《仿生多孔微球组织工程支架及其制作方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《仿生多孔微球组织工程支架及其制作方法.pdf（8页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 CN 101766837 B (45)授权公告日 2013.03.27 CN 101766837 B *CN101766837B* (21)申请号 200910243568.5 (22)申请日 2009.12.28 A61L 27/26(2006.01) A61L 27/24(2006.01) A61L 27/20(2006.01) A61L 27/56(2006.01) (73)专利权人 中国人民解放军第二炮兵总医院 地址 100011 北京市西城区新街口外大街 16 号 (72)发明人 王佃亮 姜合作 (74)专利代理机构 北京东正专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 11。
2、312 代理人 刘瑜冬 CN 1394655 A,2003.02.05,说明书第1页第 5 段至第 2 页第 8 段 . CN 101066477 A,2007.11.07, 实施例 1. (54) 发明名称 仿生多孔微球组织工程支架及其制作方法 (57) 摘要 本发明公开了仿生多孔微球组织工程支架及 其制作方法， 该支架是模仿天然细胞外基质制作 的微球， 直径为 100m 500m， 表面分布有细 胞孔和物质交换孔， 内部具有相互联通的三维网 络结构， 应用时， 借助于特制模具或组织工程反应 器， 由一定数量的这种支架构成肉眼可见的各种 支架。 该支架由天然生物材料胶原和壳聚糖构成， 其制作。
3、包括以下步骤 ： (1)将810的胶原乙 酸分散液和壳聚糖乙酸分散液按一定比例混合 ； (2) 将 (1) 步所得混合液与含 6 8 Span 85 的液体石蜡混合 ； (3) 将 (2) 步所得混合液按体 积比为 1 5 加入到液体石蜡中， 然后剧烈搅拌， 用戊二醛交联， 制得该组织工程支架粗品 ； (4) 将 (3) 步所得分别用蒸馏水、 异丙醇、 乙醚、 无水乙 醇洗涤， 经过筛选获得组织工程支架成品。 本发明 可作为一种组织工程支架， 能抑制干细胞生长发 育过程中的致瘤倾向， 促进血管、 神经再生， 并且， 降解吸收速率与组织器官形成相适应。 此外， 还可 用于可注射组织工程支架， 组。
4、织工程用种子细胞 的大量扩增， 或治疗用干细胞转移的载体。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李涛 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 仿生多孔微球组织工程支架， 其特征在于， 该支架是由天然生物材料胶原和壳聚糖 制成的微球， 直径为 100m 500m， 表面分布有孔， 内部是相互联通的三维网络结构， 内 部具有 60% 以上的空体积。 2. 根据权利要求 1 所述仿生多孔微球组织工程支架， 其特征在于， 微球表面分布有两 种类型的孔，。
5、 即大直径的细胞孔， 在生理盐水中的孔直径 10m， 供细胞钻入或进入微球 内部生长发育 ； 小直径的物质交换孔， 在生理盐水中的孔直径 10m， 供微球内的细胞与 微球外的环境之间进行物质交换。 3. 根据权利要求 1 所述仿生多孔微球组织工程支架， 其特征在于， 组成支架的材料是 胶原 / 明胶与壳聚糖 / 壳聚糖衍生物的混合。 4. 根据权利要求 1 所述仿生多孔微球组织工程支架， 其特征在于， 胶原制备自哺乳动 物的筋腱或皮肤 ； 壳聚糖制备自海洋动物的皮或壳， 脱乙酰度 90% 以上。 5. 根据权利要求 1 所述仿生多孔微球组织工程支架， 其特征在于， 支架中胶原和壳聚 糖比例为 。
6、20 80。 6. 仿生多孔微球组织工程支架的制作方法， 其特征在于， 该方法包括以下步骤 ： （1） 将胶原乙酸分散液和壳聚糖乙酸分散液混合 ； （2） 将 （1） 步所得的混合液与含 6% 8% Span 85 的液体石蜡混合 ； （3） 将 （2） 步所得混合液按体积比 1 ： 5 加入液体石蜡中， 剧烈搅拌 ， 用戊二醛交联， 制 得仿生多孔微球组织工程支架粗品 ； （4） 将 （3） 步制得的仿生多孔微球组织工程支架粗品分别用蒸馏水、 异丙醇、 乙醚、 无水 乙醇洗涤去除乙酸和液体石蜡后冷冻干燥， 经过不锈钢筛子筛选， 获得仿生多孔微球组织 工程支架成品。 7. 根据权利要求 6 所。
