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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711017324.6 (22)申请日 2017.10.26 (71)申请人 山东大学 地址 250061 山东省济南市经十路17923号 (72)发明人 董姝丽 张卓 郝京诚 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 张晓鹏 (51)Int.Cl. A61L 26/00(2006.01) C08G 81/00(2006.01) C08G 65/332(2006.01) C08B 37/00(2006.01) (54)发明名称 一种可注射的天。
2、然多糖自愈合水凝胶及其 制备方法与应用 (57)摘要 本发明公开了一种可注射的天然多糖自愈 合水凝胶及其制备方法与应用， 包括如下步骤： 1)聚乙二醇与4-羧基苯甲醛反应制备两端修饰 苯甲醛的聚乙二醇； 2)通过N,N -羰基二咪唑活 化的方式将乙二胺引入琼脂糖骨架中， 制备乙二 胺修饰的琼脂糖骨架； 3)将两端修饰苯甲醛的聚 乙二醇的水溶液与乙二胺修饰的琼脂糖骨架的 水溶液混合， 制备得到基于可逆亚胺键的可注射 天然多糖高分子水凝胶。 该水凝胶具有可注射和 自愈合特性， 作为伤口敷料使用时， 可实现原位 载药并可以填充不规则的伤口， 同时可以大大延 长敷料的使用寿命。 权利要求书2页 说明书。
3、7页 附图7页 CN 107596438 A 2018.01.19 CN 107596438 A 1.一种可注射的天然多糖自愈合水凝胶， 包括两端修饰苯甲醛的聚乙二醇与乙二胺修 饰的琼脂糖骨架， 两端修饰苯甲醛的聚乙二醇中的醛基与乙二胺修饰的琼脂糖骨架上的氨 基反应生成可逆亚胺键； 优选的， 所述聚乙二醇的重均分子量为1500-3000， 优选为重均分子量为1700-2500， 最 优选为2000。 2.权利要求1所述的可注射的天然多糖自愈合水凝胶的制备方法， 其特征在于： 包括如 下步骤： 1)聚乙二醇与4-羧基苯甲醛反应制备两端修饰苯甲醛的聚乙二醇； 2)通过N,N -羰基二咪唑活化的方式。
4、将乙二胺引入琼脂糖骨架中， 制备乙二胺修饰的 琼脂糖骨架； 3)将两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的水溶液与乙二胺修饰的琼脂糖骨架的水溶液混合， 制备得到基于可逆亚胺键的可注射天然多糖高分子水凝胶。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于： 步骤1)中， 所述聚乙二醇的重均分子 量为1500-3000； 优选为重均分子量为1700-2500， 最优选为2000。 4.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于： 步骤1)中， 聚乙二醇与4-羧基苯甲醛 反应制备两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的方法， 包括如下步骤： 将聚乙二醇、 4-羧基苯甲醛和4-二甲氨基吡啶溶解到四氢呋喃中， 然后在保护气体保 护。
5、下向体系中加入N,N -二环己基碳二亚胺， 反应后得到两端修饰苯甲醛的聚乙二醇； 优选的， 反应的温度为18-22， 反应的时间为15-20h； 优选的， 聚乙二醇、 4-羧基苯甲醛、 4-二甲氨基吡啶和N,N -二环己基碳二亚胺的质量 比为1.63:0.49:0.025:0.84。 5.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于： 还包括将步骤3)中制备得到的可注射 天然多糖高分子水凝胶进行重结晶的步骤； 优选的， 所述重结晶具体为： 反应结束后， 过滤得到白色固体， 将白色固体溶解于四氢 呋喃后再向其中加入乙醚进行重结晶。 6.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于： 步骤2)中， 乙。
