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1、(10)授权公告号 CN 101496908 B (45)授权公告日 2012.10.31 CN 101496908 B *CN101496908B* (21)申请号 200910096333.8 (22)申请日 2009.02.20 A61L 27/18(2006.01) A61L 27/56(2006.01) A61L 27/02(2006.01) (73)专利权人 杭州电子科技大学 地址 310018 浙江省杭州市江干区下沙高教 园区 2 号大街 (72)发明人 徐铭恩 索海瑞 王秋君 李艳蕾 (74)专利代理机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 33100 代理人 徐飞虎 徐关寿 C。
2、N 1374073 A,2002.10.16, 说明书第 2 页 1-3 段 . CN 1394654 A,2003.02.05, 说明书全文 . CN 1269247 A,2000.10.11, 说明书第 2 页 . 陈建庭， 等 . 纳米珍珠层人工骨的制备 .南 方医科大学学报 .2008, 第 28 卷 ( 第 12 期 ),2171-2173. (54) 发明名称 一种具有多级微纳结构的珍珠粉人工骨支架 材料及其生产工艺 (57) 摘要 本发明涉及一种新的用于骨修复的生物支架 材料及其制备方法。将质量比为 1 1-10 1 的 PLGA 和 PLA 溶解于氯仿、 二甲基亚砜、 1， 4。
3、- 二 氧六环或 1， 4- 二氧六环与超纯水的混合液体， 然 后按照 PLGA/PLA 混合物 ： 珍珠粉 ( 质量比 ) 为 1 1-10 1 的比例加入经部分脱蛋白或完全脱 蛋白处理珍珠粉制成成形浆料。 通过3D软件设计 具有高孔隙率和连通率的三维支架， 然后利用低 温快速成型系统使三维支架成型得到具有微孔结 构的支架。根据上述方法制备的人工骨生物支架 材料， 其宏观结构为具有 100-500m 孔径通道， 微结构为具有 10-20m 微孔的三维支架结构， 其 中微孔壁弥散分布着微米级珍珠粉。孔隙率为 60 -90， 大孔结构的 X、 Y、 Z 轴三个方向贯通， 具有 100的贯通率。 。
4、(51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘宇雄 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 6 页 1/2 页 2 1.一种含有PLGA、 PLA和珍珠粉的组合物， 其特征在于 ： 所述组合物中PLGAPLA质量 比为 1 1-10 1 ； PLGA/PLA 混合物珍珠粉质量比为 1 1-10 1， 所述组合物中 PLGA 的 LA/GA 的比例为 90/10、 80/20、 75/25、 60/40 或 50/50。 2. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于 ： 所述组。
5、合物中 PLGA PLA 质量比为 3 1-5 1。 3. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于 ： 所述组合物中 PLGA/PLA 混合物珍珠 粉质量比为 2 1-4 1。 4. 根据权利要求 3 所述的组合物， 其特征在于 ： 所述组合物中 PLGA/PLA 混合物珍珠 粉质量比为 7 3。 5. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于 ： 所述的珍珠粉粒度在 2000 目以下。 6. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于 ： 所述的珍珠粉直径为 1-10 微米。 7. 根据权利要求 6 所述的组合物， 其特征在于 ： 所述的珍珠粉直径为 3-6 微米。 8. 根据权。
