重要的经济作物， 其栽种面积为 4.5 亿亩左右。世界上约有 60％的人 口以稻米作为日常主食。通过水稻的分子育种来提高产量， 给全球的粮食生产带来了巨大 收益。矮秆基因的利用和多分蘖水稻的育成， 使我国的水稻产量取得了巨大飞跃。但在相 当长的一段时间里， 我国的水稻单产出现了徘徊不前的局面。 由此， 许多育种工作者从育种 理论和方法上提出了新的思路和设想， 希望使水稻单产取得新的突破。在水稻的高产育种 理论上， 国际水稻研究所于 20 世纪 90 年代初就提出了基于新株型的超级稻理论， 然而， 到 目前为止， 在水稻的育种科研与实践中对水稻地下部分的形态和生理性状的改良却未能在 水稻的分子育种中得以具体体现。
目前我国水稻的水肥利用率低， 这不仅造成大量人力、 物力和财力的浪费， 而且大 量的化学肥料和农药通过地表径流以及土壤渗透排入江河湖泊和地下水中， 对地表和地下 水造成严重污染。这已经成为环境污染的一个重要方面。另一方面， 全世界近一半的水稻 种植面积处在缺水的状态下， 严重影响了水稻产量的提高。我国很多地区由于相对缺乏灌 溉用水， 致使水稻生产难以发展， 这在一定程度上影响了耕地资源的充分利用。因此， 提高 水稻本身的水肥利用率， 发展节水型水稻， 是新时期可持续农业发展的又一基本要求。 而对 于提高水稻品种本身的肥料利用率来说， 根系的相关形态和生理性状的改良至关重要。随 着环保和农业的进一步发展， 在经济发达的地区， 解决水稻易发生根倒伏， 提高水肥利用率 已成为提高水稻产量和发展的一个关键问题。从根系角度研究水稻抗根倒伏的生物学、 力 学机制及其遗传基础， 对于从栽培和育种角度减轻水稻根倒伏的危害， 具有巨大的现实和 长远意义。
水稻根系既是吸收养分和水分的重要器官， 也是一些物质合成和运输的器官， 它 的形态发育对水稻产量和品质的影响很早就引起人们的注意。 育种学家主要关注于环境对 根系生长发育的影响 ( 孙传清等， 中国农业科学 .1995， 28(1) ： 42-48) 以及根系与产量等因 素之间的相互关系 ( 凌启鸿等， 中国农业科学 .1984， (4) ： 3-11)， 然而， 关于根系的分子育 种研究却很少报道。与根系性状表达相关的分子标记的开发表明， 控制水稻根系发育的是 数量性状 (Yadav 等人， Theor Appl Genet.1997， 94 ： 619-632 ； 徐吉臣等， 遗传学报 .2002， 29(3) ： 245-249)， 但这并未引起足够的重视。石庆华等 ( 中国农业科学 .1997， 30(4) ： 61-67) 研究了根系发育与地上部分的相关关系， 并指出， 在栽培上培育有利于塑造理想株 型的根型是水稻高产栽培的新要求， 深根系更有利于高产。 但是， 育种工作者至今未能就什 么是理想的水稻根型提出具体明确的指标。
目前， 如何从思路和技术上提出一种崭新的方法来定位水稻根系发育的基因已 成为水稻育种的关键。相关研究表明， 检测自然选择信号可能是一条崭新的、 高通量的鉴 定有用基因的道路。由于人工选择的时间短， 遗传重组事件少， 受选择的基因与其邻近区
域会紧密连锁， 因此， 如果观察到一个基因组区域的多态性分布很特别， 具有统计学显著 性， 那么该区域含有的基因和突变位点即有可能与选择的性状相关。研究表明， 水稻全基 因组大约 6 ％的区域为 SNP 高变区， 这些区域可能富集了与亚种分化和重要复杂农艺性 状相关的基因 (Tang 等人， PLoS Genet.2006， 2： e199)。Gao L Z 等 (BMC Evolutionary Biology.2008， 8： 11) 通过对栽培稻和普通野生稻进行对比分析， 建立了理论群体遗传学 数学模型， 检测了 60 个微卫星位点所受的人工选择， 发现了一些留有显著选择痕迹的位点 以及其近邻的可能的功能基因。 但这些研究离从全基因组水平全面分析人工选择的基因依 然遥远， 这主要是因为数据量远远不够， 模型和方法也有待提高。 迄今为止识别出的水稻性 状基因如 qSH1、 Rc、 sh4、 hd1(Kovach 等人， Trends in Genetic s.2007， 23(11) ： 578-587)， 以 及 PROG1(Jin 等 人， Nature Genetics.2008， 40(11) ： 1365-1369) 和 GIF1(Wang 等 人， NatureGenetics.2008， 40(11) ： 1370-1374) 仍然是通过传统的图位克隆手段获得的。