6、二胺修饰的琼脂糖骨架 的制备方法， 包括如下步骤： 将琼脂糖加入到二甲基亚砜中溶解； 将N,N -羰基二咪唑溶解于二甲基亚砜； 将步骤中制得的溶液逐滴加入到步骤中得到的溶液中， 搅拌设定时间后， 逐滴 滴入乙二胺， 反应设定时间； 将步骤中反应后的溶液采用截留分子为8000-14000的透析膜在蒸馏水中进行透 析， 将透析好的溶液冻干， 得到乙二胺修饰的琼脂糖。 7.根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于： 步骤中， 将步骤中制得的溶液逐 滴加入到步骤中得到的溶液中是在20-35下进行的； 优选的， 步骤中， 搅拌的时间为1.5-2.5h； 优选的， 步骤中， 反应的温度为20-35， 反。
7、应的时间为20-30h， 优选为20-25h， 最优 选为24h。 8.根据权利要求6所述的制备方法， 其特征在于： 步骤中， 透析的时间为3.5-4.5天， 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 107596438 A 2 所述蒸馏水为三次蒸馏水。 9.权利要求1所述天然自愈合水凝胶在作为伤口敷料中的应用。 10.一种伤口敷料， 其特征在于： 包括权利要求1所述天然多糖自愈合水凝胶和承载于 所述天然多糖自愈合水凝胶中的药物、 细胞因子或生长因子中的一种或多种。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 107596438 A 3 一种可注射的天然多糖自愈合水凝胶及其制备方法与应用 技术领。
8、域 0001 本发明属于高分子材料技术领域， 特别涉及一种可注射的天然多糖自愈合水凝胶 及其制备方法与应用， 具体是应用乙二胺修饰的琼脂糖和两端修饰苯甲醛的聚乙二醇键基 于亚胺键交联形成可注射凝胶， 并且这些可逆共价键赋予水凝胶良好的自愈合性能， 并将 凝胶应用于伤口敷料的技术领域， 促进皮肤伤口的愈合。 背景技术 0002 人体的皮肤及粘膜是维持人体内环境稳定和阻止微生物侵入的屏障， 由于溃疡、 创伤、 烧伤及炎症等原因引起的皮肤及粘膜损伤， 会引起机体一系列的问题， 比如细菌感 染、 新陈代谢加剧、 水分和蛋白质过度流失、 内分泌及免疫系统功能失调等， 严重的可能危 及生命。 皮肤及粘膜损。
9、伤时应选择合适的敷料覆盖在伤口上， 它可发挥保持伤口湿润环境、 吸收分泌物、 缓解疼痛并控制出血的作用， 从而促进伤口快速愈合。 0003 理想的伤口敷料需要满足使伤口快速闭合、 促进伤口愈合、 减少二次创伤等要求， 迄今为止已经发展出橡胶、 薄膜、 静电纺纳米纤维以及水凝胶等多种材料的伤口敷料。 传统 的敷料用于伤口主要发挥隔离和抑菌作用， 但常常导致伤口干燥、 破坏健康的生长因子且 容易粘连在新生组织上， 在敷料去除时会导致伤口的二次创伤， 而且难以应用在具有较大 深度或/和形状不规则伤口的填充等方面。 0004 随着人们生活水平和医疗水平的提高， 人们对于敷料提出了更高的要求： (1)能。
10、够 控制和吸收渗出物， 保持伤口湿润而无渗出液的环境； (2)能够提供一个细菌阻挡层， 营造 一个适合组织生长的良好环境， 促进组织生长； (3)具有气体和水蒸气的合适透过率； (4)使 用方便， 黏附性适宜， 不造成二次伤害； (5)无毒、 无害、 无刺激。 凝胶敷料正是一种能够满足 以上5种要求的优质敷料， 但是如果将其应用在具有较大深度或/和形状不规则伤口的填充 时， 则要求凝胶敷料为可注射凝胶敷料。 应用于生物医学的可注射水凝胶需要满足几个关 键要求： (1)可注射水凝胶本身及其前驱体溶液应具有良好的生物相容性； (2)该可注射水 凝胶的前驱体溶液需要具有在靶标位点快速成型固化的能力；。
11、 (3)前驱体溶液在靶标位点 成胶凝固后， 还需迅速达到一定的机械强度， 以免周围组织挤压或形变而对水凝胶造成损 伤。 然而， 传统的可注射水凝胶却很难同时满足以上三个要求， 使得现有的凝胶敷料也难以 应用在具有较大深度或/和形状不规则伤口的填充中， 而且， 现有的凝胶敷料周围组织挤压 或外界压力的作用下容易造成损伤， 但是不能实现自愈合， 大大影响凝胶敷料的使用寿命， 而频繁更换敷料不利于伤口的愈合， 进而限定了凝胶敷料的推广应用。 发明内容 0005 为了解决以上技术问题， 本发明的一个目的是提供一种可注射的天然多糖自愈合 水凝胶的制备方法。 0006 本发明的第二个目的是提供上述可注射的。