7、述的仿生多孔微球组织工程支架的制作方法， 其特征在于， 胶原 乙酸分散液和壳聚糖乙酸分散液分别是将胶原和壳聚糖各溶于1%乙酸， 形成浓度为8 % 10 % 的分散液。 8. 根据权利要求 6 所述的仿生多孔微球组织工程支架的制作方法， 其特征在于， 上述 步骤 （2） 中， 胶原壳聚糖混合液与含 Span 85 的液体石蜡混合的比例为 2.1:1 2.7:1。 9. 根据权利要求 6 所述的仿生多孔微球组织工程支架的制作方法， 其特征在于， 上述 步骤 （3） 中， 交联用戊二醛的浓度为 0.25% 2.5%， 交联时间为 1h 2h， 交联温度为 25。 10. 根据权利要求 6 所述的仿生。
8、多孔微球组织工程支架的制作方法， 其特征在于， 上述 步骤 （4） 中， 异丙醇、 乙醚、 无水乙醇洗涤对工程支架粗品的洗涤次数不少于 3 次。 权 利 要 求 书 CN 101766837 B 2 1/4 页 3 仿生多孔微球组织工程支架及其制作方法 技术领域 0001 本发明属于生物医学材料领域， 特别是涉及一种仿生多孔微球组织工程支架， 该 支架在临床上可用于 ： 仿生组织工程支架， 用于干细胞三维培养再生各种组织器官， 供临 床移植 ； 组织工程用种子细胞的大量扩增 ； 可注射组织工程支架或治疗用干细胞转移 的载体。 背景技术 0002 利用干细胞组织工程技术再生人体组织器官(如皮肤、。
9、 血管、 肝脏等)是解决目前 临床上以 “损伤修复损伤” 和可供临床移植器官严重短缺难题的重要途径。组织工程支架 (tissue engineering scaffold) 是一种细胞外基质替代物， 是组织工程的基础。它是根 据材料用于不同人体组织及具体替代组织具备的功能所设计的。 现有支架材料可分为三大 类 ： 天然生物材料， 如明胶、 琼脂糖、 藻酸盐等 ； 合成有机材料， 如聚乙烯醇、 聚羟基乙 酸、 乳酸 - 羟基乙酸共聚物 (PLGA) 等 ； 无机材料， 如羟基磷灰石、 生物陶瓷、 生物玻璃等。 其中天然生物材料具有本身包含着生物信息、 能够促进和维持细胞生长发育、 生物相容性 好。
10、、 可在体内降解吸收以及来源广泛等优势， 是今后组织工程支架材料发展的趋势。 0003 在众多组织工程支架中， 多孔支架较普通支架具有更多优越性， 更适合于细胞 三维培养 ( 陈彦彦等 . 壳多糖组织工程支架材料的制备及其应用 . 吉林大学学报 ( 医 学版 )， 33(5) ： 867-870， 2007)。现有多孔支架尚具有以下缺陷 ： 形状不规则， 主要是 片 状 (Xinetal.Continuingdifferentiation of human mesenchymal stem cells and inducedchondrogenic and osteogenic lineage。
11、s in electrospun PLGAnanofibers caffold.Biomaterials， (28) ： 316-325， 2007)、 块状 (et al.Evaluation of RGD-or EGF-immobilized chitosanscaffolds for chondrogenic activity. International Journal ofBiological Macromolecules， (43) ： 121-128， 2008)、实 心 微球状 (Blaker et al.Novel fabrication techniques to prod。
12、ucemicrospheres by thermally induced phase separation for tissueengineering and drug delivery. ActaBiomaterialia， (4) ： 264-272， 2008)、圆 盘 状 (Wang et al.In vitrocartilage tissue engineering with 3D porous aqueous-derived silkscaffolds and mesenchymal stem cells.Biomaterials， (26) ： 7082-7094， 2005)、。
