本发明涉及制备物体的方法，以及支撑脂质双层的物体。
生物相容材料已经被广泛开发并用于体内应用。然而，生物相容性并 不意味着在材料植入后适当的细胞应答。因此，如果不是全部的话，大多 数生物相容材料显示出一定程度的生物惰性，这限制了它们的使用和/或性 能。生物惰性包括缺乏与宿主组织适当的相互作用，这种缺乏是由化学惰 性表面、生物触发器(trigger)的缺乏或者经由大分子吸附的(生物)结垢所 引起的。在植入材料后，缺乏适当的相互作用很快发生并且扰乱特定的细 胞相互作用。已经通过如下来着手处理生物惰性：修饰表面结构和拓扑结 构，以及经由共价或非共价化学将生物活性配体掺到生物相容材料中，从 而激起所期望的细胞应答。模型细胞膜(例如受支撑的脂质双层(SLB))已 经在减少蛋白结垢方面表现出巨大潜力，并且在它们的表面组成方面是可 调节的。SLB能够经由囊泡融合来制备，并且被广泛使用，因为它们是首 次被报道的(McConnel和Tamm1985)。SLB的不结垢性质和它们可调节 的组成使得它们成为在固体材料上表面涂层的理想候选者。然而，体内应 用中SLB的使用受限。
SLB例如描述于US2008/0241942中。在该文档中，描述了制造受支撑 的脂质双层膜的方法。双层被涂覆于固体表面上、优选地阵列上。该方法 包括如下步骤：(i)提供用分子膜涂布的固体表面；(ii)将固醇基团共价附着 (attaching)于分子膜，并且(iii)将固醇官能化的分子膜与脂质溶液接触。 US2008/0241942中所描述的方法的一个缺点是：分子膜(例如亲水性聚合 物或水凝胶涂层)必须被涂覆于能够附着双层的固体表面。双层不直接附 着于物体表面，而只经由分子膜附着于固体表面。分子膜包含将与固醇基 团进行共价反应的反应性基团，其将被转化成SLB。在固醇基团与分子膜 中的官能基团之间反应后，残余的官能基团将存在于水凝胶中，其可以使 SLB不稳定并引发不期望的难题。此外，将分子膜涂覆于支撑体上是额外 步骤，不仅耗时，而且增加了系统的复杂性。不仅需要控制SLB的制备， 而且需要控制基材和分子膜之间的相互作用和粘附以及分子膜的稳定性。 此外，分子膜不能被涂覆到所有类型的固体表面上。因此，对用于制备SLB 的基材的选择存在限制。另一个缺点是通过涂覆分子膜改变了固体表面的 化学性质和机械性质。
需要在各种生物相容材料上制造脂质双层的改进的方法。
本发明通过提供如下制备支撑脂质双层的物体的方法解决了该问题， 所述物体用于组织工程，所述方法包括如下步骤：
-提供具有表面的物体，
-用包含活性氧的等离子体处理物体的表面，以提供具有反应性基团A 的物体的表面，
-将固醇基团共价附着于反应性基团A，并且
-将用固醇基团活化的物体与脂质溶液接触，以形成脂质双层。
根据本发明的方法提供了容易、简单且低廉的表面修饰用于组织工程 的物体的方法，而不影响其本体性质。
根据本发明的方法的另一个优点是可以在物体上形成空气稳定的脂质 双层。
此外，本发明的方法可以容易地被调节用于处理不同种类材料制成的 物体。
另一个优点是，采用根据本发明的方法获得的物体适合用于体内用途。
另一个优点是，本方法可适用于由具有不同化学性质和机械性质的各 种材料制成的物体，所述物体可以被引入到身体中，并且对这些物体的细 胞应答与其化学性质和机械性质无关。
采用根据本发明的方法，制备用于在组织工程中的物体。该物体提供 一个或多个表面，以支撑脂质双层。表面优选地是未涂布的。可以用于制 备物体的材料的实例为金属，例如钛、铝、铂；金属氧化物，合金，玻璃， 陶瓷或聚合材料以及这些材料的组合。聚合材料可以是均聚物、共聚物或 嵌段共聚物。聚合材料的实例为聚氨酯、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚碳酸 酯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚环氧 乙烷(PEO)、聚醚砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚三亚甲基己内 酯(PTMC)、聚酐、聚乳酸(PLA)、聚原酸酯(poly(ortho)ester)和聚 磷腈。物体优选地包含聚酯、更优选地聚己内酯。物体优选地由生物相容 材料制成。
物体可以具有二维或三维结构。二维物体可以是例如膜或网。这些二 维结构可以例如修复皮肤或移植皮肤。三维物体可以是例如植入物或器械。 植入物例如被设计来修复或替代人体或动物体中的骨、软骨或血管。器械 是例如能够在人体或动物体治疗或愈合中使用的器械。
可以通过使用模制、复合、挤出、吹膜或铸塑或其他方法，制备物体。 也可以使用快速成形(rapidprototyping)或电纺丝来制备物体。
物体的表面用含活性氧的等离子体处理。活性氧包含含高反应性氧的 化合物的混合物。活性氧可以包含臭氧。通过用含活性氧的等离子体处理， 来修饰物体的表面。活性氧仅修饰物体的表面；物体的本体性质(bulk property)不受影响。
物体表面的等离子体处理可以在各种市售等离子体发生器中进行。等 离子体发生器可以例如包含提供电磁辐射的源。可以通过使用电磁辐射活 化含氧气体，来获得包含活性氧的等离子体。含氧气体可以例如是空气或 富含氧的气体，例如包含至少50％氧或至少75％氧或至少90％氧。
形成等离子体的电子辐射的能量可以宽的范围内变化，但优选地在50J 和800J之间，更优选地100J和700J之间，并且最优选地在200J和600J 之间。