12、天然多糖自愈合水凝胶的制备方法制 备得到的天然多糖自愈合水凝胶。 该水凝胶具有可注射和自愈合特性， 作为伤口敷料使用 说 明 书 1/7 页 4 CN 107596438 A 4 时， 可实现原位载药并可以填充不规则的伤口， 同时可以大大延长敷料的使用寿命。 0007 本发明的第三个目的是提供上述天然自愈合水凝胶在作为伤口敷料中的应用。 0008 为了解决以上技术问题， 本发明的技术方案为： 0009 一种可注射的天然多糖自愈合水凝胶， 包括两端修饰苯甲醛的聚乙二醇与乙二胺 修饰的琼脂糖骨架， 两端修饰苯甲醛的聚乙二醇中的醛基与乙二胺修饰的琼脂糖骨架上的 氨基反应生成可逆亚胺键。 0010 乙。
13、二胺修饰的琼脂糖骨架上的氨基与两端修饰苯甲醛的聚乙二醇中的醛基通过 席夫碱反应生成可逆亚胺键， 其在一定程度上保持了共价键的性质而能稳定存在， 它们又 具有可逆性， 即键的断裂和生成存在动态平衡。 这些动态化学键分布在整个水凝胶网络中， 使网络中始终存在未交联的活性基团， 当水凝胶破碎时， 这些活性基团可重新交联形成新 的可逆共价键， 破碎的水凝胶碎片即可通过这种方式重新自愈合为一块完整的水凝胶。 所 以， 当凝胶敷料在周围组织挤压或形变的作用下造成损伤时， 能很快自愈合， 进而提高了凝 胶敷料的使用寿命。 且水凝胶具有良好的生物相容性， 可在10s内极速成胶， 具有一定的机 械强度， 完全满。
14、足可注射水凝胶的要求， 使其可以应用在具有较大深度、 且形状不规则的伤 口填充中。 0011 优选的， 所述聚乙二醇的重均分子量为1500-3000。 优选为重均分子量为1700- 2500， 最优选为2000。 0012 上述可注射的天然多糖自愈合水凝胶的制备方法， 包括如下步骤： 0013 1)聚乙二醇与4-羧基苯甲醛反应制备两端修饰苯甲醛的聚乙二醇； 0014 2)通过N,N -羰基二咪唑活化的方式将乙二胺引入琼脂糖骨架中， 制备乙二胺修 饰的琼脂糖骨架； 0015 3)将两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的水溶液与乙二胺修饰的琼脂糖骨架的水溶液 混合， 制备得到基于可逆亚胺键的可注射天然多糖高分。
15、子水凝胶。 0016 本发明采用具有良好生物相容性的天然多糖材料作为水凝胶骨架， 合成过程简单 绿色， 反应条件温和。 0017 优选的， 步骤1)中， 所述聚乙二醇的重均分子量为1500-3000。 优选为重均分子量 为1700-2500， 最优选为2000。 0018 优选的， 聚乙二醇与4-羧基苯甲醛反应制备两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的方法， 包括如下步骤： 0019 将聚乙二醇、 4-羧基苯甲醛和4-二甲氨基吡啶溶解到四氢呋喃中， 然后在保护气 体保护下向体系中加入N,N -二环己基碳二亚胺， 反应后得到两端修饰苯甲醛的聚乙二醇。 0020 进一步优选的， 反应的温度为18-22， 反应。
16、的时间为15-20h。 若温度过高， N,N - 二环己基碳二亚胺易产生异构体从而发生副反应。 0021 进一步优选的， 聚乙二醇、 4-羧基苯甲醛、 4-二甲氨基吡啶和N,N -二环己基碳二 亚胺的质量比为1.63:0.49:0.025:0.84。 0022 进一步优选的， 还包括将制备得到的产品进行重结晶的步骤。 以除去杂质。 0023 更进一步优选的， 所述重结晶具体为： 反应结束后， 过滤得到白色固体， 将白色固 体溶解于四氢呋喃后再向其中加入乙醚进行重结晶。 重结晶过程重复三遍， 以更好地除去 杂质。 说 明 书 2/7 页 5 CN 107596438 A 5 0024 优选的， 。