6、利要求 1 所述的组合物， 其特征在于 ： 所述组合物中珍珠粉为部分脱蛋白或 完全脱蛋白的珍珠粉。 9. 根据权利要求 1 所述的组合物， 其特征在于 ： 所述组合物中 PLGA 的 LA/GA 的比例为 50/50。 10. 一种人工骨生物支架材料， 其特征在于 ： 所述的支架材料为宏观结构具有 100-500m 孔径通道， 微结构为具有 10-20m 微孔的三维支架结构， 所述支架材料由含有 PLGA、 PLA 和珍珠粉的组合物制备而得， 所述组合物中 PLGA PLA 质量比为 1 1-10 1 ； PLGA/PLA 混合物珍珠粉质量比为 1 1-10 1。 11. 根据权利要求 10 。
7、所述的人工骨生物支架材料， 其特征在于 ： 所述的支架材料中微 孔壁弥散分布着微米级珍珠粉。 12. 根据权利要求 10 所述的人工骨生物支架材料， 其特征在于 ： 所述的支架材料的孔 隙率为 60 -90。 13. 根据权利要求 10 所述的人工骨生物支架材料， 其特征在于 ： 所述的支架材料的大 孔结构的 X、 Y、 Z 轴三个方向贯通， 具有 100的贯通率。 14. 根据权利要求 10 所述的人工骨生物支架材料， 其特征在于 ： 所述的支架材料的压 缩弹性模量为 17.831.73MPa-25.622.35MPa。 15. 根据权利要求 10 所述的人工骨生物支架材料， 其特征在于 ：。
8、 所述的支架材料的抗 压强度 0.670.07MPa-1.470.11MPa。 16. 一种制备如权利要求 10 所述的人工骨生物支架材料的方法， 包括如下步骤 ： (1) 制备去抗原珍珠粉或完全去蛋白珍珠粉 ； (2) 制备含 PLGA、 PLA 和珍珠粉的浆料 ； (3) 通过 3D 软件设计具有高孔隙率和连通率的三维支架 ； (4) 利用低温快速成型系统使三维支架成型。 17. 根据权利要求 16 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (1) 的过程为取粒度在 2000 目以 下的微米级珍珠粉干燥， 然后用振动筛对其进行筛分以获得直径在 1m-10m 的珍珠粉， 随后对珍珠粉进行脱脂， 部。
9、分脱蛋白或完全脱蛋白处理， 干燥后消毒备用。 18. 根据权利要求 16 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (2) 的过程为将质量比为 权 利 要 求 书 CN 101496908 B 2 2/2 页 3 11-101的PLGA和PLA溶解于有机溶剂中， 所述的有机溶剂选自氯仿、 二甲基亚砜、 1， 4- 二氧六环或 1， 4- 二氧六环与超纯水的混合液体， 然后按照 PLGA/PLA 混合物珍珠粉质 量比为 1 1-6 1 的比例加入步骤 (1) 中的珍珠粉制成成形浆料。 19. 根据权利要求 18 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (2) 的过程中 PLGA PLA 质量比 为 3 1。
10、-5 1。 20. 根据权利要求 18 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (2) 的过程中 PLGA/PLA 混合物 珍珠粉质量比为 2 1-4 1。 21. 根据权利要求 20 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (2) 的过程中 PLGA/PLA 混合物 珍珠粉质量比为 7 3。 22. 根据权利要求 18 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (2) 的过程中有机溶剂为 1， 4- 二 氧六环与超纯水的混合液体， 混合液体中超纯水占总体积的 1 -20。 23. 根据权利要求 22 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (2) 的过程中有机溶剂为 1， 4- 二 氧六环与超纯水的混合液体，。
11、 混合液体中超纯水占总体积的 5 -10。 24. 根据权利要求 16 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (3) 中所用的 3D 软件为 Solidworks， 可根据实际需要设计任意形状的支架模型。 25. 根据权利要求 24 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (3) 中设计的支架模型含有规则 的 100 500m 圆润的大孔结构， 大孔结构的 XYZ 轴三个方向贯通。 26. 根据权利要求 16 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (4) 中所述的低温快速成型系统 为在殷华公司快速成型系统的基础上， 加装低温成型室和温控系统。 27. 根据权利要求 26 所述的方法， 其特征在于 ： 。