13、 管 状 (Nieponice et al.Development of a tissue-engineered vascular graft combining abiodegradable scaffold，muscle-derived stem cells and arotational vacuum seeding technique.Biomaterials， (29) ： 825-833， 2008)、 纤 维 状 (Danielsson et al.Modified collagenfleece， a scaffold for transplantation of human b。
14、ladder smoothmuscle cells.Biomaterials， (27) ： 1054-1060， 2006) 等形状， 这些形状的支架比表面积小， 不利 于细胞生长分化， 在实际应用中会有一定限制 ； 由于制作方法的原因， 支架内孔的几何结 构不利于细胞三维培养和组织再生 ； 由于支架形状不规则和内部几何结构不合理， 再生 组织中缺乏血管和神经发育的自然空间。 说 明 书 CN 101766837 B 3 2/4 页 4 发明内容 0004 本发明的目的是为了解决已有多孔支架尚具有的上述缺陷， 设计一种新型仿生多 孔微球组织工程支架来有效地解决这些问题， 并且， 制作支架时，。
15、 可通过改变支架中不同材 料的组成比例来改变组织器官形成后支架的降解吸收速率 ； 本技术方案制作的支架具有一 定的抗菌性， 有助于减少组织器官再生和移植过程中污染发生的机会 ； 本发明所述的支架 能抑制干细胞体外培养时的致瘤特性， 向正常组织器官分化。 所以， 本发明的仿生多孔微球 组织工程支架具有极好的临床应用前景。 0005 实现上述目的的本发明的技术方案为， 仿生多孔微球组织工程支架是由胶原 ( 明 胶)和壳聚糖(壳聚糖衍生物)制成， 微球直径在100m500m， 且微球表面分布有孔， 微球内部具有模仿天然细胞外基质环境而设计制作的相互联通的三维网络结构， 微球内部 具有 60以上的空体。
16、积， 上述微球表面分布有两种类型的孔， 即大直径的细胞孔， 在生理盐 水中的孔直径 10m， 供细胞钻入或进入微球内部生长发育 ； 小直径的物质交换孔， 在生 理盐水中的孔直径 10m， 供微球内的细胞与微球外的环境之间进行物质交换， 并且构建 组织工程支架的胶原和壳聚糖比例为 20 80。 0006 上述仿生多孔微球组织工程支架的制作方法， 包括以下步骤 ： (1) 将胶原乙酸分 散液和壳聚糖乙酸分散液混合 ； (2) 将 (1) 步所得的混合液与 6 8 Span 85 的液体石 蜡混合 ； (3) 将 (2) 步混合液按体积比 1 5 加入液体石蜡后剧烈搅拌， 用戊二醛交联， 制 得仿生。
17、多孔微球组织工程支架粗品 ； (4) 将 (3) 步制得的组织工程支架粗品分别用蒸馏水、 异丙醇、 乙醚、 无水乙醇洗涤去除乙酸和液体石蜡后冷冻干燥， 经过不锈钢筛子筛选， 获得 仿生多孔微球组织工程支架成品。 0007 上述步骤 (1) 中的胶原乙酸分散液和壳聚糖乙酸分散液分别是将胶原和壳聚糖 各溶于 1乙酸， 形成浓度为 8 10的分散液。 0008 上述步骤(2)中， 胶原壳聚糖混合液与Span 85的石蜡液混合的比例在2.11 2.7 1。上述步骤 (3) 中， 交联用戊二醛的浓度为 0.25 2.5， 交联时间为 1h 2h， 交联温度为 25。 0009 上述步骤 (4) 中， 异。
18、丙醇、 乙醚、 无水乙醇洗涤对工程支架粗品的洗涤次数不少于 3 次。 0010 本发明和已有的组织工程支架相比具有以下优点 ： 模仿天然细胞外基质的环 境， 胶原、 多糖都是天然细胞外基质成分， 由胶原、 壳聚糖构建的多孔微球内部的三维网络 结构类似于天然细胞外基质环境， 在其中生长发育的干细胞倾向于形成有功能的组织 ； 具有一定刚性且易于塑造成型的组织工程支架， 本发明的仿生多孔微球组织工程支架是一 种可广泛应用于不同种类组织器官再生的支架。作为一种通用性很强的组织工程支架， 它 有两个显著特点 ： 第一， 具有一定刚性， 可以很好地起到支架作用， 因为尽管单纯的胶原或 壳聚糖作为支架强度上。