17、步骤2)中， 乙二胺修饰的琼脂糖骨架的制备方法， 包括如下步骤： 0025 将琼脂糖加入到二甲基亚砜中溶解； 0026 将N,N -羰基二咪唑溶解于二甲基亚砜； 0027 将步骤中制得的溶液逐滴加入到步骤中得到的溶液中， 搅拌设定时间后， 逐滴滴入乙二胺， 反应设定时间； 0028 将步骤中反应后的溶液采用截留分子为8000-14000的透析膜在蒸馏水中进 行透析， 将透析好的溶液冻干， 得到乙二胺修饰的琼脂糖。 0029 冻干是指把含有的大量的水分物质预先进行降温冻结成固体， 然后在真空条件下 使水蒸汽直接升华除去， 物质本身剩留在冻结时的冰架中。 所以干燥后的原有结构不变， 利 于后续的反。
18、应， 有利于提高水凝胶的性能。 将步骤中制备的N,N -羰基二咪唑溶液逐滴加 入到步骤的琼脂糖溶液中是为了活化琼脂糖骨架上的羟基。 活化羟基之后， 由于乙二胺 在步骤制得的溶液中溶解度较慢， 为保证乙二胺溶解完全并加速反应进程， 所以逐滴加 入乙二胺。 0030 优选的， 步骤中， 将步骤中制得的溶液逐滴加入到步骤中得到的溶液中是 在20-35下进行的。 0031 优选的， 步骤中， 为了保证N,N -羰基二咪唑完全活化琼脂糖上的羟基， 搅拌的 时间为1.5-2.5h。 0032 优选的， 步骤中， 反应的温度为20-35， 反应的时间为20-30h， 优选为20-25h， 最优选为24h。 。
19、0033 优选的， 步骤中， 透析的时间为3.5-4.5天， 所述蒸馏水为三次蒸馏水。 0034 上述天然自愈合水凝胶在作为伤口敷料中的应用。 0035 一种伤口敷料， 包括上述天然多糖自愈合水凝胶和承载于所述天然多糖自愈合水 凝胶中的药物、 细胞因子或生长因子中的一种或多种。 0036 本发明的有益效果为： 0037 1、 本发明的制备工艺简单成熟， 绿色环保， 无需有机溶剂， 成胶速度快(10s之内)， 且亚胺键的动态特性使得水凝胶在宏观上对外界环境具有pH响应的特性， 可以实现不同pH 环境下的药物可控释放。 且凝胶结构被破坏后无借助外力条件即可快速愈合， 使制备的凝 胶敷料可以在具有较。
20、大深度或/和形状不规则伤口的填充中应用。 0038 2、 水凝胶的制备可以通过改变原料的投料比来调控水凝胶的机械性能， 方法简 单， 易于推广。 附图说明 0039 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解， 本申请的示 意性实施例及其说明用于解释本申请， 并不构成对本申请的不当限定。 0040 图1为两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的1H核磁共振谱图。 0041 图2为聚乙二醇和两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的红外吸收光谱。 0042 图3为聚乙二醇和两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的热重分析结果。 0043 图4为琼脂糖和乙二胺修饰的琼脂糖的红外吸收光谱。 0044 图5为琼脂糖和乙二胺修饰的。
21、琼脂糖的热重分析结果。 说 明 书 3/7 页 6 CN 107596438 A 6 0045 图6为乙二胺修饰的琼脂糖、 两端修饰苯甲醛的聚乙二醇和干凝胶的红外吸收光 谱。 0046 图7为乙二胺修饰的琼脂糖、 两端修饰苯甲醛的聚乙二醇和干凝胶的热重分析结 果。 0047 图8为干凝胶的扫描电子显微镜表征结果。 0048 图9为干凝胶的X射线衍射表征结果。 0049 图10为通过流变测试估测的具有不同投料比的凝胶的机械强度结果。 0050 图11为凝胶的宏观自愈合实验。 0051 图12为通过流变测试的连续一步应变测试结果。 0052 图13为凝胶的宏观可注射实验。 0053 图14为凝胶的。
22、pH响应性实验。 0054 图15为凝胶的HUVEC细胞的毒理性测试。 0055 图16为新西兰兔肝脏撕裂伤模型示意图。 0056 图17为凝胶、 消毒纱布以及不处理伤口的出血量评估。 0057 图18为凝胶、 消毒纱布以及不处理伤口的出血时间评估。 具体实施方式 0058 应该指出， 以下详细说明都是例示性的， 旨在对本申请提供进一步的说明。 除非另 有指明， 本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常 理解的相同含义。 0059 需要注意的是， 这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式， 而非意图限制根 据本申请的示例性实施方式。 如在这里所使用的， 除非上下文。