新一代测序技术 ( 如 Solexa、 Solid 测序仪 ) 的出现， 为廉价高效地获得水稻根系 发育基因和基因家族提供了前所未有的机会。 利用野生稻与栽培稻的基因组重测序数据和 技术， 能够比较各栽培种及野生种的基因组结构的异同， 这使运用进化基因组学的理论和 方法来获得根系发育相关的基因或基因组功能元件成为可能。 长期以来， 对水稻根系发育形态、 生理性状的遗传改良一直未能在水稻的分子育 种中得以体现。虽然杂交水稻的根系比常规品种在形态和生理上占有优势， 使育种家看到 了根系改良的重要性和实际效果， 但是迄今为止未能提出一套具体的改良指标。 因此， 需要 进一步研究和开发水稻根系发育相关基因， 以进一步提高根系对营养的吸收和对水肥的利 用率， 减少农药的施用， 增加地上部分的分蘖和收获等。
随着水稻分子育种理论与技术的不断成熟和完善， 以及遗传转化体系的建立和优 化， 利用新型测序技术结合基因组学方法来鉴定受人工选择的基因资源， 使得利用基因组 重测序技术发掘根系发育相关基因和遗传转化成为可能。 水稻地下部分发育的改良将进一 步提高水稻的产量、 品质和抗性等。水稻根系发育相关基因的开发和遗传转化对于提高水 稻地上部分的产量、 降低农业投入、 缓解环境污染、 实现农业可持续发展具有重要的意义， 其有利于增强我国农业在国际上的竞争力。
发明内容
本发明通过实验证实， 基因 BGIos1025( 其序列可以是 SEQ ID NO ： 7) 具有促进植 物根系生长的功能。
因此， 在一个方面， 本发明提供了含有基因 BGIos1025 的载体。在一个实施方案 中， 所述载体优选是表达载体， 更优选是在植物中高效表达基因 BGIos1025 的载体， 例如包 含基因 BGIos1025 的重组载体 p6， 如本发明的重组载体 p6+BGIos1025。
在 另 一 个 方 面， 本 发 明 提 供 了 含 有 基 因 BGIos1025 或 根 据 本 发 明 的 载 体 的 宿 主 细 胞。 在 一 个 实 施 方 案 中， 所 述 宿 主 细 胞 优 选 是 根 癌 农 杆 菌， 例如根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos1025。
在另一个方面， 本发明提供了基因 BGIos1025 和 / 或根据本发明的载体和 / 或宿 主细胞用于促进植物根系生长或用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。 在一个实施 方案中， 所述转基因植物与未进行转基因的植物相比， 展示更优良的植物根系生长。在另一个方面， 本发明提供了促进植物根系生长的方法， 其包括将基因 BGIos1025 和 / 或根据本发明的载体转化入植物， 或用根据本发明的宿主细胞感染植物。
在一个实施方案中， 通过本领域公知的方法， 例如根癌农杆菌转化法来将基因 BGIos1025 或根据本发明的载体转化入植物。
在一个实施方案中， 基因 BGIos1025 可操作地连接至在植物中有效的表达调控元 件， 例如启动子和 / 或终止子， 优选玉米泛素启动子和 / 或 NOS 终止子。
在另一个方面， 本发明提供了产生转基因植物的方法， 所述方法包括以下步骤 ：
1) 将基因 BGIos1025 和 / 或根据本发明的载体转化入植物愈伤组织， 或用根据本 发明的宿主细胞感染植物愈伤组织 ；
2) 从所述愈伤组织再生转基因植物。
在一个实施方案中， 通过上述方法产生的转基因植物与未进行转基因的植物相 比， 展示更优良的植物根系生长， 例如转基因植物的根系浅层分布更密集。
在一个实施方案中， 通过本领域公知的方法， 例如根癌农杆菌转化法来将基因 BGIos1025 和 / 或根据本发明的载体转化入植物愈伤组织。
在一个实施方案中， 基因 BGIos1025 可操作地连接至在植物中有效的表达调控元 件， 例如启动子和 / 或终止子， 优选玉米泛素启动子和 / 或 NOS 终止子。
在另一个方面， 本发明提供了通过上述方法产生的转基因植物。
在另一个方面， 本发明提供了含有基因 BGIos1025 或本发明的载体或被本发明的 宿主细胞感染的植物愈伤组织。
在另一个方面， 本发明提供了上文所述的植物愈伤组织用于制备转基因植物或用 于植物育种的用途。
在另一个方面， 本发明提供了一种转基因植物， 其被导入了基因 BGIos1025 和 / 或 根据本发明的载体和 / 或根据本发明的宿主细胞。
在一个实施方案中， 所述转基因植物， 与未导入基因 BGIos1025 或根据本发明的 载体或根据本发明的宿主细胞的对照植物相比， 展示更优良的植物根系生长， 例如转基因 植物的根系浅层分布更密集。
在一个实施方案中， 基因 BGIos1025 可操作地连接至在植物中有效的表达调控元 件， 所述表达调控元件例如启动子和 / 或终止子， 优选玉米泛素启动子和 / 或 NOS 终止子。
在 本 发 明 中， 重 组 载 体 p6 是 指， 包 含 玉 米 泛 素 启 动 子 和 NOS 终 止 子 的 pCAMBIA-1301 载体。
