技术领域
本发明属于用于人体骨组织修复的人工骨材料，具体涉及一种复合型磷酸钙人工骨及其制备方法。
背景技术
人体组织的损伤修复是现代医学力求解决的难题之一。骨骼作为人体重要的组织器官,往往因为疾病或外伤等原因造成不同程度的骨缺损，临床上通常采用人工材料进行修复和矫治。近年来,在骨修复材料领域,磷酸钙骨水泥是目前研究较多并被认为是很有发展前景的一种生物活性人工骨材料。
磷酸钙骨水泥(calciumphosphatecement,CPC)是指一类以各种磷酸钙盐为主要成份,在生理条件下具有自固化能力及降解活性、成骨活性的无机材料。作为一种新型的自固化生物材料，磷酸钙骨水泥较传统人工骨材料的理化、生物学性能更为优良。
现有磷酸钙人工骨产品主要存在两方面的不足:第一,力学性能上还存在着较大的缺陷，它脆性大,强度低,耐压及抗弯强度仅与松质骨相当,限制了临床应用；第二，体内降解性差，主要表现为人工骨植入体内初期，细胞的粘附、生长与增殖速度缓慢，人工骨难以与新生骨组织较快的生长速率相匹配，很大程度上影响了人工骨的临床应用效果。
在申请号为201410072035.6专利文献中，公开了一种改善磷酸钙骨水泥韧性的方法,取磷酸钙骨水泥涂抹在PLGA纳米纤维膜表面形成单层状复合,将PLGA纳米纤维膜由一端同轴卷至另一端,固化制得固化体，有效改善了磷酸钙骨水泥脆性大的问题。
在申请号为201410137741.4专利文献中，公开了一种制备电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料的方法。把电纺纤维直接纺入含有壳聚糖、柠檬酸和葡萄糖的壳聚糖溶液中；然后与固体磷酸盐混合物调配,即得所述电纺纤维增强磷酸钙骨水泥复合材料，有效改善了磷酸钙骨水泥强度低的问题。
在上述的研究中，廖红兵、刘华等人通过不同的制备方法，将静电纺丝纳米纤维复合于磷酸钙人工骨中，仅仅针对磷酸钙人工骨脆性大、强度低等问题提高了人工骨的力学性能，并未改善磷酸钙人工骨体内降解性差，组织初期生长缓慢等生物性能方面的缺点。在现有公开的文献报导中，也未见针对解决磷酸钙人工骨生物性能方面问题的相关研究。
在生物组织工程领域，静电纺丝技术制备出的纳米纤维膜具有三维多孔结构，纤维直径在几十纳米到几微米之间，与细胞外基质在尺寸和形貌上存在一定的相似性，因而被经常用于模拟天然的细胞外基质。此外，因纳米纤维膜拥有较高的比表面积和孔隙率，更加有利于细胞的粘附、生长和增殖，是制备细胞培养载体、组织工程支架、伤口创伤敷料、药物缓释剂的优良材料。
静电纺丝技术的原理是将聚合物溶液或熔体置于由发射装置与接收装置产生的高压静电场中,聚合物液滴在电场库仑力的作用下，克服表面张力形成喷射细流，纤维丝素蒸发固化,最终落在接收装置表面,形成无纺布状的微/纳米纤维膜。
若将静电纺丝纳米纤维膜包覆于上述的磷酸钙人工骨材料表面，则可提高人工骨诱导组织再生的能力,帮助材料初期促进骨生长，即制备出既有磷酸钙人工骨优良的理化、生物学性能，又兼备静电纺丝纳米纤维膜优异的组织再生诱导性能的新型人工骨复合材料。
但当前的静电纺丝技术，还无法实现在非导体材料上直接纺丝包覆。因此,实现静电纺丝纳米纤维膜与磷酸钙人工骨的直接复合是解决该项技术的关键。
发明内容
本发明旨在解决现有磷酸钙人工骨体内降解性差，组织生长初期材料诱导能力弱的问题，提出一种复合型磷酸钙人工骨及制备方法。该复合型磷酸钙人工骨具有优异的诱导组织再生性能。
本发明复合型磷酸钙人工骨，是在由常规制备工艺获得的磷酸钙人工骨基体表面上具有直接通过静电纺丝包覆的左旋聚乳酸-玉米醇溶蛋白纳米纤维层。
所述的左旋聚乳酸-玉米醇溶蛋白纳米纤维是由左旋聚乳酸和玉米醇溶蛋白构成的同轴核、壳结构纤维丝。
在生物组织工程领域已获得普遍证实，通过静电纺丝技术制备出的纳米纤维膜具有三维多孔结构，纤维直径在几十纳米到几微米之间，与细胞外基质在尺寸和形貌上存在一定的相似性，因而被经常用于模拟天然的细胞外基质。此外，因纳米纤维膜拥有较高的比表面积和孔隙率，更加有利于细胞的粘附、生长和增殖，是制备细胞培养载体、组织工程支架、伤口创伤敷料、药物缓释剂的优良材料。
因此，本发明通过静电纺丝直接将纳米纤维膜包覆于磷酸钙人工骨基体表面，有效的提高了人工骨诱导组织再生的能力,促进骨生长，该复合型磷酸钙人工骨既有磷酸钙人工骨优良的理化、生物学性能，又兼备静电纺丝纳米纤维膜优异的组织再生诱导性能。
本发明复合型磷酸钙人工骨的制备方法，包括以下步骤：
a.磷酸钙人工骨的制备：将磷酸钙粉末与凝固液在无菌条件下混合并快速搅拌注入模具中，待固化成型后脱模晾置硬化后待用；