19、都不尽人意， 但当胶原与壳聚糖复合时， 壳聚糖的游离氨基与胶原 的羟基之间发生交联反应， 使支架的强度提高， 同时， 壳聚糖带正电荷， 胶原带负电荷， 两者 可自然地通过静电相互作用， 进一步提高支架的强度 ； 第二， 规则的微球体， 易于塑造成型， 因为本发明的组织工程支架， 就像砖块一样， 可以在特制的模具或组织工程反应器内搭建 成不同形态的组织器官 ( 皮肤、 肝脏、 肾脏等 )， 供干细胞在其中生长发育， 这是几何形状不 说 明 书 CN 101766837 B 4 3/4 页 5 规则的一些支架无法相比的 ； 可注射性组织工程支架， 本发明的仿生多孔微球组织工程 支架， 由于是极微小。
20、的规则球体 ( 裸球直径为 100m、 200m、 300m、 400m、 500m 五 种 )， 按实际需要选择不同直径的微球接种细胞并经一段时间适应培养后， 可用注射器注射 到发生机能障碍的组织器官进行原位修复 ； 用于干细胞高效高质量扩增， 干细胞是组织 工程常用的种子细胞， 它来源有限、 数量少， 如何获得足够数量的可用于临床移植的干细胞 一直以来是个世界性难题。 本发明的仿生多孔微球组织工程支架， 由于是规则的球体， 球体 在自然界中具有最大的表面积体积比， 再加之微球内部 60以上是空的， 微球内部之间的 孔隙又是相互联通的， 这就为干细胞繁殖提供了大量空间和生长表面， 因而可进行。
21、干细胞 高效扩增。 干细胞在体外扩增时具有致瘤倾向， 如何控制好干细胞的这一特性， 直接影响到 组织工程产品的安全。本发明的仿生多孔微球组织工程支架， 主要成分是胶原和壳聚糖。 微球内外表面分布有大量纳米胶原纤维丝构成的网， 由于胶原具有非常好的细胞亲和力， 可以诱导细胞正常地黏附、 生长 ； 壳聚糖具有抗肿瘤作用， 可以抑制干细胞生长发育过程中 的致瘤倾向 ； 同时微球内部的三维立体网络结构有助于干细胞发育分化形成正常的组织器 官。因而本发明的仿生多孔微球组织工程支架生产的组织工程产品是相对安全的。在再 生组织器官中的降解吸收速度可适当调控， 作为支架材料， 胶原、 壳聚糖在再生组织器官中 。
22、的降解分别在细胞分泌的不同酶作用下进行 ； 胶原降解比较快， 壳聚糖降解比较慢， 通过调 整支架中两种材料的比例， 可以使支架降解吸收速度与组织器官形成速度相适应， 并且， 将 胶原与壳聚糖复合， 壳聚糖带正电荷， 胶原带负电荷， 两者可自然地通过静电相互作用， 胶 原的降解也因此得到延缓 ； 为血管、 神经发育预留了空间， 本发明的仿生多孔微球组织工 程支架， 当用于组织器官再生时， 需要用一定数量的多孔微球搭建成组织器官雏形， 球与球 之间具有自然形成的相互连通的三维空间， 这为血管、 神经发育预留了空间， 同时有助于球 与球之间细胞的融合生长和营养交换， 并且血管、 神经可以向任意方向发。
23、育生长， 有利于形 成有功能的组织器官。而一般组织工程支架由于支架形状不规则和内部几何结构不合理， 再生组织中缺乏血管和神经发育的自然空间 ； 支架具有一定的抗菌性， 本发明的多孔微 球组织工程支架， 由于含有具有广谱抗菌抗病毒作用的壳聚糖， 有助于减少组织器官再生 和移植过程中污染发生的机会 ； 具有纳米材料的优越性， 本发明的仿生多孔微球组织工 程支架中的胶原材料本身是由天然纳米级纤维构成的。纳米纤维具有较高的表面积与体 积比， 它可以大大增加细胞的黏附和生物相容性， 从而增加细胞的迁移、 增殖及分化功能。 所以， 本发明的仿生多孔微球组织工程支架较传统支架更适于干细胞三维培养再生组织器 。
24、官。 附图说明 0011 图 1 是本发明所述仿生多孔微球组织工程支架外观结构示意图 ； 图中， 1、 大直径 的细胞孔 ； 2、 小直径的物质交换孔。 0012 图 2 是本发明所述仿生多孔微球组织工程支架剖面图 ； 0013 图 3 是本发明所述仿生多孔微球组织工程支架制作工艺流程图。 具体实施方式 0014 下面结合附图对本发明进行具体描述， 如图 1 是本发明所述仿生多孔微球组织工 说 明 书 CN 101766837 B 5 4/4 页 6 程支架外观结构示意图， 如图所示， 仿生多孔微球组织工程支架， 是由胶原 ( 明胶 ) 和壳聚 糖 ( 壳聚糖衍生物 ) 制成， 微球直径可以为。