在本发明中， 植物优选是单子叶植物， 更优选为水稻、 谷子 (Setariaitalica)、 小 麦、 高粱、 玉米， 特别优选为水稻， 例如日本晴。
发明的有益效果
本发明通过实验证实， 基因 BGIos1025 具有促进植物根系生长的功能。从而， 与现 有技术相比， 本发明的技术方案将进一步提高根系对营养的吸收和对水肥的利用率， 减少 农药的施用， 增加地上部分的分蘖和收获， 进一步提高水稻的产量、 品质和抗性。这对于降 低农业投入、 缓解环境污染、 实现农业可持续发展和增强我国农业在国际上的竞争力具有 重要的意义。
关于生物材料保藏的说明本发明涉及以下生物材料 ：
1. 普通野生稻元江种子， 其于 2010 年 9 月 6 日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武 汉大学保藏中心， 即中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏编号为 CCTCC P201011 ；
2. 根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)EHA105， 其于 2009 年 12 月 24 日保 藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心， 即中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保 藏编号为 CCTCC M 209315 ；
3. 水稻日本晴种子， 其于 2009 年 12 月 18 日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉 大学保藏中心， 即中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)， 保藏编号为 CCTCC P200910。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领域技术人 员将理解， 下列附图和实施例仅用于说明本发明， 而不是对本发明的范围的限定。 根据附图 和优选实施方案的下列详细描述， 本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说 将变得显然。
附图概述
图 1 是显示愈伤组织 GUS 染色的检测结果的照片。左边的愈伤组织为未转化 BGIos1025 基因的对照愈伤组织， 右边的愈伤组织为转化了 BGIos1025 基因的转基因愈伤 组织。
图 2 是 显 示 水 稻 苗 的 根 系 性 状 观 察 结 果 的 照 片。 其 中， 左边试管为未转化 BGIos1025 基因的对照水稻苗， 右边试管为转化了 BGIos1025 基因的转基因水稻苗。具体实施方式
实施例 1 ： BGIos1025 基因的 PCR 扩增和 pMD18-T+BGIos1025 重组载体的构建
1.PCR 扩增
使用植物基因组 DNA 提取试剂盒 (TIANGEN 新型植物基因组 DNA 提取试 剂盒， 目 录号 ： DP320-02) 提取普通野生稻元江 (Oryza.rifupongonYuanjiang)( 其由中国科学院昆 明动物研究所董杨提供 ) 的基因组 DNA(gDNA)。根据 BGIos1025 基因的碱基序列， 设计一 对 PCR 特异性扩增引物 ： 上游引物 F1(SEQ ID NO ： 1) 包含限制性酶切位点 BamHI， 下游引物 R1(SEQID NO ： 2) 包含限制性酶切位点 XbaI。以上述提取的元江 gDNA 为模板， 利用上游引 TM 物 F1、 下游引物 R1 和高保真 Ex Taq (TaKaRa， DRR100B) 聚合酶进行 PCR 扩增。PCR 扩增体 系如表 1 所示。
表1： BGIos1025 基因的 PCR 扩增体系
PCR 反应条件为 ： 94℃预变性 5 分钟 ； 94℃变性 45 秒， 55℃退火 50 秒， 72℃延伸 90 秒， 进行 35 个反应循环 ； 72℃延伸 7 分钟。
上 游 引 物 F1(SEQ ID NO ： 1) ： GCGGATCCAATGGGTGTCTTGTCTG， 其中下划线代表 BamHI 酶切位点。下游引物 R1(SEQ ID NO ： 2) ： GCTCTAGACTCATCAAACACTCCATCAT， 其中下划 线代表 XbaI 酶切位点。
PCR 扩增产物经 1.0％琼脂糖凝胶电泳分离， 得到大小 1190bp 左右的条带。使用 TIANGEN 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 ( 目录号 ： DP209-03) 进行纯化回收。