23、另外明确指出， 否则单数形式 也意图包括复数形式， 此外， 还应当理解的是， 当在本说明书中使用术语 “包含” 和/或 “包 括” 时， 其指明存在特征、 步骤、 操作、 器件、 组件和/或它们的组合。 0060 琼脂糖， 是线性的多聚物， 基本结构是1,3连结的 -D-半乳糖和1,4连结的3,6-内 醚-L-半乳糖交替连接起来的长链。 0061 实施例1 0062 将PEG2000(1.63g,0.815mmol)， 4-羧基苯甲醛(0.49g,3.26mmol)， 4-二甲氨基吡啶 (0.025g)溶解到50ml的干燥四氢呋喃中， 之后在氮气保护下向体系中加入N,N -二环己基 碳二亚胺(。
24、0.84g,4.075mmol)。 反应于20下搅拌18h。 反应结束后， 过滤得到白色固体， 将 白色固体溶解于四氢呋喃后加入乙醚重结晶以除去杂质， 此过程重复三遍。 干燥之后， 得到 1.42g(产率77)的两端修饰苯甲醛的聚乙二醇。 其1H核磁共振谱图示于图1所示， 红外吸 收光谱如图2所示， 热重分析结果如图3所示。 0063 将100mg的琼脂糖加到60mL的二甲基亚砜中， 加热到80使其溶解。 待体系冷却到 室温后， 将6.36g N,N -羰基二咪唑溶解于40mL二甲基亚砜并逐滴加入到体系中。 于室温中 搅拌两小时后， 逐滴加入10mL乙二胺,在室温下搅拌24h。 之后， 用透析。
25、膜(截留分子量为 8000-14000， 上海蓝季科技发展有限公司)在三次蒸馏水中透析4天。 将透析好的溶液冻干， 得到乙二胺修饰的琼脂糖。 其红外吸收光谱如图4所示， 热重分析结果如图5所示。 0064 将10mg乙二胺修饰的琼脂糖加入到800 L三次蒸馏水中， 加热到约70使其溶解 说 明 书 4/7 页 7 CN 107596438 A 7 得到乙二胺修饰的琼脂糖溶液。 将30mg的两端修饰苯甲醛的聚乙二醇加到200 L三次蒸馏 水中， 逐滴加入到乙二胺修饰的琼脂糖溶液中， 涡旋10s内， 得到1mL浓度为1wt乙二胺修 饰的琼脂糖3wt两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的水凝胶。 干凝胶的红外吸。
26、收光谱如图6所 示， 热重分析结果如图7所示。 0065 将1mL浓度为1wt乙二胺修饰的琼脂糖3wt两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的水凝 胶冻干后得到干凝胶。 干凝胶的扫描电子显微镜表征结果显示凝胶具有多孔结构， 孔径均 在微米级别， 结果如图8所示。 0066 将1mL浓度为1wt乙二胺修饰的琼脂糖3wt两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的水凝 胶冻干后得到干凝胶。 干凝胶的X射线衍射表征证明凝胶为无定型结构， 结果如图9所示。 0067 机械强度测试 0068 通过流变测试的应力扫描的表征， 估测了样品的机械强度， 固定乙二胺修饰的琼 脂糖浓度， 增大两端修饰苯甲醛的聚乙二醇浓度， 凝胶机械强度增大， 。
27、推测是由于高分子链 增多， 分子链之间缠绕更加紧密， 固定两种原料比例， 同时增大两者浓度， 凝胶机械强度增 大， 推测是由于席夫碱交联数增多， 且高分子链数增多， 形成了更加牢固的凝胶结构， 结果 如图10所示。 0069 自愈合性能测试 0070 具有自愈合性能的凝胶作为伤口敷料会大大延长敷料的寿命， 为了证明凝胶的自 愈合性能， 从宏观实验证明凝胶的自愈合性能： 将制备的浓度为1wt乙二胺修饰的琼脂糖 3wt两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的自愈合凝胶切成两段后再使其相互接触， 在室温下静 置1分钟后， 发现凝胶恢复可以成一个整体， 将愈合后的凝胶浸泡于pH为7.4的PBS缓冲液中 5个小时， 。
