技术领域
本发明涉及一种注射型聚酯类微载体与纤维蛋白凝胶复合支架的制备方法。
背景技术
软骨损伤是目前常见的疾病，由于关节炎或运动创伤所造成的关节软骨损伤 给许多病人带来痛苦。软骨的代谢活跃而修复能力有限，没有血管，在损伤之 后不能形成纤维凝块，没有炎性细胞迁移进入，也没有血管未分化细胞进入损伤 的部位，所以不易自行进行修复。另外，软骨本身在损伤部位缺乏未分化的细 胞，损伤之后没有软骨细胞迁移生长到损伤的软骨之中。而且，随着年龄的增长， 软骨细胞的分裂能力逐渐降低，产生细胞外基质的能力也随之降低。迄今为止， 临床上仍然缺少有效的方法修复受损的软骨组织。应用再生医学的方法和原理 来进行软骨组织的修复是目前的一个重要手段，且取得了良好的效果。其中， 软骨修复支架在软骨再生中起着十分重要的作用。
人体的软骨属于结缔组织，其中含有少量的软骨细胞和大量细胞间质。软骨 细胞散在于软骨基质内的软骨陷窝内，陷窝周围的基质染色较深称为软骨囊。 幼稚的软骨细胞较小，常单个分布于关节软骨的边缘区，呈扁圆形。由边缘向 中央软骨细胞的体积逐渐增大，呈椭圆形或圆形，具有较明显的软骨囊。幼小 的软骨细胞可分裂，深部成熟的软骨细胞常2～8个成群分布。软骨细胞间质的 化学成分主要包括胶原蛋白、蛋白多糖和少量的非胶原蛋白。软骨组织中的胶 原主要为II型胶原，占胶原总量的90％以上。II型胶原纤维在软骨内呈三维网 状分布，为关节软骨提供抗张强度。蛋白多糖通过连接蛋白以非共价键形式与 透明质酸结合形成巨大的蛋白多糖聚合体。蛋白多糖聚合体分子链上含有丰富 的负酸根离子，可以结合大量的水形成水凝胶，为软骨提供抗压强度和弹性。 水分占软骨组织全重的75％，其中含有大量正离子以平衡蛋白多糖分子中的负 电荷，并含有许多软骨细胞所需的营养物质和细胞代谢产物。软骨组织内无血 管，但由于软骨基质富含水分，营养物质易于渗透，故软骨细胞仍能获得必要 的营养。
软骨组织中的其它非胶原蛋白如锚着蛋白、纤维粘连蛋白等通过与细胞表面 受体和其它大分子之间的相互作用将软骨细胞粘连在软骨基质上，并稳定软骨 基质的结构。
根据软骨基质成分和组织结构的不同，软骨分为透明软骨、纤维软骨和弹性 软骨。关节软骨属于透明软骨，它的特点是纤维含量比纤维软骨和弹性软骨少， 而蛋白多糖水凝胶含量相对较多，软骨基质为透明状。成熟的关节软骨根据其 细胞和基质的变化可分为浅表层、中层、深层和钙化层。其中中层和深层中的 蛋白多糖含量较高。
人体内的软骨具有极特殊的力学性能。例如关节软骨具有很好的弹性和韧 性，可承受较大的负荷，同时具有光滑的表面，使关节活动时的摩擦力极小。 软骨组织一旦缺损，将给患者带来巨大的痛苦和不便。
近年来，可注射型细胞微载体和注射型水凝胶材料由于其体内培养和微创修 复等优点而广受关注。注射型细胞微载体需要液态载体进行输运。传统的液态 载体包括甘油、明胶等。由于可注射微载体一般采用生物降解聚酯类聚合物为 基材，密度较大，因此在注射过程中易发生沉淀而影响使用。因此，液态载体 的性能仍需提高，如应具有足够的粘度或密度以确保细胞微载体在溶液中的悬 浮，并保证一定时间内不会发生沉淀。此外，单纯的细胞微载体即便能够注射 并在体内无规堆砌成型，但支架的结构松散、机械强度较低，微载体在体内可 能迁移或游走而失去形状。水凝胶是另外一类可以注射的细胞支架，且水凝胶 的前驱物均为溶液状态，极易注射，在物理或者化学刺激下在体内能够快速成 型。但水凝胶的机械强度较低，降解速度较快，导致破碎或坍塌，从而失去应 有的形状而不能继续维持细胞的生长空间。
将可注射细胞微载体与可注射水凝胶进行复合，利用液态的水凝胶前驱物为 输运载体注射到体内受损部位后，前驱物在体内快速固化形成凝胶。凝胶与微 载体形成具有一定形状和强度的复合支架。微载体被包裹在水凝胶中，从而限 制了其迁移或游走；同时，微载体与凝胶复合，相当于粒子填充复合材料，能 大大提高水凝胶的强度。此外，微载体的降解速度较慢，当水凝胶降解完全后， 微载体的堆砌仍然能够维持细胞生长的空间，球与球之间的连通孔隙便于细胞 所需营养和代谢产物的交换。因此，二者的复合可以互相弥补其缺点，具有一 定的协同作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以有效地负载微载体，防止微载体在体内游走， 同时防止细胞在种植过程中流失，生物相容性好的注射型微载体与纤维蛋白凝 胶复合支架的制备方法。