可以通过例如电晕处理，获得包含活性氧的等离子体。电晕处理(也 被称为空气等离子体)是使用低温电晕放电等离子体来使表面性质发生改 变的一种表面修饰技术。电晕等离子体是通过施加高压于尖锐的电极尖端 从而在尖锐的尖端的末端形成等离子体来生成的。通常使用线性排列的电 极来产生一定的电晕等离子体。这是用于工业应用的最常见类型的等离子 体发生器，其是有成本效益的并且不需要除环境空气外的氧源来产生3-6％ 的活性氧浓度。
还可以通过紫外(UV)光、射频(RF)等离子体、冷等离子体处理或 电解产生活性氧，来生成含活性氧的等离子体。UV发生器或真空紫外(VUV) 发生器采用生成窄带紫外光的光源，并产生具有约0.5％或更低的活性氧浓 度的等离子体。这种方法的一个缺点是，它需要将空气(氧气)暴露于UV 源下相当长的时间。在冷等离子体方法中，等离子体是通过将纯氧气暴露 于介质阻挡放电(dielectricbarrierdischarge)来生成的。双原子氧被分裂成 单原子。氧原子可以例如在三线态重组以形成臭氧。冷等离子体机优选地 运用纯氧(例如包含超过75％的氧)作为输入源，并产生具有约5％最大浓 度活性氧的等离子体。含活性氧的等离子体的电解生成将等离子体中的水 分子分裂成例如H2、O2和O3。在大多数电解生成法中，将去除氢气来保留 剩余气体，剩余气体包含例如氧气和臭氧作为等离子体中仅有的反应产物。 这种生成含活性氧的等离子体的方法可以实现等离子体中20-30％浓度的活 性氧，并且与空气质量无关，因为水被用作起始底物。
优选地，使用RF等离子体处理或冷等离子体处理，用含活性氧的等离 子体来处理物体的表面。
在本发明的一个实施方式中，等离子体发生器可以包含活化腔室，在 活化腔室中可以对物体进行处理。在等离子体处理中，活化腔室可以处于 减压下。减压优选地为小于1bar、更优选地小于10Torr、最优选地小于1 Torr的压强。根据该实施方式，向活化腔室提供含氧气体，含氧气体可以 被电磁辐射活化，以形成含活性氧的等离子体。
通过用含活性氧的等离子体处理，在物体的表面上形成反应性基团A。 这些反应性基团A的实例为羟基、醛基、酯基和酸基。优选地，表面上的 反应性基团A是醛基。反应性基团A不是稳定的，将随着时间而消失。当 保持在极性溶剂(例如水和醇)中时，反应性基团A的稳定性相对较大。 在室温下，反应性基团可以在等离子体处理后稳定至多200小时。疏水性 条件(例如非极性溶剂或气体)下，稳定性受限。在室温下，在疏水性条 件下，反应性基团仅可以稳定几个小时(例如2个小时或者甚至更少)。
当然，对于与固醇基团形成共价键的可能性来说，物体表面上存在反 应性基团是必要的。优选地，共价地附着固醇基团应当发生在用等离子体 处理物体表面后至多2小时、更优选地处理后至多1.5小时、最优选地处理 后至多1小时。正常来说，共价附着固醇基团发生在处理后30分钟内、优 选地15分钟内。
物体表面上反应性基团A的浓度受等离子体中存在的活性氧的量影响， 并且受物体暴露于活性氧的时间影响。等离子体中活性氧的量可以在宽范 围内变化，并且例如取决于等离子体处理所选择的方法、形成等离子体的 电子辐射的能量以及等离子体处理时活化腔室中的条件。
在物体表面上产生反应性基团A所需要的等离子体中活性氧的量随物 体的类型、物体的材料和用于制备物体的材料的性质而改变。
例如，当物体是由聚己内酯制成且选择电晕处理用于处理时，可以采 用400J能量的电子辐射来形成等离子体，并且等离子体可以持续1-10秒、 优选地2-6秒。当选择UV处理用于相同物体的处理时，可以采用相同能量 的电子辐射形成等离子体，并且等离子体可以持续10-7200秒、优选地 15-3600秒。当使用RF等离子体或冷等离子体方法处理物体时，可以采用 400J能量的电子辐射形成等离子体，并且处理可以持续5至12秒、优选地 6-11秒。
物体表面上反应性基团A的量可以通过X射线光电子能谱(XPS)来确 定，并且为至少0.02nm-2，优选地至少0.06nm-2，以及更优选地至少0.15nm-2。 反应性基团A的量优选地为至多10nm-2，更优选地至多5nm-2，以及最优 选地至多2nm-2。优选地，反应性基团A的量在0.15和2nm-2之间。反应 性基团A的量以nm-2计，其代表每nm2物体表面上反应性基团A的量。根 据本发明的方法，固醇基团(sterolgroup)共价附着于反应性基团A。优选 的固醇基团是胆固醇、链甾醇、菜油固醇、羊毛甾醇、谷固醇、豆甾醇和 麦角固醇。更优选地，固醇基团是胆固醇。固醇可以经由A-环的3-位上羟 基或者经由间隔基团部分(spacermoiety)直接与反应性基团A反应。在本 发明的一个优选的实施方式中，固醇基团具有间隔部分，其中间隔部分能 够与物体表面上反应性基团A共价地进行反应。具有间隔部分的固醇可以 由固醇和间隔制备。间隔包含优选地一个反应性基团B和一个反应性基团 C。反应性基团B可以与固醇的羟基共价地反应，并且反应性基团C可以 与物体表面上的反应性基团A共价地反应。以这种方式，固醇可以经由间 隔部分而被共价附着于反应性基团A。间隔优选地包含具有1至50个碳原 子、1-20个碳原子、更优选地1-10个碳原子的烃基团。间隔还可以包含杂 原子，例如氧、硫和氮。间隔的实例为多胺，例如精胺，肽和亲水性聚合 物或低聚物。优选地，间隔是亲水性聚合物或低聚物，更优选地间隔包含 聚醚，最优选地低聚(乙二醇)。
优选地，反应性基团B和C附着于间隔的最末端。反应性基团B和C 的实例是胺、酰胺、羧酸和酯。