2.pMD18-T+BGIos1025 重组载体的构建
将上述纯化回收的 PCR 扩增产物进行 T/A 克隆 (pMD18-T 质粒， TaKaRa， D103A)， 然 后转化大肠杆菌， 挑取阳性克隆并测序， 以验证目的基因的序列。
其中， T/A 克隆的连接体系如下 ：
pMD18-T 1μl
2*Solution I 5μl
纯化回收的产物 10-20ng
ddH2O 补充至总体积 10μl
于 16 ℃ 在 节 能 型 智 能 恒 温 槽 ( 宁 波 新 芝， SDC-6) 中 连 接 至 少 8 小 时， 得到 pMD18-T+BGIos1025 重组载体。 按照本领域技术人员熟知的方法， 将经过上述连接后的产物 转化入大肠杆菌 DH5α， 从而获得含有 pMD18-T+BGIos1025 克隆载体的重组大肠杆菌， 将其 命名为 DH5α-BGIos1025。由深圳华大基因科技有限公司对 pMD18-T+BGIos1025 克隆载体 中的 BGIos1025 进行测序。测序结果与 SEQ ID NO ： 7 一致。
SEQ ID NO ： 7 的序列如下所示 ： ATGGGTGTCTTGTCTGCTGCTGACCCTCCCCCAGTCTCAGCAATTGGGTTTGAGGGCTATGAGAAGCGCCTTGAGATCACTTTCTCTGAGGCACCTGTCTTTGCTGACCCTGATGGTCGGGGTTTGCGCGCCCTCTCCAGGGCCCA GATTGACTCTGTTCTGGATCTTGCACGGTGCACCATTGTGTCCGAGCTGTCCAACAAGGACTTTGACTCCTATGTCC TCTCTGAGTCCAGCCTGTTTATCTATTCTGATAAGATTGTGATTAAGACCTGTGGGACTACAAAGCTCCTGCTCACA ATTCCAAGGATTCTTGAGCTTGCTGAAGGGCTTTCTATGCCACTTGCTGCTGTGAAGTACTCCCGCGGGATGTTCAT CTTCCCCAGTGCACAGCCTGCTCCCCACAGGAGCTTCTCTGAGGAAGTTGCTGTCCTCAACCGCTACTTTGGCCATC TGAAATCTGGTGGTAATGCTTATGTGATTGGAGATCCAGCAAAGCCTGGCCAGAAGTGGCATATCTACTATGCTACT CAGCACCCGGAGCAACCTATGGTTACCCTTGAAATGTGCATGACCGGACTGGACAAGGAGAAAGCTTCAGTCTTTTT CAAGACTTCTGCTGATGGTCACACATCATGTGCTAAGGAAATGACAAAACTCTCGGGCATCTCTGACATTATCCCAG AGATGGAGATCTGTGACTTTGACTTCGAACCCTGCGGCTACTCCATGAATGCAATCCATGGCTCAGCGTTTTCTACC ATTCATGTGACCCCTGAGGATGGCTTCAGCTACGCCAGTTATGAGGTCGTGGGCTTCGACGCCTCTACTC TTGCTT ATGGCGACCTGGTGAAGAGGGTCCTCAGGTGCTTTGGCCCTTCGGAGTTCTCTGTTGCTGTTACCATCTTTGGTGGG CATGGTCATGCTGGAACATGGGCAAAGGAGCTCAATGCTGATGCTTACAAATGCAACAACATGGTAGAGCAGGAGCT GCCCTGTGGTGGCCTCCTCATCTACCAGAGCTTCGACGCTACTGAAGACGTACCTGTTGCTGTTGGGTCGCCCAAAT CTGTTCTGCACTGCTTCGAGGCTGAGAATATGGTGAACCCTGCTCCTGTTAAGGAAGGTAAACTGGGCAATCTTCTC CCCTGGGGAGAGGATGCGTTGGAGGAGAATGATGGAGTGTTTGATGAGTAA 实施例 2 ： p6 重组载体的构建
1. 玉米泛素 (ubi) 启动子片段的 PCR 扩增和 pMD18-T+Ubi 重组载体的构建
Ubi 启动子的 PCR 扩增
使用植物基因组 DNA 提取试剂盒 (TIANGEN 新型植物基因组 DNA 提取试剂盒， 目录 号： DP320-02) 提取玉米品种 B73(Zea mays mays cv.B73) 的基因组 DNA(gDNA)。根据实施 例 1 中描述的方法， 使用下列引物， 以上述提取的玉米 B73 的 gDNA 为模板， 用高保真 Ex Taq TM (TaKaRa， DRR100B) 聚合酶进行 Ubi 启动子的 PCR 扩增 ：