25、 100m、 200m、 300m、 400m、 500m， 两种 类型的孔， 即 ： 大直径的细胞孔 1， 在生理盐水中的孔直径 10m， 供细胞钻入或进入微球 内部生长发育 ； 小直径的物质交换孔 2， 在生理盐水中的孔直径 10m， 供微球内的细胞 与微球外的环境之间进行物质交换， 即微球外环境中的各种营养物质 ( 包括氧气、 生长因 子等 ) 进入微球内部， 同时内部细胞产生的代谢废物 ( 包括二氧化碳、 乳酸等 ) 进入微球外 部。图 2 是本发明所述仿生多孔微球组织工程支架剖面图， 如图所示， 构建组织工程支架的 微球内部是空的， 空体积在 60以上， 空体积越小微球的机械强度越大。
26、， 越适于用在组织器 官中承受压力大或张力强度大的地方。如皮肤的再生， 可用 60 70空体积的微球做皮 下组织再生的支架， 70 90空体积的微球做真皮组织再生的支架， 90以上空体积的 微球做表皮组织再生的支架。 再如耳朵的再生， 在特制的模具中， 沿耳朵轮廓及隆起部分使 用空体积较小的6070的微球做支架， 其他受力小的部位使用7090， 甚至90 以上空体积的微球做支架。 0015 微球内部具有相互联通的三维网络结构， 微球中胶原和壳聚糖的比例为 20 80。 0016 图 3 是本发明所述仿生多孔微球组织工程支架的制作工艺流程图， 如图所示， 制 作本发明所述仿生多孔微球组织工程支架。
27、的主要原料 ： 胶原制备自哺乳动物 ( 如猪、 牛、 羊、 马等)的筋腱或皮肤， 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示一条带 ； 壳聚糖制备自海洋 动物 ( 虾、 蟹 ) 的皮或壳， 脱乙酰度 90以上。首先， 胶原、 壳聚糖各溶于 1乙酸， 分别配 浓度为 8 10的胶原乙酸分散液、 壳聚糖乙酸分散液， 然后以一定比例混合。混合物中 胶原、 壳聚糖的质量比例因所制作支架培养的组织器官种类不同而改变 ； 比如， 当用于角膜 组织工程时， 胶原的比例可以是 20 30， 相应壳聚糖的比例可以是 70 80 ； 再比 如， 当用于软骨组织工程时， 胶原的比例可以是 40 50， 而相应壳聚糖。
28、的比例可以是 50 60； 又比如， 当用于血管组织工程时， 胶原的比例可以是 70 80， 而相应壳聚 糖的比例是 20 30。这样制得的胶原壳聚糖混合液为 A 液。 0017 含 6 8 Span 85 的液体石蜡为 B 液。 0018 将 A 液和 B 液按一定比例混合制得 C 液， 混合比因所制作微球的空体积不同而变 化 ； 比如， 当微球空体积是6070时， A、 B液之比大致可以是AB2.71 ； 当微球 空体积是7080时， A、 B液之比大致可以是AB2.31 ； 当微球空体积是80 90时， A、 B 液之比大致可以是 A B 2.1 1。 0019 将 C 液加入体积比为 。
29、1 5 的液体石蜡中， 用磁力搅拌器剧烈搅拌， 搅拌速度约为 1000rpm/min。然后在 25条件下， 用 0.25 2.5的戊二醛交联 1h 2h， 制得仿生多 孔微球组织工程支架粗品， 接着用蒸馏水反复冲洗去除没有反应的戊二醛， 然后用异丙醇、 乙醚、 无水乙醇洗涤至少 3 次， 以去除乙酸和液体石蜡， 冷冻干燥， 系列不锈钢筛子筛选， 获 得仿生多孔微球组织工程支架成品。 成品在生理盐水中溶胀后的直径为100m500m。 0020 上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案， 本技术领域的技术人员 对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理， 属于本发明的保护范围之 内。 说 明 书 CN 101766837 B 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101766837 B 7 2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 101766837 B 8 。