物体表面上固醇基团的量是重要的。固醇基团的量可以通过X射线光 电子能谱(XPS)确定，并且为至少0.02nm-2，优选地至少0.05nm-2，以 及更优选地至少0.1nm-2。固醇基团的量优选地为至多5nm-2，更优选地至 多2nm-2，以及最优选地至多1nm-2。固醇基团的量以nm-2计，其代表每 nm2物体表面上固醇基团的量。
如果固醇基团的量过低，那么脂质溶液中脂质囊泡不会展开形成脂质 双层，或者会形成不稳定的脂质双层。如果物体上固醇基团的量过高，则 在物体上仅会形成脂质单层而非脂质双层，或者形成的脂质双层中较低的 层(lowerlayer)不是流动的层。
一般来说，物体表面上固醇基团的量将比反应性基团A的量低，因为 反应性基团A是不稳定的并且一部分反应性基团A会随时间而消失。
采用固醇基团对反应性基团A活化的物体的温育时间是重要的。固醇 基团必须具有足够的时间来与反应性基团A反应。在室温下，固醇基团的 温育时间为优选地在0.25和4小时之间、更优选地在0.5和3小时之间、 最优选地在0.75和2.5小时之间。
根据本发明的方法，经固醇基团活化的物体与脂质溶液接触，以形成 脂质双层。因为固醇基团存在于物体的整个表面上，所以脂质双层将围绕 整个物体存在。根据本发明的方法的一个优点是脂质双层紧密地跟着物体 的表面。以这种方式，也可以用脂质双层涂布具有复杂结构的物体。
脂质溶液可以是合成的或天然存在的脂质和两亲性分子(例如磷脂、 鞘脂、神经酰胺和固醇)的溶液。脂质溶液可以包含囊泡、脂质体、胶束 和单层或双层膜片段。脂质溶液还可以包含跨膜蛋白、外周膜蛋白、肽和 糖脂。可以使用不同脂质的混合物。合适的脂质的具体实例为磷脂，其可 以是天然的或合成的。天然的磷脂衍生物是例如卵磷脂酰胆碱(PC)、卵磷脂 酰甘油(PG)、大豆PC、氢化大豆PC和鞘磷脂。
合成的磷脂衍生物的实例为：
ο磷脂酸衍生物，例如1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸盐/酯 (1，2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate)(DMPA)，1，2-二棕榈酰基-sn-甘油 -3-磷酸盐/酯(1，2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate)(DPPA)，1，2-二硬酯 酰基-sn-甘油-3-磷酸盐/酯(1，2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphate)(DSPA)
ο磷脂酰胆碱衍生物，例如1，2-二癸酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱 (1，2-Didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DDPC)，1，2-二月桂酰基-sn- 甘油-3-磷酰胆碱(1，2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DLPC)，1，2- 二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱 (1，2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DMPC)，1，2-二棕榈酰基-sn- 甘油-3-磷酰胆碱(1，2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DPPC)，1，2- 二硬酯酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(1，2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) (DSPC)，1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱 (1，2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DOPC)，1-棕榈酰基-2-油酰基 -sn-甘油-3-磷酰胆碱(1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) (POPC)，1，2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱 (1，2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DEPC)
ο磷脂酰甘油衍生物，例如1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3[磷酸-外消旋 -(1-甘油)(DMPG)，1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3[磷酸-外消旋-(1-甘油)(DPPG)， 1，2-二硬酯酰基-sn-甘油-3[磷酸-外消旋-(1-甘油)(DSPG)，1-棕榈酰基-2-油酰 基-sn-甘油-3[磷酸-外消旋-(1-甘油)](POPG)
ο磷脂酰乙醇胺衍生物，例如1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (DMPE)，1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)，1，2-二硬酯酰基-sn- 甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)，1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)