上游引物 F2(SEQ ID NO ： 3) ： GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT， 含有限制性酶切位 点 PstI ；
下 游 引 物 R2(SEQ ID NO ： 4) ： GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC， 含有限制性酶切位点 PstI。
PCR 扩增产物经 1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后， 使用 TIANGEN 琼脂糖凝胶 DNA 回收 试剂盒 ( 目录号 ： DP209-03) 纯化回收。
pMD18-T+Ubi 重组载体的构建
根据实施例 1 中描述的方法， 将上述纯化回收的 PCR 扩增产物连接入 pMD18-T 质 粒 (TaKaRa， D103A)， 然后转化入大肠杆菌 DH5α， 从而获得含有 pMD18-T+Ubi 克隆载体的重 组大肠杆菌， 将其命名为 DH5α-Ubi。由深圳华大基因科技有限公司进行测序验证， 从而确 定目的片段的正确插入。
2.pCAMBIA-1301+Ubi 重组载体的构建
根据厂商的说明书， 使用 TIANGEN 普通质粒小提试剂盒 ( 目录号 ： DP103-03) 从 DH5α-Ubi 重组大肠杆菌提取含有玉米 Ubi 启动子序列的重组载体 pMD18-T+Ubi。用限制 性内切酶 Pst I( 购自 NEB) 对重组载体 pMD18-T+Ubi 进行酶切， 然后用 TIANGEN 琼脂糖凝 胶 DNA 回收试剂盒 ( 目录号 ： DP209-03) 回收玉米 Ubi 启动子片段。同样地， 用限制性内切 酶 PstI 酶切 pCAMBIA-1301 质粒 ( 由中国科学院昆明动物研究所董杨提供 ； 或者可从例如
上海国瑞基因科技有限公司购得 )， 并进行纯化回收。50μl 酶切体系如下 ：
ddH2O 34.9μl
10*Buffer 3 5μl
Pst I 0.1μl(10U)
pMD18-T+Ubi 或 pCAMBIA-1301 10μl( ＜ 1000ng)
根据厂商的说明书， 使用 T4 连接酶 (TaKaRa， D2011A)， 连接回收的 Ubi 启动子片 段与回收的 pCAMBIA-1301 质粒片段。10μl 连接体系如下 ：
10*T4 Buffer 1μl
回收的 pCAMBIA-1301 质粒 1μl(20ng)
回收的 Ubi 启动子片段 10-20ng
ddH2O 补齐至 9.5μl
T4 连接酶 0.5μl
将连接体系于 16℃在节能型智能恒温槽 ( 宁波新芝， SDC-6) 中连接至少 8 小时。
将 经 过 上 述 连 接 后 的 产 物 转 化 入 大 肠 杆 菌 DH5α， 从而获得含有重组载体 pCAMBIA-1301+Ubi 的重组大肠杆菌。根据厂商的说明书， 使用 TIANGEN 普通质粒小提试剂 盒 ( 目录号 ： DP103-03) 提取重组载体 pCAMBIA-1301+Ubi。
用引物 F2 和 R2 对所得的重组载体 pCAMBIA-1301+Ubi 进行 PCR 检测， 从而确证所 得的重组载体 pCAMBIA-1301+Ubi 中含有所需的 Ubi 启动子。
3.NOS 终止子的 PCR 扩增和 pMD18-T+NOS 重组载体的构建
根据上文描述的方法， 使用下列引物， pCAMBIA-1301 质粒为模板， 用高保真 Ex TM Taq (TaKaRa， DRR100B) 聚合酶进行 NOS 终止子的 PCR 扩 增 ：
上游引物 F3(SEQ ID NO ： 5) ： GGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAA， 含有限制性酶切位 点 Sac I ；
下游引物 R3(SEQ ID NO ： 6) ： GGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT， 含有限制性酶切位 点 EcoR I。
PCR 扩增产物经 1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后， 使用 TIANGEN 琼脂糖凝胶 DNA 回收 试剂盒 ( 目录号 ： DP209-03) 纯化回收。
根据上文描述的方法， 将上述纯化回收的 PCR 扩增产物连接入 pMD18-T 质粒 (TaKaRa， D103A)， 然后转化入大肠杆菌 DH5α， 从而获得含有 pMD18-T+NOS 克隆载体的重组 大肠杆菌， 将其命名为 DH5α-NOS。由深圳华大基因科技有限公司进行测序验证， 从而确定 目的片段的正确插入。