12、步骤 (4) 的过程为将分层信息文件输 入 Cark 成形控制软件中， 自动生成坐标路径等信息 ； 运动控制卡控制 X、 Y、 Z 三个方向的 步进电机驱动系统， 控制生物材料成型喷头成型位置， 增压喷头在驱动单元控制下， 稳定的 挤出成形浆料 ； 在低温成形室内， 浆料的迅速降温， 浆料中均匀的聚酯溶液发生固 - 液相分 离/液-液相分离， 生成溶剂结晶和富聚酯相， 然后在更低的温度下分离的两相均凝固成固 体 ； 从低温成形室中取出的冷冻支架， 被直接放入冷冻干燥机中去除溶剂和支撑材料 ； 在 冷冻干燥机中的真空环境中， 冷冻支架中的溶剂发生升华， 得到具有微孔结构的支架。 权 利 要 求 。
13、书 CN 101496908 B 3 1/7 页 4 一种具有多级微纳结构的珍珠粉人工骨支架材料及其生产 工艺 技术领域 0001 本发明属于生物医用材料技术领域， 具体的说， 涉及一种新的用于骨修复的生物 支架材料及其制备方法。 0002 发明背景 0003 目前在全球范围内， 对具有良好生理功能无排异反应， 用于骨缺损修复的人工骨 组织， 具有迫切和巨大的市场需求。 在人工骨制造领域， 国外研究机构和企业近年来投入了 大量资源， 并取得了一系列研究成果， 一些用于缺损修复的人工骨材料开始进入临床应用。 与此同时， 骨支架材料的核心问题如生物相容性、 骨诱导性、 孔隙率和机械强度等依旧存在 。
14、很多问题需要解决。 0004 珍珠粉是一种理想的天然成骨材料， 具有生物相容性、 诱导性好的特点， 具有广 阔的应用前景。珍珠层的理化性质及生物学特性与骨组织非常接近， 研究显示珍珠层与 骨之间遗传学上具有亲缘关系， 使得珍珠层具有良好的生物相容性 (Westbroek P， et al ； 1998， 392(6679) ： 861-2)。而且珍珠层植入物在体内可被溶解、 吸收， 具优良的生物降解特 性。 在体内将珍珠层注入椎体骨缺失模型中， 可观察到珍珠层逐渐降解， 骨缺损处形成新的 成熟骨小梁， 骨小梁表面被线性排列的成骨细胞类骨质覆盖， 珍珠层与新骨紧密结合， 显示 珍珠层在体内能刺激。
15、成骨细胞分化和新骨形成 (Lamghari M， et al ； Biomaterials.2001， 22(6) ： 555-62)。对机理的研究显示， 珍珠层降解时释放钙离子， 使局部钙离子浓度增高， 形成成骨矿化的先决条件。Miyamoto H 等 (Proc.Natl.Acad.Sci.U S A， 1996， 93(18) ： 9657-60) 认为珍珠层基质蛋白 N66 的的碳酸酐酶样结构域可催化 HCO3- 形成， 参与碳酸钙 结晶的形成。而 Samata T 等 (FEBS Lett， 1999， 462(1-2) ： 225-9) 发现基质蛋白 N16、 N66 和N4重复区。
16、能形成类似甘氨酸环样的结构， 有结合Ca2+的能力， 调控结晶形成。 珍珠层基质 还可产生一些化学信号， 具有激活成骨细胞的能力 (Almeida MJ， et al ； J.Biomed.Mater. Res.2001， 57(2) ： 306-12)。Lopez 等经多年试验和研究认为珍珠母有机成分中含有类似于 BMPs( 骨形态发生蛋白 ) 的信号分子， 进入体内后， 可以扩散到骨髓中， 继而对成骨基质细 胞产生一种趋化作用， 激活骨髓中的生骨细胞， 使其分化， 产生成骨细胞， 最终诱导新骨形 成。张恩等 ( 矿物学报， 2008， 2 ： 112-116) 采用 SEM 和 HRTEM。
17、 技术发现珍珠质层是由有机 质胶结的文石组成片状晶层， 并与有机质层交互平行叠置。 同时， 在棱柱状和片状文石晶体 的截面上， 含有大量纳米级的圆形、 椭圆形等形状的有机质、 气液包裹体或孔洞。 0005 珍珠粉作为人工骨材料， 尚需解决的关键问题的是材料可塑性和成型性差， 不易 形成具有很好孔隙率和联通率的结构。而常用的化学发泡、 高温烧结等方法对珍珠粉的成 型效果差， 还容易导致使珍珠粉中具有骨诱导作用的活性成分失去活性， 因此选择合适而 先进的多孔支架制造工艺， 包括辅料和成型方法的选择， 是珍珠粉材料能否有效应用于骨 修复再生的关键问题。 发明内容 说 明 书 CN 101496908。