ο磷脂酰丝氨酸衍生物，例如1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸丝氨酸 (DOPS)
οPEG磷脂衍生物，例如(mPEG-磷脂，聚甘油-磷脂，官能化的-磷脂， 末端活化的-磷脂)，以及
οN-[1-(2，3-二油基氧)丙基]-N，N，N-三甲基铵甲基硫酸盐 (N-[1-(2，3-Dioleoyloxy)propyl]-N，N，N-trimethylammoniummethyl-sulfate) (DOTAP)。
每个磷脂具有一个亲水性头和两个疏水性尾。当磷脂暴露于水时，它 们自身排列成两层的片(双层)，其中它们所有的尾指向片的中心。这种 双层的中心几乎不含水，并且不包括溶于水但不溶于油的分子如糖或盐。
在给定的温度下，脂质双层可以存在于液相中或凝胶(固)相中。所 有的脂质均具有特征温度，在特征温度时它们从凝胶转化(熔化)成液相。 在这两相中，脂质分子被阻止改变穿过该双层，但在液相双层中，给定的 脂质会与其相邻的分子以每秒成千上万次的速度交换位置。与液相双层不 同，凝胶相双层中的脂质被锁在适当的位置。
尽管脂质尾主要调节双层的相性质，但决定双层表面化学性的是脂质 的头基团。在磷脂中，最常见的头基团是磷脂酰胆碱(PC)。磷脂酰胆碱 是两性离子头基团，因为它在磷酸盐/酯基团上具有负电荷并且在胺上具有 正电荷，由于它们的局部电荷平衡，在生理pH下不存在净电荷。在生理 pH下不具有净电荷的头基团的另一个例子是磷脂酰乙醇胺。
其他头基团，例如磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰甘油，在生理pH下 携带负电荷。
由于它们的两性性质，优选地使用磷脂酰胆碱衍生物；更优选地，使 用磷脂酰胆碱衍生物1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)、1，2-二棕 榈酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)和1，2-二硬酯酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱 (DSPC)。
溶剂通常是水性溶液，例如水性缓冲溶液或盐溶液。
脂质双层可以是被交联的。脂质双层的交联可以在UV光下实现。这 引发包含例如二烯酰基(Den)、联乙炔(Diyne)、山梨酰(sorbyl)(Sorb) 或丙烯酰的脂质的光聚合。这些脂质的实例为双-DenPC、单-DenPC、单 -SorbPC和双-SorbPC、Diyne磷脂酰乙醇胺(PE)。额外的交联的也可以经由 如下实现：使用经脂肪酸修饰的脂质，例如联乙炔脂质如1，2-双(10，12-二十 三碳二炔酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (1，2-bis(10，12-tricosadiynoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)，或者双 植烷酰脂质(diphytanoyllipid)例如1，2-二-O-植烷-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺 (1，2-di-O-phytanyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)。
在根据本发明的方法的下一步中，脂质双层与包含至少一个疏水性尾 的肽接触。肽是通过肽键连接的氨基酸单体的短链，当一个氨基酸的羧基 与另一个氨基酸的氨基反应时形成共价化学键。从尺寸来看，肽与蛋白质 不同，并且肽包含约50个或更少的氨基酸。肽可以例如被选自蛋白质重组 或蛋白质的片段。肽优选地为纤维连接蛋白衍生的肽；更优选地RGD或 PHSRN。RGD是精氨酰甘氨酰天冬氨酸的简称，其是由L-精氨酸、甘氨酸 和L-天冬氨酸构成的一种三肽。PHSRN是肽序列Pro-His-Ser-Arg-Asn的简 称。其中Pro、His、Ser、Arg和Asn是氨基酸的简称并且Pro是脯氨酸， His是组氨酸，Ser是丝氨酸，Arg是精氨酸并且Asn是天冬酰胺。肽包含 至少一个疏水性尾、优选地一个或两个疏水性尾。疏水性尾的实例为棕榈 酰基、肉豆蔻酰基、香叶草基、法呢基、糖基、磷脂酰基和肌醇基团。优 选地，肽包含至少一个棕榈酰基疏水性尾。更优选地，肽包含一个或两个 棕榈酰基疏水性尾。一个或多个疏水性尾与脂质双层的疏水性内部相连。 申请人相信，与脂质双层相连的肽会影响细胞附着并且会影响与支撑脂质 双层的物体接触的细胞的细胞功能。
包含疏水性尾的肽也可以与脂质溶液混合，与脂质溶液一起，与经固 醇基团修饰的物体接触。
在一个优选的实施方式中，根据本发明的方法包括如下步骤：
-提供具有表面的由聚己内酯制成的物体，
-用含氧的RF等离子体或冷等离子体处理物体的表面，以提供具有反 应性基团A的物体的表面，
-使固醇基团包括胆固醇共价附着于低聚(乙二醇)间隔与反应性基团 A进行反应，
-将用胆固醇基团活化的物体与包含磷脂酰胆碱衍生物的脂质溶液接 触，以形成脂质双层，
-并且将脂质双层与包含一个或两个棕榈酰疏水性尾的肽RGD或 PHSRN接触。