4.pCAMBIA-1301+Ubi+NOS 即 p6 重组载体的构建
根据厂商的说明书， 使用 TIANGEN 普通质粒小提试剂盒 ( 目录号 ： DP103-03) 从 DH5α-NOS 重组大肠杆菌提取 pMD18-T+NOS 克隆载体。 使用上文描述的方法， 用限制性内切 酶 Sac I 和 EcoR I( 购自 NEB) 对 pMD18-T+NOS 克隆载体进行酶切， 然后用 TI ANGEN 琼脂 糖凝胶 DNA 回收试剂盒 ( 目录号 ： DP209-03) 回收 NOS 终止子片段。同样地， 用限制性内切 酶 Sac I 和 EcoRI 酶切上文制备的 pCAMBIA-1301+Ubi 重组载体， 并进行纯化回收。
使用上文描述的方法， 用 T4 连接酶 (TaKaRa， D2011A) 连接回收的 NOS 终止子片段 与回收的 pCAMBIA-1301+Ubi 重组载体片段， 并将连接产物转化入 DH5α， 并最终获得重组载体 pCAMBIA-1301+Ubi+NOS， 即 p6。
实施例 3 ： p6+BGIos1025 重组载体的构建
使用上文描述的方法， 提取 pMD18-T+BGIos1025 重组载体， 用限制性内切酶 KpnI/ XbaI 进行酶切并回收 BGIos1025 基因片段。 类似地， 提取 p6 重组载体， 用相应的限制性内切 酶 KpnI/XbaI 进行酶切并回收大片段。 使用上文描述的方法， 连接回收的 BGIos1025 基因片 段和 p6 重组载体片段， 并将连接产物转化入 DH5α， 从而最终获得重组载体 p6+BGIos1025。 进行 测序验证， 从而确定目的片段的正确插入。
实施例 4 ： 重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos1025 细胞的制备
按照本领域技术人员熟知的方法， 制备根癌农杆菌 EHA105 的感受态细胞 ( 参见 《分子克隆实验指南》 ， 第三版， 科学出版社 )。
将实施例 3 制备的 p6+BGIos1025 重组载体转化入根癌农杆菌 EHA105 的感受态细 胞， 具体方法如下。
将根癌农杆菌感受态细胞 EHA105 于超低温冰箱中取出， 置于冰上解冻。解冻后， 加入 5μl 的 p6+BGIos1025 重组载体， 轻轻混匀， 冰浴 10 分钟， 放入液氮中冷冻 5 分钟， 37℃ 温育 5 分钟， 然后加入 800μl 常温的 LB 液体培养基 ( 具体配方详见 《分子克隆实验指南》 ， 第三版， 科学出版社 )， 并于 28℃， 160rpm 下复苏 3 小时。复苏后， 以 8000rpm 离心 30 秒， 吸 去上清而留下 200μl 并吹匀、 涂布于含有卡那霉素 - 利福平 (kan-rif) 的 YM 培养基平板 上 (50mg/l Kan， 10mg/l Rif， 具体配方参见表 4)。28℃倒置培养 2-3 天， 获得重组根癌农 杆菌单菌落。 通过用引物 F1(SEQ ID NO ： 1) 和 R1(SEQ ID NO ： 2) 进行 PCR 检测和通过 BamH I/ XbaI 酶切筛选重组根癌农杆菌转化子。
PCR 扩 增 出 约 1190bp 左 右 的 条 带 和 酶 切 出 约 1190bp 左 右 的 条 带 的 转 化 子 为 包 含 重 组 载 体 p6+BGIos1025 的 重 组 根 癌 农 杆 菌， 将其命名为重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos1025。
实施例 5 ： 水稻愈伤组织的诱导和转化
按照如下步骤诱导水稻愈伤组织， 并用重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos1025 转 化所述愈伤组织。
1) 将水稻日本晴 (Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare) 种子去壳， 用 70％ 乙醇表面消毒 30 秒， 然后用有效氯 1.5％的次氯酸钠消毒 30 分钟， 并伴随剧烈摇动 ； 消毒 后用灭菌水清洗 5 次 ； 将清洗后的种子置于 N6D 培养基 ( 具体配方参见表 2) 上， 用封口膜 封口 ； 29.5℃光照培养 3-4 周 ；
2) 选取活跃生长的愈伤组织 ( 黄白色， 干燥， 直径 1-3mm)， 在新 N6D 培养基上 29.5℃光照培养 3 天 ；