18、 B 4 2/7 页 5 0006 本发明的一个目的是提供一种新的用于制备人工骨生物支架材料的组合物。 0007 本发明的另一个目的是提供一种人工骨生物支架材料， 该材料具有高孔隙率和高 连通率， 同时具有较好的机械强度。 0008 本发明的另一个目的是提供一种制备上述人工骨生物支架材料的方法。 0009 珍珠粉作为人工骨材料， 尚需解决的关键问题是材料可塑性和成型性差， 不 易形成具有很好孔隙率和连通率的结构。而聚乳酸 (Polylactic acid， PLA) 是由 丙交酯 (LA) 在一定条件下聚合而成的可降解高分子材料， 聚乳酸 / 乙醇酸共聚物 (polylactide-co-gl。
19、ycolide， PLGA) 则是由丙交酯 (LA) 和乙交酯 (GA) 在一定条件下聚合 而成的可降解高分子材料。这两种材料具有可塑性高， 降解快， 易成形的特点， 具有良好的 生物相容性和骨传导性能， 能进行完全的生物降解， 其降解产物可以进入人体的代谢途径， 最终转化为二氧化碳和水， 这两种材料已经 FDA 批准广泛应用于注射用微胶囊、 微球及埋 植剂等缓释制剂的辅料， 同时可用作组织工程细胞培养的多孔支架。 0010 发明人经大量实验发现， 以生物相容的高分子材料PLA和PLGA为成型辅料与珍珠 层粉复合， 可以弥补其不易成形之不足， 同时可调节成型支架的孔隙率、 孔径和机械强度。 0。
20、011 因此， 发明人制备了一种新型组合物， 该组合物包括 PLGA， PLA 和珍珠粉， 所述组 合物中 PLGA PLA( 质量比 ) 为 1 1-10 1， 优选 3 1-5 1 ； PLGA/PLA 混合物珍 珠粉 ( 质量比 ) 为 1 1-10 1， 优选 2 1-4 1， 最优选为 7 3 ； 所述的珍珠粉粒度 在 2000 目以下， 优选直径为 1-10 微米， 更优选为 3-6 微米。 0012 上述组合物中， PLGA PLA( 质量比 ) 为 1 1-10 1， 优选 3 1-5 1。所述 的 PLGA 中 LA/GA 的比例为 90/10、 80/20、 75/25、 。
21、60/40、 或 50/50， 优选 LA/GA 为 50/50。在 该组合物中， PLA 的加入是为了调节最后制成的人工骨生物支架材料的机械强度， 增加其比 例可以改善支架结构的稳定性和力学性能要求。 0013 将上述比例的 PLGA、 PLA 溶解于有机溶剂， 有机溶剂可选择 1， 4- 二氧六环或 1， 4- 二氧六环与超纯水的混合液体， 优选 1， 4- 二氧六环与超纯水的混合液体， 混合液体中 超纯水约占总体积的 1 -20， 优选为 5 -10。将 PLGA、 PLA 溶解于有机溶剂后， 然后 按照 PLGA/PLA 混合物珍珠粉 ( 质量比 ) 以 1 1-10 1， 优选 2 。
22、1-4 1， 最优选为 7 3 的比例加入珍珠粉成为制备人工骨生物支架材料的成形浆料。其中， 所述的珍珠粉 粒度在 2000 目以下， 优选直径为 1-10 微米， 更优选为 3-6 微米。为提高珍珠粉的生物相容 性， 降低免疫原性， 上述珍珠粉优选部分去蛋白珍珠粉或完全去蛋白的珍珠粉。 经过特殊的 部分脱蛋白处理后珍珠粉的生物相容性可进一步提高， 同时保留具有骨诱导活性的生物因 子。完全脱蛋白的珍珠粉， 则保留 100nm 级别的规则片层间隙和圆形孔洞结构， 该结构有助 于营养物质扩散、 成骨细胞增殖和骨的生成。 0014 上述成形浆料可用于制备人工骨生物支架材料， 在低温环境中浆料中均匀的。
23、聚 酯溶液发生固 - 液相分离 / 液 - 液相分离， 生成溶剂结晶和富聚酯相结晶， 然后在更低的 温度下分离的两相均凝固成固体。真空冷冻干燥环境中有机溶剂迅速挥发， 最终形成含有 PLGA、 PLA 和珍珠粉的组合物， 所述组合物中 PLGA PLA( 质量比 ) 为 1 1-10 1， 优选 3 1-5 1 ； PLGA/PLA 混合物珍珠粉 ( 质量比 ) 为 1 1-10 1， 优选 2 1-4 1， 最 优选为 7 3 ； 所述的珍珠粉粒度在 2000 目以下， 优选直径为 1-10 微米， 更优选为 3-6 微 米。 说 明 书 CN 101496908 B 5 3/7 页 6 0。