在另一个实施方式中，本发明还涉及支撑脂质双层的物体，其包含：
-物体，其包含聚酯材料，
-固醇基团，其经由间隔共价附着于聚酯材料，
-脂质双层，其围绕共价附着于聚酯材料的固醇基团，以及
-包含至少一个疏水性尾的肽，其附着于脂质双层。
在根据本发明的物体中，聚酯优选地为聚己内酯。间隔可以选自本文 中所讨论的间隔。间隔优选地包含低聚(乙二醇)。低聚乙二醇优选地包含1 至20个乙二醇单体单元、更优选地2-10个单元、最优选地2-6个单元。脂 质双层可以包含上文中所讨论的任意脂质。脂质双层优选地包含磷脂、更 优选地磷脂酰胆碱衍生物、更优选地DOPC。包含至少一个疏水性尾的肽 优选地包含至少一个棕榈酰基疏水性尾。肽优选地是纤维连接蛋白衍生的 肽；更优选地RGD或PHSRN；最优选地，肽是棕榈酰化的RGD或PHSRN。
根据本发明的支撑脂质双层的物体可以被用于组织工程中，在组织工 程中需要特定的细胞相互作用，从而使适当的组织形成成为可能。组织工 程发生在采用本发明的方法生产的支撑脂质双层的物体上。组织工程可以 发生在体内、体外或离体。本发明能够使物体的本体材料的性质与表面细 胞应答互不相干。结果是，该物体能够同时处理可植入材料的生物惰性并 提供可定制的细胞相互作用。通过改变双层的组成，可以影响物体上双层 的状态(液态或凝胶，带正电、负电或不带电)。这也将会影响双层表面 上的细胞粘附和细胞生长。因此，通过改变双层的组成，可以影响并操纵 物体上的组织工程。
组织工程的一个例子是组织再生，其中培养软骨、血管或心脏瓣膜用 于移植目的。
根据本发明的物体还具有抗结垢性质。
下面将通过如下实例的方式来阐明本发明，但本发明并不限于这些实 例。
附图
图1示出了(purpald染色(Purpaldstaining)后)等离子体能量对醛基形 成的影响。
图2示出了三类本来的聚合物(PCL、PA和PG)的可感知的(sensile) 接触角，用含氧等离子体处理后的接触角，以及用胺封端的胆固醇基团温 育(incubation)后的接触角。
图3示出了在3DPCL物体上脂质双层的FRAP分析。
实施例
实施例I：固醇基团的合成
基于文献合成胺封端的胆固醇基团。
向1.0摩尔当量i(n-Boc-2，2′-[亚乙基二氧]二乙胺，Sigma-Aldrich)和 1.1摩尔当量ii(胆固醇氯甲酸酯，Sigma-Aldrich)在无水甲苯中的搅拌中 的溶液中，添加1.5摩尔当量的DIPEA(二异丙基乙胺，Sigma-Aldrich)和催 化量的DMAP(4-二甲氨基吡啶，Sigma-Aldrich)。将反应混合物在氩气气氛 下回流17小时。随后，在减压下去除溶剂，以获得油状残余物。使用40％ 乙酸乙酯+60％己烷作为洗脱剂(Rf＝0.22)进行闪蒸柱色谱法。在减压下去 除溶剂，并且发现产物iii，其为米白色粘渣。ESI-TOF：计算的[M]+661， 发现的[M]+为661。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：5.37(t，1H，烯族H)，5.25(t，1H，NH)，5.1(t， 1HNH)，4.5(m，1H，O-CH胆固醇)，3.61(s，4H，O-CH2-CH2-O)，3.55(m，4H， 2xO-CH2)，3.37(m，4H，2个CH2NH中的CH2)，2.5-0.87(34H，胆固醇)，1.5(s， 9HBOC叔丁基)，0.86(d，6H2xCH3胆固醇)，0.68(s，3H，1xCH3胆固醇)。
将产物iii溶解于二氯甲烷中并以逐滴的方式添加到搅拌的4摩尔当量 TFA(三氟乙酸)在二氯甲烷的溶液中。在持续搅拌下在室温下23小时后 获得脱保护。使用TLC监测脱保护。在减压下去除溶剂，并且将残余物溶 解于二氯甲烷中，并用TEA(三乙胺)中和。使用1％NH3(水性)溶液(25％NH3在水中)、9％MeOH和90％氯仿(Rffrac13-16＝0.38，Rffrac17-35＝0.24)，进行 闪蒸柱色谱法。去除溶剂后，获得黄色粘稠残余物(产率76.3％)。将经纯 化的产物贮存在-20℃直到进一步使用。
ESI-TOF：计算的[M+H]+561，发现的[M+H]+为561。
1HNMR(300MHz，CDCl3)：5.37(t，1H，烯族H)，5.25(t，1HNH)，4.5 (m，1H，O-CH胆固醇)，3.61(s，4H，O-CH2-CH2-O)，3.56(m，4H，2xOCH2)， 3.52(t，2H，NH2)，3.37(m，2H，CH2NH中CH2)，2.89(t，2H，CH2NH2)，2.5-0.87 (34H，胆固醇)，0.86(d，6H，2xCH3胆固醇)，0.68(d，3H，1xCH3胆固醇)。
实施例II：聚己内酯的活性氧处理
使用PlasmaprepII(SPI供应)，用氧等离子体处理(OPT)处理聚己 内酯(PCL)十秒(10s)。这是RF等离子体处理。所使用的PCL是由溶剂氯 仿浇筑的PCL片，Mn45000Da(Sigma)。
在样品处理之前，清洗运行20分钟以清洗腔室。在200mTorr的真空 压强下使用能量400J的电磁辐射进行等离子体处理。
如薄层色谱(TLC)中针对醛的Purpald染料的紫色褪色所示，这足以 生成醛基。使用X射线光电子能谱(XPS)和IR-光谱进一步证实了醛基的生 成。QuanteraSXM(从PhysicalElectronics获得的扫描XPS微探针)表明携 带氧的基团增加，尤其是O-C＝O和-C＝O增加。此外，通过对比具有衰减 全反射的傅里叶变换红外光谱(FTIR-ATR；金刚石)与偏振调制红外反射吸 收光谱(PM-IRRAS)，排除本体聚合物修饰。仅在PM-IRRAS中旋涂金样品 上肩峰出现在羰基区域，该肩峰在ATR谱中未被观察到。由于样品深度不 同，ATR金刚石5μm和PM-IRRASnm尺度，得出了氧等离子体处理的表 面约束的结论。