3) 挑取实施例 4 获得的重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos1025 单菌落， 于添加抗 生素 (50mg/l Kan， 10mg/l Rif) 的 YM 培养基 ( 具体配方参见表 3、 表 4) 上划线培养 3 天， 培养温度为 28℃ ； 刮取上述重组根癌农杆菌， 将其置于添加了 30μl 100mM 的乙酰丁香酮 (Acetosyringone， AS) 的 30ml AAM 培养基 ( 具体配方参见表 5) 中， 温和重悬所述重组根 癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos1025 细胞 ；
4) 将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中 ； 然后将步骤 3) 制备的重组根癌农
杆菌悬液倒入所述培养皿中， 将所述愈伤组织浸泡 15 分钟 ；
5) 弃去培养皿中的重组根癌农杆菌悬液， 用灭菌吸水纸将愈伤组织上多余的液体 吸干 ； 在 N6-AS 培养基 ( 具体配方参见表 6) 上放置一张灭菌滤纸， 并添加 1ml 含 AS 的 AAM 培养基， 然后将愈伤组织转移至滤纸上 ； 密封培养皿， 28℃暗培养 48-60 小时 ；
6) 将步骤 5) 获得的愈伤组织置于 50ml 灭菌管中， 用灭菌水摇动清洗， 直至上清液 变澄清 ； 将愈伤组织浸泡于含 500mg/l 羧苄青霉素 (Carb) 的无菌水中以杀死重组根癌农杆 菌； 用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分， 然后将其转移至含 1mg/l 潮霉素 B(HmB) 和 50mg/l Carb 的 N6-AS 培养基上 ； 用封口膜密封培养皿， 29.5℃光照培养 3-4 周。
实施例 6 ： 水稻愈伤组织中的 GUS 表达的检测
为检测实施例 5 制备的经转化的水稻愈伤组织中 GUS 的表达情况， 按照 Chen S Y 等描述的方法 (Journal of Integrative Plant Biology， 2008， 50(6) ： 742-751)， 对用重 组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos1025 转化的水稻愈伤组织进行染色。
1ml GUS 染色液中包含 ： 610μl 0.2M Na2HPO4 溶液 (pH ＝ 7.0) ； 390μl 0.2M NaH2PO4 溶液和 10μl 0.1M X-gluc。
将用重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIos1025 转化的水稻愈伤组织浸泡在 GUS 染色 液中， 在 37℃下温育直至出现蓝色。拍照记录染色结果， 并示 于图 1 中。结果显示， 实施例 5 制备的经转化的水稻愈伤组织经染色后呈现蓝色 ( 图 1 右侧 )， 而未经转化的对照愈伤组 织经 GUS 染色后颜色未发生变化 ( 图 1 左侧 )。这表明， 本发明的 p6+BGIos1025 重组载体 已转化入水稻愈伤组织。 实施例 7 ： 转基因水稻幼苗中的 GUS 表达的检测
将实施例 5 制备的经转化的愈伤组织转移至含 50mg/l 潮霉素 B(HmB) 的 MS-R 分 化培养基 ( 具体配方见表 7)， 以分化生长幼苗 ； 用封口膜密封培养皿， 29.5℃光照培养 3-4 周； 待幼苗长至 3-4cm 时， 将幼苗转移到含 50mg/l 潮霉素 B(HmB) 的 1/2MS 生根培养基 ( 具 体配方参见表 8)， 以进行生根筛选。
转基因水稻幼苗的 GUS 染色方法与实施例 6 中愈伤组织的 GUS 染色方法相同。拍 照记录染色结果， 结果显示， 经含有 p6+BGIos1025 重组载体的根癌农杆菌转化的水稻幼苗 的根和叶经 GUS 染色后呈现蓝色， 未经转化的对照幼苗的根和叶经 GUS 染色后颜色未发生 变化。这表明， 本发明的 p6+BGIos1025 重组载体已转化入水稻幼苗中。
实施例 8 ： 转基因水稻苗的根系的性状观察
转基因水稻幼苗在 1/2MS 生根培养基中生长 20 天后， 进行拍照记录， 结果示于图 2 中。结果显示， 经含有 p6+BGIos1025 重组载体的根癌农杆菌转化的水稻苗的根系 ( 图 2， 右边试管 ) 与未经转化的对照水稻苗的根系 ( 图 2， 左边试管 ) 相比， 根系浅层分布更密集 发达。在本实施例中， 一共栽培了 35 株转基因水稻苗， 其中的 32 株显示浅层分布密集发达 生长的根系 ( 与对照水稻苗相比 )。 这些数据表明， 本发明的 BGIos1025 基因有效地促进植 物的根系生长， 并且用 BGIos1025 基因转化的植物显示更优良的植物根系生长 ( 与对照相 比， 其根系浅层分布更密集发达 )。
本发明实施例中所使用的各种培养基的配方示于下文中。特别地， 在 本发明中， 培养基的 “常规灭菌” 是指如下条件的灭菌 ： 在 121℃下蒸汽灭菌 20 分钟。