28、发现凝胶不分散， 用镊子夹起可以承受自身重量， 这证明在凝胶的断裂面处， 醛基 与胺基发生反应， 形成了动态的席夫碱交联， 而非破裂凝胶之间发生简单粘附， 凝胶具有良 好的自愈合性能， 结果如图11所示。 0071 宏观可注射性能测试 0072 制备的自愈合凝胶同时具有可注射性， 通过针头将1mL浓度为1wt乙二胺修饰的 琼脂糖3wt两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的水凝胶注射后， 凝胶仍可保持其完整形态， 以玻 璃为载体， 通过针头可以注射出一整条凝胶线。 通过用注射器将两块制备得到的天然多糖 自愈合水凝胶注入小烧杯中， 混匀压实， 1分钟后， 小烧杯中的凝胶碎片重新愈合成为一块 完整的水凝胶整体，。
29、 并且具有一定的机械强度， 证实该种水凝胶具有良好的自愈合性能， 结 果如图13所示。 0073 pH响应性能测试 0074 已知亚胺键的形成是一个动态平衡过程， 而一些外界刺激可以通过干扰平衡而使 凝胶发生溶胶化。 亚胺键在酸性环境中易于分解， 而在碱性环境中相对稳定， 因此含有亚胺 键的自愈合水凝胶可以在酸性条件下发生降解， 而在碱性环境中再度凝胶化。 为了证明该 水凝胶的pH响应性， 将20微升3mol/L的浓盐酸的水溶液加入到1mL浓度为1wt乙二胺修饰 的琼脂糖3wt两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的水凝胶中， 可以观察到， 凝胶在两分钟内被完 全分解。 之后向被分解的凝胶中加入等量氢氧化钠。
30、水溶液， 溶胶在1分钟可再度凝胶化， 结 果如图14所示， 可见， 该水凝胶在不同的pH值环境中具有不同的响应。 0075 细胞的毒理性测试 说 明 书 5/7 页 8 CN 107596438 A 8 0076 1)细胞培养 0077 将人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞培养于含有10胎牛血清的DMEM液体培养基中， 置于37、 5二氧化碳的培养箱中培养。 0078 2)细胞提取液配置： 将凝胶浸没在10胎牛血清的DMEM液体培养基分别12小时和 24小时中， 作为样品。 0079 3)细胞活力测定 0080 以2000细胞/孔密度， 将细胞接种于96孔板中。 贴壁24h后， 加入细胞培养液样品。
31、使 其浓度分别为80和100。 在处理24h后， 每孔加入20 L， 5mg/mL的MTT溶液(MTT细胞实验 所用染料)， 在培养箱中孵育4h后， 在酶标仪上测定570nm处吸光度值。 每组吸光度值扣除空 白溶液吸光度值后， 每孔对应值除以对照组的吸光度值作为细胞活力。 每组设置6个平行 孔。 结果如图15所示， 将所制备的20克自愈合水凝胶分别浸没于20mL细胞培养液中12-24小 时后， 提取凝胶浸取液， 将HUVEC在凝胶浸取液中培养24-48小时， 发现细胞存活率均在80 以上， 证明本发明制备的水凝胶没有毒性， 可以放心使用。 。 0081 动物功效实验 0082 实验样品为按照该。
32、实施例制备的水凝胶敷料样品， 对照样品为普通医用生理盐水 纱布。 0083 本实验采用手术方法在新西兰兔(2Kg)的腹部解剖， 在肝部制作长度为1cm的创伤 性疤痕模型如图16所示。 将纱布垫在伤口部位下用来吸收伤口出血， 通过称量纱布的重量 从而估计伤口的出血量。 0084 1、 造模 0085 通过静脉注射巴比妥那将兔子麻醉， 在新西兰兔的腹部剪毛后， 4的硫化钠脱 毛， 温水洗净， 擦干， 解剖漏出肝部， 在肝叶上用手术刀切割长度为1厘米的伤口。 结果如图 15所示。 0086 2、 止血 0087 将称好重量的干纱布垫于伤口之下用来吸收伤口出血， 将凝胶样品和消毒纱布分 别置于伤口处止。
33、血。 称量吸血后的纱布重量从而估计出血量， 并用秒表记录出血时间。 结果 如图17和图18所示， 相比于传统纱布止血， 施加自愈合水凝胶之后， 伤口出血量大大减少， 由0.710.09g降至0.190.03g， 而出血时间由7211s降至10s以内， 证明凝胶有效的止 血效果。 0088 实施例2 0089 将PEG2000(3.26g， 1.63mmol)， 4-羧基苯甲醛(0.98g,6.52mmol)， 4-二甲氨基吡啶 (0.05g)溶解到100ml的干燥四氢呋喃中， 之后在氮气保护下向体系中加入N,N -二环己基 碳二亚胺(1.68g,8.15mmol)。 反应于22下搅拌20h。 。