本发明的注射型聚酯类微载体与纤维蛋白凝胶复合支架的制备方法，包括 以下步骤：
1)将聚酯类聚合物溶解在二氯甲烷中，配制成浓度为50mg/ml的均匀溶液； 将此溶液加入到质量浓度为0.1～0.5％的聚乙烯醇的水溶液中，聚乙烯醇的水溶 液和二氯甲烷的体积比为5∶1，搅拌下挥发去除二氯甲烷，过滤分离出聚酯类 微球，干燥；
2)将步骤1)获得的聚酯类微球浸泡在质量浓度为6％的己二胺正丙醇溶液 中，在40℃水浴中反应3～15分钟，用去离子水充分洗涤以除去未反应的己二 胺，然后在35℃真空干燥至恒重，获得表面含有氨基的聚酯类微球；
3)将纤维蛋白原粉末溶于生理盐水中，配制浓度为10～40mg/ml的纤维蛋 白原溶液；将凝血酶溶解于氯化钙溶液中，配制浓度为20～40U/ml的凝血酶氯 化钙溶液；
4)将步骤2)获得的表面含有氨基的聚酯类微球浸入质量浓度为1％戊二醛 溶液中，4℃下反应至少3h，用去离子水冲洗去除未反应的戊二醛，获得表面含 有醛基的聚酯类微球；然后将此表面含有醛基的聚酯类微球浸入10mg/ml的纤 维蛋白原溶液中，4℃下反应至少24h，冷冻-冻干，获得表面含有纤维蛋白原 的聚酯类微载体；
5)将聚酯类微载体与纤维蛋白原溶液按质量比为3％～15％混合，在振荡器 上震荡使聚酯类微载体均匀分散在纤维蛋白原溶液中，然后将分散有聚酯类微 载体的纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液等体积均匀混合，37℃下形成凝胶，获得 注射型聚酯类微载体与纤维蛋白凝胶复合支架。
本发明中，所说的聚酯类聚合物可以是聚乳酸或聚乳酸-乙醇酸共聚物。
本发明的有益效果在于：
本发明的注射型微载体与纤维蛋白凝胶复合支架具有复合结构特征，其中 微载体可以为细胞生长和扩增提供一定的力学强度和空间；纤维蛋白凝胶则有 利于实现微载体的输送和原位注射成型。纤维蛋白凝胶是来源于血液的制品， 具有良好的生物相容性和降解性能，其中含有大量的活性因子，具有更好的促 进软骨细胞的迁移、增殖及分化性能，加快修复受损的软骨组织。该复合支架 可以有效地负载微载体，防止微载体在体内游走，防止细胞在种植过程中流失， 生物相容性好，制备方法简单、材料来源广泛、生产效率高，具有良好的应用 前景。
附图说明
图1是聚乳酸-乙醇酸共聚物微球的扫描电镜照片。
图2是表面含有氨基的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球的扫描电镜照片。
图3是表面含有纤维蛋白原的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球的扫描电镜片。
图4是表面含有纤维蛋白原的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球的激光共聚焦显 微镜照片。纤维蛋白原首先用荧光素异硫氰酸酯标记。
图5是纤维蛋白凝胶复合聚乳酸-乙醇酸共聚物微载体支架的扫描电镜照 片。
图6是纤维蛋白凝胶复合聚乳酸-乙醇酸共聚物微载体支架的激光共聚焦 显微镜照片。纤维蛋白原首先用荧光素异硫氰酸酯标记。
图7是体外培养一周后，软骨细胞在纤维蛋白凝胶复合微载体支架中的形 态及分布的激光共聚焦显微镜照片。其中细胞采用荧光素二乙酸酯的方法进行 染色。
具体实施方法
以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。
实例1：
1)将聚乳酸-乙醇酸共聚物溶解在二氯甲烷中，配制成浓度为50mg/ml的 均匀溶液；将此溶液加入到质量浓度为0.1％的聚乙烯醇溶液中，聚乙烯醇的水 溶液和二氯甲烷的体积比为5∶1。在机械搅拌下挥发8小时去除二氯甲烷；过 滤分离出聚乳酸-乙醇酸共聚物微球，干燥；