采用具有不同能量的电磁辐射重复等离子体处理。图1中给出这些实 验的结果。图1明显表明在本实验条件下，对于PCL的处理来说，在400J 处电磁辐射能量是最佳的。
实施例III：表面修饰
将根据实施例II的经OPT修饰的聚己内酯片与1mM的胺封端的胆固 醇基团在乙醇中接触。接触在室温下持续1小时，同时摇动溶液。在新制 备的NaBH4溶液(Sigma)中，即100mg在10mL乙醇和40mL1x磷酸盐缓 冲盐溶液(PBS，Sigma)中，直接还原经修饰的己内酯片。在该实例和实施例 IVa中，PBS是由如下制备的：PBS小块(Sigma)在200mL的去离子水中的 溶液以得到0.01M磷酸盐缓冲盐溶液，以及0.0027M氯化钾和0.137M氯 化钠；在25℃下pH7.4。随后，用milliQ漂洗样品，以去除盐，并将样 品在乙醇中进行短暂超声处理，以去除所吸附的连接物(linker)，并且在 氮气流下干燥。
使用飞行时间次级离子质谱(TOF-SIMS)(Waters-MicromassLCT)和接 触角测量，来评价氧等离子体处理后形成的醛基是否能够与胆固醇基团反 应
对比使用400J能量电磁辐射用氧等离子体(OPT)处理的三种不同的生物聚合物的表面修饰。所测的生物聚合物为聚己内酯(PCL，Mn＝45kDa)、聚(环氧乙烷对苯二甲酸酯)和聚对苯二甲酸丁二酯的多段嵌段共聚物(PA，1000/70/30)以及聚乳酸和聚己内酯的嵌段共聚物(PG，PLA65/PCL35)。如上文所描述，在用OPT处理后，将样品用胺封端的胆固醇基团温育1小时。在OPT处理和用胺封端的胆固醇基团温育后，确定可感知的接触角。
确定接触角的方法如下：
使用Krüss接触角测量系统G10测定可感知的水接触角。将用于接触 角测量的样品水平放置，待测的一侧面向上。使用自动进样器将水滴(30μL 蒸馏水滴或超纯milliQ水滴)放置于表面上。在5秒的时间内将水滴成像。 通过使用软件拟合，推导出样品表面的可感知的水接触角。在多个位置(＞ n＝3)对样品进行测定，以确保得到水接触角的可靠值。
图2表明本来聚合物(PCL、PA和PG)接触角、用OPT处理后的接 触角以及用胺封端的胆固醇基团温育后的接触角。用OPT处理后接触角变 得更低，这意味着表面变得更亲水。用胺封端的胆固醇基团温育后，聚合 物的表面再次变得更加疏水性。
在用OPT处理后再次确定PG聚合物的接触角。在表1中所示的各种 时间后确定接触角。还确定了BSLB的流动性质。如上文所述，进行用胺 封端的胆固醇基团温育。如下文的实施例IVa中所描述，实施形成脂质双 层的方法。如下文的实施例IVb中所描述，通过FRAP分析来确定脂质双 层的流动性的量。这些实验的结果被用来确定哪些时间量下反应性基团A 存在于PG聚合物表面上。表1表明在OPT处理水储存(室温下)约92小 时的时间后，接触角依然很低。空气下储存(室温下)后，接触角在约2 小时时依然很低。因此，在该时间框架内，固醇基团可以附着于反应性基 团A，以形成空气稳定的脂质双层(rBSLB)。
使用PA(1000/70/30)的类似的稳定性实验表明反应性基团A(醛基)的稳定性低得多，并且优选地在PA-物体的表面活化后5分钟内发生醛基与固醇基团反应(参见表1)。
表1：表面上的反应性基团A
实施例IV：
a.脂质双层的形成
通过在Avanti极性脂质挤出机上经由100nm聚碳酸酯膜挤出(11次) 多层囊泡(MLV)的溶液，来制备大型单层囊泡(LUV)。MLV溶液是从Avanti PolarLipids获得的1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DOPC)的溶液。通过 使再水化的脂质饼在新鲜的milliQ(18MΩ)中以1mg/mL涡旋，来生成 DOPC的MLV。通过从有机溶剂干燥99.8摩尔％DOPC和0.2摩尔％Oregon Green或TexasRed-1，2-棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DHPE，Invitrogen) 来制备脂质饼。在氮气流下干燥饼，然后在真空下干燥1小时。将根据实 施例II的经OPT修饰的聚己内酯片和根据实施例III的经OPT修饰和胆固 醇修饰的聚己内酯片用0.5mg/mL在PBS中的LUV稀溶液处理。在大于所 使用的脂质的Tm(对于DOPC来-20°)的温度下，用LUV溶液对片温育 45分钟，以允许囊泡吸附并发生破裂。任选地，为了进一步确保得到高产 率的破裂囊泡，在初始温育后采用在-80℃下的冷冻步骤。在1x磷酸盐缓 冲盐溶液(PBS，Sigma)中充分洗涤后，如PCL片的荧光成像所示，得到了在 PCL上的荧光标记的双层。
如力谱所确定的，在物体上形成的DOPC层的厚度为4.1nm+/-0.7nm。
b.FRAP，光致漂白后的荧光恢复
根据实施例IVa形成的DOPC脂质双层证明了在PCL支撑上是流体的。 观察到一定数量的荧光脂质被漂白后发生扩散(所谓的“恢复”)，由此 推导出流动性。