24、015 在骨修复中， 临床需要最为迫切的是具有较大体积、 有特定外型、 结构复杂的骨支 架材料。 良好的孔隙率是组织工程骨快速血管化、 并被自体骨替代的基础。 对于大段骨支架 材料制造， 普通的燃烧、 发泡等方法， 在孔隙率和力学性能上都不能满足要求， 而快速成型 (RPM)制造技术是目前最具前景的选择。 由于快速成型技术对支架结构的可控性， 使得对支 架结构的设计成为可能， 而结构不但影响人工骨的孔隙率、 连通率、 血管化， 也决定了材料 的力学性能。美国 MIT 和普林斯顿大学的研究者， 近年成功利用快速成型设备， 制造出了人 工骨料， 目前产品已完成动物实验， 进入临床前审批 (Sher。
25、wood JK， et al ； Biomaterials， 2002， 23(24) ： 4739-51)。德国 Seitz H 等 (J.Biomed.Mater.Res.B.Appl.Biomater ； 2005， 74(2) ： 78-28) 用 3D 打印技术， 成功制造了内部具有复杂通道和孔隙的骨材料， 材料呈现良 好的机械强度， 目前开始进入了产业化开发。 0016 利用前述的成形浆料， 采用用低温快速成型的方法可以构建具有高孔隙率和连通 率的人工骨生物支架材料。本发明提出的制备上述用于骨修复的生物复合材料支架的方 法， 包括以下步骤 ： 0017 (1)、 制备部分脱蛋白珍珠。
26、粉或完全脱蛋白珍珠粉 ； 0018 (2)、 制备含 PLGA， PLA 和珍珠粉的浆料 ； 0019 (3)、 通过 3D 软件设计具有高孔隙率和连通率的三维支架 ； 0020 (4)、 利用低温快速成型系统使三维支架成型。 0021 在步骤 (1) 中， 取粒度在 2000 目以下的微米级珍珠粉干燥， 然后用振动筛对其进 行筛分以获得优选直径为1-10微米、 更优选为3-6微米的珍珠粉， 随后对珍珠粉进行脱脂， 表面脱钙， 部分脱蛋白或完全脱蛋白处理， 干燥后消毒备用。 0022 在步骤 (2) 中， 将质量比为 1 1-10 1( 优选 3 1-5 1) 的 PLGA 和 PLA 溶 解。
27、于有机溶剂， 所述有机溶剂选自氯仿、 二甲基亚砜、 1， 4- 二氧六环或 1， 4- 二氧六环与超 纯水的混合液体， 优选 1， 4- 二氧六环与超纯水的混合液体， 混合液体中超纯水约占总体积 的 1 -20， 优选为 5 -10。将 PLGA、 PLA 溶解于有机溶剂后， 然后按照一定的比例加 入步骤 (1) 中的珍珠粉制成成形浆料备用， 所述的 PLGA/PLA 混合物珍珠粉 ( 质量比 ) 为 1 1-10 1， 优选 2 1-4 1， 最优选为 7 3 ； 0023 在骨修复中， 组织细胞的长入、 新血管的生成、 营养物和代谢物的交换和支架材料 的降解都要求支架具有高孔隙率和连通率。。
28、 支架孔隙率太低， 表面积太小， 则孔隙之间的贯 通性不好， 不利于组织的长入 ； 由于与体液的接触面积小， 也不利于支架在体内的降解。因 此， 在保证支架结构的稳定性和要求的力学性能的前提下， 支架应具有尽量高的孔隙率和 连通率。在步骤 (3) 中， 用 3D 软件 ( 例如 Solidworks) 设计具有高孔隙率和连通率的支架 模型 ； 根据实际需要， 利用3D软件设计任意形状的支架模型， 将设计好的CAD模型尺寸储存 为 STL 文件。用 Aurora 软件打开模型 STL 文件， 对 STL 文件进行检验和修正后， 采用大孔 结构单元对其进行三维填充处理， 构建含有规则的孔径 100。
29、 500m 大孔结构， 大孔结构 的XYZ轴三个方向贯通 ； 对填充后的STL文件进行分层和层片内的填充处理 ； 经检验/修正 后转换成可以驱动机构本体子系统的扫描矢量。 0024 在殷华公司快速成型系统的基础上， 加装低温成型室和温控系统。将分层信息文 件输入 Cark 成形控制软件中， 自动生成坐标路径等信息 ； 运动控制卡控制 X、 Y、 Z 三个方向 的步进电机驱动系统， 控制生物材料成型喷头成型位置， 增压喷头在驱动单元控制下， 稳定 说 明 书 CN 101496908 B 6 4/7 页 7 的挤出成形浆料。在低温成形室内， 浆料的迅速降温， 浆料中均匀的聚酯溶液发生固 - 液相。