表2： N6D 培养基
用 1N 氢氧化钾将 pH 值调节到 5.8， 封口后常规灭菌。
N6 macro 母液 (20X) ： 硝酸钾 56.60g， 磷酸二氢钾 8.00g， 硫酸铵 9.26g， 硫酸镁 3.70g， 氯化钙 3.32g， 用蒸馏水定容至 1L， 4℃保存备用。
N6 micro 母液 (1000X) ： 碘化钾 0.80g， 硼酸 1.60g， 硫酸锰 3.33g， 硫酸锌 1.50g， 用蒸馏水定容至 1L， 4℃保存备用。
铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X) ： 将 3.73g 乙二铵四乙酸二钠 (Na2EDTA·2H2O) 和 2.78g FeSO4·7H2O 分别溶解， 并混合。用蒸馏水定容至 1000ml， 70℃温浴 2 小时， 冷却后 4℃保存不超过 1 个月。
N6 维生素贮存液 (1000X) ： 维生素 B1 0.10g， 维生素 B6 0.05g， 烟酸 0.05g， 甘氨 酸 0.20g， 用蒸馏水定容至 100ml， 过滤除菌， 4℃保存不超过 1 周。
表3： YM 液体培养基 ( 含有 50mg/L Kan， 10mg/L Rif)
表4： YM 固体培养基 ( 含有 50mg/L Kan， 10mg/L Rif)
表5： AAM 培养基用 1N 氢氧化钾将 pH 值调节至 5.2， 常规灭菌。
AAM macro(10X) ： 2.5g 七 水 硫 酸 镁 (MgSO4·7H2O)， 1.5g 二 水 氯 化 钙 (CaCl2·2H2O)， 1.33g 二水磷酸二氢钠 (NaH2PO4·2H2O)， 用蒸馏水定容至 1L， 4℃保存备
用。 AAM micro(100X) ： 0.7g 单 水 硫 酸 锰 (MnSO4·H2O)， 0.2g 七 水 硫 酸 锌 (ZnSO4· 7H2O)， 0.075g 碘化钾 (KI)， 0.3g 硼酸 (H3BO3)， 25mg 二水钼酸钠 (Na2MoO4· 2H2O)， 2.5mg 五水硫酸铜 (CuSO4·5H2O)， 2.5mg 六水氯化钴 (CoCl2·6H2O)， 用蒸馏水定容至 1L， 4℃保存备用。
AAM 有 机 (1000X) ： 0.75g 甘 氨 酸 (Glycine)， 0.1g 烟 酸 (Nicotinicacid)， 0.1g VB6(Pyridoxine)， 1g VB1(Thiamine)， 用蒸馏水定容至 100ml， 4℃保存备用。
铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X) ： 见表 2。
表6： N6-AS 共培养基
调节 pH 至 5.2。
N6 macro 母液 (20X)， N6 micro 母液 (1000X)， 铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X)， N6 维生素贮存液 (1000X) ： 均见表 2。
表7： MS-R 分化培养基
调节 PH 值至 5.8， 常规灭菌。
MS macro(20X) ： 硝酸铵 33.0g， 硝酸钾 38.0g， 磷酸二氢钾 3.4g， 硫酸镁 7.4g， 氯化 钙 8.8g， 逐一溶解， 然后室温下用蒸馏水定容至 1L， 4℃保存。
MS micro(1000X) ： 硫酸锰 16.90g， 硫酸锌 8.60g， 硼酸 6.20g， 碘化钾 0.83g， 钼酸 钠 0.25g， 硫酸铜 0.025g， 氯化钴 0.025g， 上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至 1L， 4℃ 保存。
MS 维生素贮存液 (1000X) ： 维生素 B1 0.010g， 维生素 B6 0.050g， 烟酸 0.050g， 甘氨酸 0.200g， 用蒸馏水定容至 100ml， 过滤除菌， 4℃保存不超过 1 周。
铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X) ： 见表 2。
表8： 1/2MS 生根培养基
调节 PH 值至 5.8。
MS macro(20X) ： 见表 7。
MS micro(1000X)， MS 维生素贮存液 (1000X) ： 见表 7。
铁盐 (Fe2EDTA) 贮存液 (100X) ： 见表 2。
参考文献
本文中用于举例说明本发明或提供关于本发明的实施的另外的详细内容的专利、 出版物和其他材料通过引用合并入本文， 并且为方便起见按下列文献目录提供。
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