在图3中，双层由用0.2摩尔％OregonGreenDHPE掺杂的DOPC组成， 并且是使用100nmLUV制备的。a，使用单组分拟合得到的拟合的CSLM FRAP恢复曲线，R20.999207。发现扩散系数为1.016μm2/s±0.012，并且 流动分数(mobilefraction或mob.fr.)＞95％。在漂白和收集(acquisition) 时，ROI、Tot和BG区域具有24μm的ω。插图表明了在单FRAP测量中 以900ms的时间间隔使用600次迭代的完整的恢复曲线。示出了b，漂白前、 c，漂白后和d，15分钟后的落射荧光(Epi-fluorescence)图像，比例尺200μm。 此处，关闭视场光阑，以在单个纤维上漂白130μm点，从而定量评估荧光 层随后的扩散。
根据上文所描述的方法，在用OPT处理然后用胺封端的胆固醇基团分 别温育1小时、2小时或3小时的PCL片上形成脂质双层。以下表2中的 结果表明，通过OPT处理并组合用胺封端的胆固醇基团温育，可以形成流 动分数＞90％的空气稳定的脂质双层(rBSLB)，移动分数由FRAP分析确定。 当用胺封端的胆固醇基团温育持续3小时时，可以看出，空气稳定的脂质 双层的流动分数降低至约50％。在未处理的PCL片上以及在仅用OPT处理 的PCL片上，没有形成空气稳定的脂质双层。
表2：脂质双层
c.rBSLB蛋白质和细胞结垢
采用根据实施例II、III和IVa中所描述的方法形成的DOPC脂质双层 修饰0.5x0.5cm2的PCL膜(Sigma)的一侧，而另一侧保持不变。在室温下 在黑暗中，用经Dylight488(ThermoScientific)修饰的牛血清白蛋白(BSA， Sigma)温育这些膜。该温育和在SDS溶液中蛋白质解吸附1小时后，测定 BSA-Dylight488的含量，来确定经修饰的PCL膜的不结垢性质。在涂覆双 层后，总蛋白质吸附降低约50％。可以预期的是，该下降是由于两性离子 脂质双层的不结垢性质引起的。由于只处理了总表面的一半，因此可以推 论甚至在样品依此脱水和再水化(即1次、2次或3次)后仍得到高度的耐 蛋白质性(约100％)。通过去除物体表面上的所有液体并使其干燥30分 钟，来进行一次脱水循环。之后，加入PBS，来使脂质双层再水化，所有 操作在室温下进行。
用PBS中的底物温育与DyLight488共轭的BSA。在SDS溶液中解吸 附后，用酶标仪(platereader)确定吸附的蛋白质的量。插图表明，在DMEM 中BSA的吸附数据，没有FBS。相对蛋白质吸附以平均值±SD(n＝3)表示， 并使用事后图基试验法(post-hocTukey，*p＝＜0.05)采用1-wayAnova进行 比较。
rBSLB＝通过在物体上涂覆DOPC脂质所形成的脂质双层
PCL＝聚己内酯
表3|BSA吸附
BSA吸附图表明了脂质双层对PCL物体的附着是稳定的。即使在样品 再水化和脱水3次后，BSA吸附也没有发生改变。此外，在脂质双层上没 有发生BSA外的蛋白质结垢。这意味着，脂质双层也保护该物体避免其他 形式的生物结垢。
d.BSLB上的蛋白质结垢
为了深入了解BSLB的不结垢性能，进行蛋白质吸附试验。此处，制 备并使用荧光标记的BSA，来确定吸附到样品表面的蛋白质的量。简言之， 用BSA温育n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化的Dylight-488，并使用旋转柱 按照制造商(ThermoScientific)提供的方案进行纯化。用50μg/mLBSA 缀合物在PBS中对0.5x0.5cm2的经BSLB修饰的PCL膜(Sigma)温育20分 钟。随后使用PBS洗涤，确保结合很弱的蛋白质被去除。在室温下将吸附 的蛋白质在SDS溶液中脱附1小时，并使用酶标仪(Victor，Perkin-Elmer)和 标准曲线定量。在脱水的BSLB情况下，去除缓冲液，并将表面暴露于空 气。随后，添加PBS缓冲液，以使BSLB样品再水化。数据呈现于表4中， 其表明了，在形成BSLB后，吸附的蛋白质的量显著降低。
表4|BSA吸附
实施例V：棕榈酰基化的肽合成
a.棕榈酰基化的肽前体的制备
使用微波固相肽合成器(CEM)合成KGG-肽。从Multisyntech获得芴 甲氧羰酰氯(FMOC)保护的氨基酸和耦合试剂羟基苯并三唑(HOBT)和O- 苯并三唑-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)。使用Rink-酰胺树 脂和HOBT/HBTU耦合。采用标准的制造商氨基酸耦合方法。例外是，采 用初始的双偶联程序来耦合第一个氨基酸。
使用固相微波肽合成法来合成肽。
肽合成试剂(工作溶液)：
溶剂：N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)
树脂：Rink酰胺(MultisynthTechnology)
脱保护溶液：在NMP中0.1MHOBT，20％哌啶
活化剂：在NMP中0.5MHBTU
活化剂碱：在NMP中2.0MDIPEA
氨基酸：在NMP中的0.3MHOBT，0.2M的氨基酸
氨基酸单耦合：
1.用NMP洗涤树脂
2.添加脱保护剂，10.0mL。
3.微波步骤；35瓦特，最大T～40℃，～40秒
4.用NMP洗涤树脂
5.添加脱保护剂10.0mL
6.微波步骤，35瓦特，最大T～79℃，～3分钟
7.用NMP洗涤树脂
8.添加氨基酸5.0mL
9.添加活化剂2.0mL
10.添加活化剂碱1.0mL
11.微波步骤；.Ser，Asp，Gly：25瓦特，最大T～79℃，～5分钟
12.洗涤NMP
氨基酸双耦合：
1.用NMP洗涤树脂
2.添加脱保护剂，10.0mL.