30、 分离/液-液相分离， 生成溶剂结晶和富聚酯相， 然后在更低的温度下分离的两相均凝固成 固体。 从低温成形室中取出的冷冻支架， 被直接放入冷冻干燥机中去除溶剂和支撑材料。 在 冷冻干燥机中的真空环境中， 冷冻支架中的溶剂发生升华， 得到具有微孔结构的支架。 支架 的这种微孔结构直接取决于相分离过程中形成的两相结构， 溶剂结晶相相形成孔隙， 富聚 酯相形成孔壁， 珍珠粉末弥散分布在孔壁中。 0025 根据上述方法制备的人工骨生物支架材料， 其宏观结构为具有 100-500m 孔径 通道， 微结构为具有 10-20m 微孔的三维支架结构， 其中微孔壁弥散分布着微米级珍珠 粉， 珍珠粉具有 100n。
31、m 级别的规则片层间隙和圆形孔洞结构。支架孔隙率为 60 -90， 大 孔结构的 X、 Y、 Z 轴三个方向贯通， 具有 100的贯通率 ； 该人工骨生物支架材料为成骨细胞 提供生长的三维空间和足够的内外表面积， 有利于细胞悬液浸入和黏附， 获得足够营养物 质， 进行气体交换， 排出代谢产物， 使细胞按预制形态的三维空间生长， 最终形成骨组织。 0026 本发明以 PLGA/PLA 材料作为基体复合珍珠粉的复合材料和以低温快速成型技术 获得的支架结构， 具有以下主要优点 ： 0027 1. 珍珠粉具有良好的生物相容性、 诱导性， 珍珠粉降解时产生的钙离子可以为新 生骨组织所利用， 促进骨组织的。
32、再生 ； 珍珠层中的蛋白可刺激成骨细胞分化和增殖， 激活成 骨细胞活性、 参与碳酸钙结晶的形成 ； 经特殊的部分脱蛋白处理后珍珠粉的生物相容性进 一步提高， 具有骨诱导活性的活性因子得到保留。完全脱蛋白的珍珠粉， 则保留 100nm 级别 的规则片层间隙和圆形孔洞结构， 有助于营养物质扩散、 骨细胞增殖和骨的生成。 0028 2. 加入 PLGA/PLA 充当珍珠粉的粘接剂， 使材料的加工成形更为方便， 采用低温快 速成型技术， 避了其它剧烈的方法导致珍珠粉诱导骨活性丧失， 珍珠粉内规则纳米结构的 破坏。构建的支架孔隙率为 60 -90。支架整体结构完成设计要求， 支架具有规则的大 孔结构和通。
33、道， 大孔结构的 X、 Y、 Z 轴三个方向贯通， 具有 100的贯通率 ； 0029 3. 提供足够的机械性能是一个支架的关键要求， 如果支架不能提供在一系列 坚硬组织 (10-1500MPA) 或软组织 (0.4-350MPA) 的机械模量， 那么任何一个新生组织的 成形也可能会过度变形而失败。本发明制造的支架结构， 的测量值分别为压缩弹性模量 17.831.73MPa-25.622.35MPa 和抗压强度 0.670.07MPa-1.470.11MPa， 复合材料 拥有比单一的 PLGA/PLA 更高的强度以及比单一的珍珠粉更好的韧性， 综合力学性能得到 了优化。 0030 4. 分级结。
34、构的设计， 满足了骨生长的空间条件， 大孔结构规则圆润， 孔径 100 500m 有助于诱导血管和含有哈佛氏系统的成熟骨长入， 大孔的孔壁中布满孔径 100m 以下圆润的微孔结构有助于细胞团生长、 以及复合弥散分布的珍珠粉和其他生长因子并实 现可控缓释 ； 微孔的孔壁厚度为 1-10m， 珍珠粉 100nm 级别的规则片层间隙和圆形孔洞结 构， 有助于营养物质扩散、 成骨细胞增殖和骨的生成， 可增加支架的骨诱导活性 0031 下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明， 本发明的保护范围并不局限于实 施例， 凡是根据本发明公开的内容或原理实施的任何本领域的等同替换， 均属于本发明的 保护范围。 。
35、附图说明 说 明 书 CN 101496908 B 7 5/7 页 8 0032 图 1 为低温快速成型装置结构和喷头成型过程图， 在殷华公司快速成型系统的 基础上， 加装低温成型室和温控系统。成形室的空间大小为 300mm(X 方向 )320mm(Y 方 向 )700mm(Z 方向 )， 顶部敞开， 制冷装置分布在成形室的一侧， 另一侧有可以打开的操作 门， 最低的制冷温度为 -40， 恒温能力为 2。其中， 图 1 中 (1) 为 Y 轴滑块， (2) 为 X 轴滑块， (3) 为储料罐， (4) 为 Z 轴滑块， (5) 为喷头固定架， (6) 为送料软管， (7) 为隔热软 膜， (8。