2)将步骤1)获得的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球浸泡在质量浓度为6％的己 二胺正丙醇溶液中，在40℃水浴中反应3分钟，用去离子水充分洗涤以除去未 反应的己二胺，然后在35℃真空干燥箱中干燥至恒重，即获得表面含有氨基的 聚乳酸-乙醇酸共聚物微球。图2是表面含有氨基的聚乳酸-乙醇酸共聚物微 球的扫描电镜照片。
3)将纤维蛋白原粉末溶于生理盐水中，于37℃恒温水浴中孵育10分钟， 使纤维蛋白原充分溶解，纤维蛋白原溶液的浓度为10mg/ml；将凝血酶溶解于 40mM氯化钙溶液中，于37℃恒温水浴中孵育10分钟，配制成20U/ml的溶液。
4)将步骤2)获得的表面含有氨基的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球浸入质量 浓度为1％戊二醛溶液中，4℃下反应3h，用大量去离子水冲洗去除未反应的戊 二醛，获得表面含有醛基的聚乳酸-乙醇酸共聚物微球；然后将此表面含有醛 基的聚乳酸-乙醇酸微球浸入10mg/ml的纤维蛋白原溶液中，4℃下反应24h， 隔2小时振荡一次。冷冻-冻干后，获得表面含有纤维蛋白原的聚乳酸-乙醇 酸共聚物微球，即聚乳酸-乙醇酸共聚物微载体，如图3的扫描电镜照片和图4 的激光共聚焦显微镜照片所示。
5)将聚乳酸-乙醇酸共聚物微载体与纤维蛋白原溶液按质量比为3％混合， 在振荡器上震荡使聚酯类微载体均匀分散在纤维蛋白原溶液中，然后将分散有 聚乳酸-乙醇酸共聚物微载体的纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液等体积混合均 匀，放入37℃恒温烘箱中孵育10分钟，使纤维蛋白原交联，形成凝胶，即获得 注射型聚乳酸-乙醇酸共聚物微载体与纤维蛋白凝胶的复合支架。图5和图6 分别是纤维蛋白凝胶复合聚乳酸-乙醇酸共聚物微载体支架的扫描电镜照片和 激光共聚焦显微镜照片。
实例2：
同实例1的步骤1)制备聚合物微球，但使用的聚合物为聚乳酸，其余步骤 同实例1，得到注射型聚乳酸微载体与纤维蛋白凝胶的复合支架。
实例3：
同实例1的步骤1)制备聚乳酸-乙醇酸共聚物微球，但聚乙烯醇溶液的质 量浓度为0.5％，其余步骤同实例1。
实例4：
步骤1)同实例1的步骤1)。
步骤2)同实例1的步骤2)，但氨解的时间为15分钟，得表面含有氨基的聚 乳酸-乙醇酸共聚物微球。其余步骤同实例1。
实例5：
步骤1)～3)同实例1的步骤1)～3)，但在步骤3)中同时配制纤维蛋白原 浓度为40mg/ml的溶液。
步骤4)同实例1的步骤4)，但纤维蛋白原溶液的浓度为40mg/ml。其余步 骤同实例1。
实例6：
步骤1)～3)同实例1的步骤1)～3)，但在步骤3)中同时配制凝血酶浓度 为40U/ml的氯化钙溶液。
步骤4)同实例1的步骤4)，但凝血酶溶液的浓度为40U/ml。其余步骤同 实例1。
实例7：
步骤1)～4)同实例1的步骤1)～4)。
步骤5)同实例1的步骤5)，但聚乳酸-乙醇酸共聚物微载体与纤维蛋白 原溶液的质量比为15％。
实例8：
步骤1)～2)同实例1的步骤1)～2)。
步骤3)同实例1步骤3)，但同时配制纤维蛋白原浓度为40mg/ml的溶液， 凝血酶浓度为30U/ml的溶液。
步骤4)同实例1的步骤4)。
纤维蛋白原溶液(40mg/ml)和凝血酶(30U/ml)溶液首先用孔径为220nm 的过滤膜过滤灭菌。然后将即实例1制备的聚乳酸-乙醇酸共聚物微载体与纤 维蛋白原溶液均匀混合，其中聚乳酸-乙醇酸共聚物微载体的质量百分浓度为 15％，然后再将该混合物与软骨细胞混合，放入37℃培养箱中孵育10分钟，得 到含有软骨细胞的纤维蛋白凝胶复合微载体支架。软骨细胞的最终浓度为300 万/ml。将此含有软骨细胞的复合支架放到24孔培养板中，加入培养液，在培养 箱中进行体外培养。图7是体外培养7天后，软骨细胞在纤维蛋白凝胶复合微 载体支架中的形态及分布的激光共聚焦显微镜照片。