3.微波步骤；，35瓦特，最大T～40℃，～40秒
4.用NMP洗涤树脂
5添加脱保护剂10.0mL
6.微波步骤；35瓦特，最大T～79℃，～3分钟
7.用NMP洗涤树脂
8.添加氨基酸5.0mL
9.添加活化剂2.0mL
10.添加活化剂碱1.0mL
11.微波步骤；
Arg；0瓦特，最大T～79℃，～30分钟
Lys；25瓦特，最大T～79℃，～5分钟
12.添加氨基酸5.0mL
13.添加活化剂2.0mL
14.添加活化剂碱1.0mL
15.微波步骤；.
Arg；25瓦特，最大T～79℃，～5分钟
Lys：25瓦特，最大T～79℃，～5分钟
16.用NMP洗涤树脂
使用N-末端KGG-Rn来耦合N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化棕榈酸。 根据文献方法制备NHS-棕榈酸盐。在0℃下搅拌1∶1∶1摩尔当量的棕榈酸 (Sigma)、NHS(Sigma)和N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC，Sigma)1小时，并 在室温下在THF中放置过夜。过滤反应溶液，并通过在热甲醇中重结晶的 方式纯化产物。
IR分析表明，对于棕榈酸来说，烷烃的C-H伸缩在2912和2848cm-1处，酸的O-H和-C＝O伸缩在2500-3300cm-1和1700cm-1处。NHS-棕榈 酸盐的峰如下：烷烃，-C-H：2912和2848cm-1；酯，-C＝O：1821cm-1和-C-O-N： 1071cm-1；琥珀酰亚胺，对称的C＝O：1784cm-1，不对称的C＝O：1731cm-1并且不对称的C-N-C：1212cm-1。
b.单棕榈酰基化的肽和双棕榈酰基化的肽的制备
肽合成完成后，进行最终的脱保护步骤，以得到“游离”(‘free’)N- 末端胺，使赖氨酸侧基处于受保护状态。在树脂上，使肽与10摩尔当量的 在DMF中的NHS-棕榈酸盐和少量N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)反应。使 NHS-棕榈酸盐反应5小时。在如下文实施例Va所描述根据制造商用法说 明使用微波固相肽合成器(CEM)在TFA/TIS/水95/2.5/2.5中进行微波分 裂后，使用DMF和DCM多次洗涤树脂。二乙醚沉淀后，用HPLC纯化肽 缀合物并冻干。使用梯度补充0.1％TFA的乙腈和水进行HPLC纯化。使用 ES+，可以发现纤维连接蛋白衍生物的[M+H]+和[M+H]2+峰。使用经冻干、 纯化的“单棕榈酰基化的”(‘monopal’)肽，进行第二NHS-棕榈酸盐与 赖氨酸残基的“游离”胺的耦合。反应以10倍摩尔过量的NHS-棕榈酸盐 在DSMO/DIPEA中进行。使用ES+监测反应，并在4小时后在单棕榈酰基 化的峰消失时停止反应。用二乙醚多次洗涤粗产物，以去除未反应的NHS- 棕榈酸盐。用milliQ稀释DMSO级分并冻干。
实施例VI：细胞实验，间充质干细胞
使用采用两种不同脂质双层的官能化的PCL膜。根据实施例IVa中所 描述的方法获得经官能化的PCL膜。为了测试脂质双层的性能，选择棕榈 酰基化的RGD肽作为细胞粘附的模型体系。此处，双层与高浓度的肽(10 摩尔％)接触，并且比较脂质横向流动对细胞表现的影响。在图中，所得到 的细胞尺寸以及细胞面积是在温育两小时后推导出的。在涂覆刚好够的 DOPC或DSPC双层后，细胞数目降低。然而，在采用RGD肽掺合后，细 胞数增加。当选择RGE对照肽时，抑制细胞粘附。然而，对于凝胶状态的 脂质(DSPC)来说，细胞面积显著更高。
表5|细胞粘附
BSLB＝通过在PCL膜上涂覆DOPC脂质(液态BSLB)或DSPC脂 质(凝胶态BSLB)所形成的脂质双层
PCL＝聚己内酯
以每cm25000个细胞的密度在基础培养基中接种永生化的间充质干细 胞(iMSCs)2个小时，并30分钟后洗涤，以去除弱粘着细胞。
表6|细胞应答
为了更详细地研究横向流动性(1ateralmobility)的影响，在生脂培养 基(以促进脂肪细胞的形成)和在生骨培养基(以促进骨细胞的形成)中， 培养iMSCs一周的时间(二者均充分补充)。已经描述了，脂肪细胞的分 化在软表面上得到促进，而骨分化在刚性支撑物上得到促进。据推测，流 动的配体(液态BSLB)会使材料变软，而不流动的(凝胶态BSLB)使其 变硬。为了评估骨生成，对于DNA含量，测量并纠正ALP。此外，在此之 前，增殖试验能够使我们更深入了解用于测量脂肪生成的OilORed样品的 细胞密度。
可以注意到，液态BSLB促进脂肪生成而凝胶态BSLB促进骨生成。