36、) 为低温成型室， (9) 为喷头， (10) 为已成型支架， (11) 为工作台。 0033 图 2 为三维支架多级结构图， 其中 2-A 为整体结构 ； 2-B 为横截面大孔阵列结构 ； 2-C 为大孔结构 ( 电子显微镜 ) ； 2-D 为微孔结构 ( 电子显微镜 )。 0034 图3为PLGA/PLA、 珍珠粉复合材料支架和新西兰白兔骨髓间充质干细胞共培养10 天后的电子显微镜图， 显示 MSC 细胞在支架内大量增殖。 0035 附图 4 为 PLGA/PLA、 珍珠粉复合材料支架和新西兰白兔骨髓间充质干细胞共培养 10 天， 抗 I 型胶原蛋白抗体免疫组织化鉴定图， 图片背景为绿色。。
37、 0036 附图 5 为 PLGA/PLA、 珍珠粉复合材料支架和新西兰白兔骨髓间充质干细胞共培养 培养 21 天， 天茜素红染色诱导生成的钙结节图， 图中背景为黑色， 斑点为红色钙结节。 具体实施方式 0037 实施例 1 0038 取珍珠粉 ( 浙江山下湖珍珠集团 )， 用振动筛对其进行 -2000 目和 +3000 目的 筛分以获得直径在 1m-10m 的珍珠粉， 随后对珍珠粉用 1 1 氯仿 / 甲醇脱脂 12h ； 37 PBS+NaOH+NaN3 混合液浸泡 12h 后三蒸水漂洗 ； 37 200g/L H2O2浸泡 6h 以部分脱蛋 白 ； 三蒸水反复漂洗 6 次， 放入 37恒。
38、温干燥箱中干燥 ； 密封包装， 钴 60 消毒备用。 0039 PLGA/PLA(3 1) 按照 15 (w/v) 的浓度溶解于 1， 4- 二氧六环 ( 上海化学试剂 采购供应五联化工厂， 分析纯 ) 有机溶剂， 40搅拌溶解， 构成的液 - 液相分离体系的浊点 为 28； 按照 PLGA/PLA ： 珍珠粉 70/30(w/w) 的比例加入珍珠粉末后制备成形浆料 ； 30 常温保存备用。 0040 用 3D 软件 Solidworks 构建设计好的三维结构， CAD 模型尺寸 ： 222cm3， 用 Aurora 软件打开 3D 支架模型 STL 文件， 对 STL 文件进行检验和修正后，。
39、 采用大孔结构单元 对其进行三维填充处理， 构建含有规则的孔径 200m 大孔结构， 大孔结构的 XYZ 轴三个方 向贯通 ； 对填充后的STL文件进行分层和层片内的填充处理， 生成层片文件(SLI， CLI)和网 格文件 (NET) 网格宽度 ： d 1mm ； 经检验 / 修正后转换成可以驱动机构本体子系统的扫描 矢量驱动设备成型 ( 殷华公司快速成型系统， 图 1)。低温成型室温度为 -30； 喷头转速控 制频率为 200Hz ； 扫描速度为 6mm/s。 0041 在低温成形室内， 浆料的迅速降温， 浆料中均匀的聚酯溶液发生固 - 液相分离 / 液 - 液相分离， 生成溶剂结晶和富聚酯。
40、相， 然后在更低的温度下分离的两相均凝固成 固体。从低温成形室中取出的冷冻支架， 被直接放入冷冻干燥机中去除溶剂和支撑材料 (-40 )。在冷冻干燥机中的真空环境中， 冷冻支架中的溶剂发生升华， 得到具有微孔结构 的支架 ( 图 2-A， 图 2-B)。支架的这种微孔结构直接取决于相分离过程中形成的两相结构， 溶剂结晶相相形成孔隙， 富聚酯相形成孔壁， 珍珠粉末弥散分布在孔壁中。 支架的宏观结构 具有 100-500m 孔径通道 ( 图 2-C)， 微结构为具有 10-20m 微孔 ( 图 2-D) 的三维支架结 说 明 书 CN 101496908 B 8 6/7 页 9 构， 其中微孔壁弥。
41、散分布着微米级珍珠粉。 孔隙率为79， 大孔结构的X、 Y、 Z轴三个方向贯 通， 具有 100的贯通率 ； 支架压缩弹性模量 18.711.61MPa 和抗压强度 0.920.06MPa。 0042 实施例 2 0043 取珍珠粉 ( 浙江山下湖珍珠集团 )， 振动筛对其进行 2000 目的筛分以获得直径在 3-6m 的珍珠粉， 随后对珍珠粉用 1 1 氯仿 / 甲醇脱脂 12h ； 37 PBS+NaOH+NaN3 混合液 浸泡 12h 后三蒸水漂洗 ； 37 200g/L H2O2浸泡 24h 以完全脱蛋白 ； 三蒸水反复漂洗 6 次， 放入 37恒温干燥箱中干燥 ； 密封包装， Co6。