34、反应结束后， 过滤得到白色固体， 将白 色固体溶解于四氢呋喃后加入乙醚重结晶以除去杂质， 此过程重复三遍。 干燥之后， 得到 2.6g(产率70)的两端修饰苯甲醛的聚乙二醇。 0090 将100mg的琼脂糖加到70mL的二甲基亚砜中， 加热到90使其溶解。 待体系冷却到 室温后， 将7.63g N,N -羰基二咪唑溶解于50mL二甲基亚砜并逐滴加入到体系中。 于室温中 搅拌两小时后， 逐滴加入12mL乙二胺,在室温下搅拌36h。 之后， 用透析膜(截留分子量为 8000-14000， 上海蓝季科技发展有限公司)在三次蒸馏水中透析5天。 将透析好的溶液冻干， 说 明 书 6/7 页 9 CN 1。
35、07596438 A 9 得到乙二胺修饰的琼脂糖。 0091 将8mg乙二胺修饰的琼脂糖加入到800 L三次蒸馏水中， 加热到约80使其溶解得 到乙二胺修饰的琼脂糖溶液。 将24mg的两端修饰苯甲醛的聚乙二醇加到200 L三次蒸馏水 中， 逐滴加入到乙二胺修饰的琼脂糖溶液中， 涡旋8s内， 得到1mL浓度为0.8wt乙二胺修饰 的琼脂糖2.4wt两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的水凝胶。 0092 实施例3 0093 将PEG2000(0.815g， 0.408mmol)， 4-羧基苯甲醛(0.25g,1.63mmol)， 4-二甲氨基吡 啶(0.0125g)溶解到25ml的干燥四氢呋喃中， 之后在氮。
36、气保护下向体系中加入N,N -二环己 基碳二亚胺(0.42g,2.038mmol)。 反应于25下搅拌16h。 反应结束后， 过滤得到白色固体， 将白色固体溶解于四氢呋喃后加入乙醚重结晶以除去杂质， 此过程重复三遍。 干燥之后， 得 到0.74g(产率80)的两端修饰苯甲醛的聚乙二醇。 0094 将100mg的琼脂糖加到80mL的二甲基亚砜中， 加热到80使其溶解。 待体系冷却到 室温后， 将9.54g N,N -羰基二咪唑溶解于50mL二甲基亚砜并逐滴加入到体系中。 于室温中 搅拌两小时后， 逐滴加入15mL乙二胺,在室温下搅拌48h。 之后， 用透析膜(截留分子量为 8000-14000，。
37、 上海蓝季科技发展有限公司)在三次蒸馏水中透析6天。 将透析好的溶液冻干， 得到乙二胺修饰的琼脂糖。 0095 将12mg乙二胺修饰的琼脂糖加入到800L三次蒸馏水中， 加热到约80使其溶解得 到乙二胺修饰的琼脂糖溶液。 将36mg的两端修饰苯甲醛的聚乙二醇加到200L三次蒸馏水 中， 逐滴加入到乙二胺修饰的琼脂糖溶液中， 涡旋6s内， 得到1mL浓度为1.2wt乙二胺修饰 的琼脂糖3.6wt两端修饰苯甲醛的聚乙二醇的水凝胶。 0096 以上所述仅为本申请的优选实施例而已， 并不用于限制本申请， 对于本领域的技 术人员来说， 本申请可以有各种更改和变化。 凡在本申请的精神和原则之内， 所作的任。
38、何修 改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本申请的保护范围之内。 说 明 书 7/7 页 10 CN 107596438 A 10 图1 图2 说 明 书 附 图 1/7 页 11 CN 107596438 A 11 图3 图4 说 明 书 附 图 2/7 页 12 CN 107596438 A 12 图5 图6 说 明 书 附 图 3/7 页 13 CN 107596438 A 13 图7 图8 图9 说 明 书 附 图 4/7 页 14 CN 107596438 A 14 图10 图11 图12 说 明 书 附 图 5/7 页 15 CN 107596438 A 15 图13 图14 图15 说 明 书 附 图 6/7 页 16 CN 107596438 A 16 图16 图17 图18 说 明 书 附 图 7/7 页 17 CN 107596438 A 17 。