42、0 照射消毒备用。 0044 配置 1， 4- 二氧六环 ( 上海化学试剂采购供应五联化工厂， 分析纯 ) 和水的混合 液， 其中混合液中水的含量为 5 (V水/V总)。PLGA/PLA(4 1) 按照 15 (w/v) 的浓度溶 解于混合液， 40搅拌溶解 ； 按照 (PLGA+PLA)/ 珍珠粉 65/35(w/w) 的比例加入珍珠粉末 后制备成形浆料 ； 30常温保存备用。 0045 3D 软件 Solidworks 构建设计好的三维结构， CAD 模型尺寸 ： 1.51.55cm3， 用 Aurora 软件打开 3D 支架模型 STL 文件， 对 STL 文件进行检验和修正后， 采用大。
43、孔结构单元 对其进行三维填充处理， 构建含有规则的孔径 200m 大孔结构， 大孔结构的 XYZ 轴三个方 向贯通 ； 对填充后的STL文件进行分层和层片内的填充处理， 生成层片文件(SLI， CLI)和网 格文件 (NET) 网格宽度 ： d 0.5mm ； 经检验 / 修正后转换成可以驱动机构本体子系统的扫 描矢量驱动设备成型。成型室温度为 -30； 喷头转速控制频率为 250Hz ； 扫描速度为 5mm/ s。 0046 在低温成形室内， 浆料的迅速降温发生固 - 液相分离 / 液 - 液相分离， 生成溶剂结 晶和富聚酯相， 然后在更低的温度下分离的两相均凝固成固体。从低温成形室中取出的。
44、冷 冻支架， 先放入液氮中保存 10min， 然后放入冷冻干燥机中去除溶剂和支撑材料 (-40 )。 在冷冻干燥机中的真空环境中， 冷冻支架中的溶剂发生升华， 得到具有微孔结构的支架。 支 架的宏观结构具有100m孔径通道， 微结构为具有10-20m微孔的三维支架结构， 其中微 孔壁弥散分布着微米级珍珠粉。孔隙率为 85， 大孔结构的 X、 Y、 Z 轴三个方向贯通， 具有 100的贯通率 ； 支架压缩弹性模量 19.881.87MPa 和抗压强度 0.980.08MPa。 0047 实施例 3 0048 取实施例 1 制备的复合材料支架和新西兰白兔骨髓间充质干细胞 (MSCs)， 共培养 于。
45、三维细胞 / 组织培养系统 (RCCSTM， NASA)， 培养 10 天后， 戊二醛 4固定， 以乙酸 4后固 定 1h 后， 醋酸铀 - 枸橼酸铅双重染色， 扫描电子显微镜观察结构 ( 图 3)。显示细胞在三维 支架结构内生长、 增殖、 迁移良好， 细胞在三维空间内按照一定的方向伸展， 并在孔隙内形 成网状结构， 并留下营养物质通过的通道。 0049 实施例 4 0050 取实施例 1 制备的复合材料支架和新西兰白兔骨髓间充质干细胞 (MSCs)， 共培养 于三维细胞 / 组织培养系统 (RCCSTM NASA)， 培养 10 天后， 取出支架， 10中性福尔马林溶 液固定 30 分钟， 。
46、用 FITC 标记的抗 I 型胶原蛋白抗体进行免疫组织化鉴定， 荧光显微镜观察 ( 图 4)， 可见 90以上的细胞和结构体表达绿色荧光。I 型胶原约占骨组织有机物含量的 90， 研究证明支架内 MSC 细胞大量分化为成骨细胞， 合成骨骼的重要成分。 0051 实施例 5 0052 取实施例 1 制备的复合材料支架和新西兰白兔骨髓间充质干细胞 (MSCs)， 共培养 说 明 书 CN 101496908 B 9 7/7 页 10 于三维细胞/组织培养系统(RCCSTM NASA)， 培养21天后， 取出支架， 4多聚甲醛固定30分 钟， 天茜素红染色诱导生成的钙结节， 可见支架内在细胞聚集的部。
47、位出现大量红色钙结节， 支架呈现显著的骨诱导活性 ( 图 5)。 说 明 书 CN 101496908 B 10 1/6 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 101496908 B 11 2/6 页 12 图 2-A 图 2-B 说 明 书 附 图 CN 101496908 B 12 3/6 页 13 图 2-C 说 明 书 附 图 CN 101496908 B 13 4/6 页 14 图 2-D 说 明 书 附 图 CN 101496908 B 14 5/6 页 15 图 3 说 明 书 附 图 CN 101496908 B 15 6/6 页 16 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 101496908 B 16 。