b.纺丝溶液的制备：将左旋聚乳酸、玉米醇溶蛋白分别溶于六氟异丙醇有机溶剂中，磁力搅拌3h，即获得分别为6％、14％质量比的左旋聚乳酸纺丝溶液和玉米醇溶蛋白纺丝溶液；将该两种纺丝溶液分别置入连接静电纺丝机多流体同轴喷头的供液装置中；
c.在静电纺丝机下纺丝包覆：将步骤a制得的磷酸钙人工骨安设在本发明提供的专用静电纺丝辅助接收装置中的载样台上，调节载样台高度使磷酸钙人工骨处于相对静电纺丝辅助接收装置极板中心，并通过调整纺丝喷头位置和极板位置确定试样与喷头间的纺丝距离和试样与极板间的距离，磷酸钙人工骨在辅助接收装置中自旋转状态下进行纺丝；
d.纺丝结束后，在真空干燥机中，常温干燥3-7天，即获得表面包覆左旋聚乳酸-玉米醇溶蛋白同轴核、壳结构纳米纤维层的复合型磷酸钙人工骨。
步骤c中所述本发明提供的专用静电纺丝辅助接收装置，包括一绝缘体台架、固设在该台架上的绝缘体滑轨、设置在绝缘体滑轨上可沿滑轨纵向移动的导体座板、插置在导体座板上的其板面垂直于导体座板移动方向的极板，在对应极板中心线一侧的绝缘体台架上设置的旋转台及设置在该旋转台中心上的可调整高度的载样台；所述的旋转台与设置在绝缘体台架内的电机驱动连接；所述的导体座板的一端与静电纺丝机的高压静电发生装置负极相连接，所述的电机与变速控制器电联接。
所述的导体座板设有数个平行分布的极板插槽，根据纺丝工艺需要插置一块或数块所述的极板。
本装置的使用方式是：
将该装置置于静电纺丝机的纺丝喷头的前方，使纺丝喷头轴线垂直于极板平面并与旋转台中心线处于同一平面上，通过移动导体座板位置实现调整加工试样与极板的距离，通过调整载样台的高度使试样处于极板电场中心，通过变速控制器调整旋转台转速。
静电纺丝,通常情况下，当使用固定收集器时，纳米纤维呈现随机不规则形态；当使用旋转式收集器时，纳米纤维趋向平行规则排列。在本发明中，将磷酸钙人工骨置于转速可控的旋转台上，使其纤维喷附缠绕在磷酸钙人工骨表面，当转速达到500-1000RPM时可以得到平行于旋转方向的有序纤维。通过旋转式收集装置，利用旋转的磷酸钙人工骨对纺丝溶液射流的物理牵伸作用达到控制纤维定向排列的效果。
实验表明，静电纺丝辅助接收装置中平行分布的极板的层数与电场强度存在一定的正比关系。随着平行极板层数的增加，电场强度随之增大，高分子静电纺丝液的射流受到更大的静电斥力作用，最终使得电纺纤维更有效的喷附于磷酸钙人工骨表面。
实验表明，在静电纺丝辅助接收装置工作中，当电压一定时，纺丝液喷射流所受静电力与极板面积有关：极板面积越小，极板电荷密度越大，纺丝喷头与极板中心的电场强度越高，纺丝液射流所受静电力越集中。通过调节极板面积与磷酸钙人工骨接收面积的比例来控制纺丝效果。具体而言，若极板面积过大，射流纤维趋于分散而无法集中于极板前方的人工骨表面；若极板面积过小，虽然纺丝喷头与极板中心形成较高的电场强度，但是位于极板前方的磷酸钙人工骨阻挡了喷射流大部分静电力作用，纤维极易改变原本纺丝方向，向四周散漫喷射。因此，对应不同体积的磷酸钙人工骨试样，设定不同面积的接收极板有助于纳米纤维的集中喷射与粘附。实验表明，磷酸钙人工骨试样接收面积与极板面积比约为S1:S2＝1:20时，得到最优纺丝效果，纤维喷射方向稳定集中，可实现静电纺丝纳米纤维在磷酸钙人工骨表面的均匀喷附。
本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
本发明有效的解决了在静电纺丝机上对非导体材料直接进行纳米纤维膜的包覆复合，获得了磷酸钙人工骨表面包覆纳米纤维膜的新型复合材料。
该复合材料可大大改善人工骨体内降解性差,细胞在材料植入体内初期的粘附、生长与增殖速度慢，材料难以与新生骨组织较快的生长速率相匹配等问题。该技术提高了人工骨的生物性能，使材料具有更强的诱导组织生长作用，可有效提高磷酸钙人工骨在植入体内初期的细胞生长诱导性能，具有广阔的应用前景。本发明工艺设备简单，易于操作，成本较低。
附图说明：
图1为静电纺纳米纤维丝包覆磷酸钙人工骨的工作状态示意图；
图2为本发明制得的复合型磷酸钙人工骨外观照片图；
图3为实施例3制得的复合型磷酸钙人工骨在10kv电压下的截面扫描电镜图；
图4A、B为实施例3制得的复合型磷酸钙人工骨在不同倍率下的局部截面扫描电镜图。
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明进一步说明，但这些实施例仅用于解释本发明，并非对本发明的具体限定。
以下为采用不同工艺参数下的复合型磷酸钙人工骨的制备。
实施例1
1、磷酸钙人工骨的制备：取0.70g磷酸钙粉末、0.32ml凝固液在无菌条件下混合，快速搅拌并置入模具中，等待6min，将磷酸钙人工骨从模具中缓慢推出，晾置10min左右，试样进一步固化，制得直径6mm，高10mm的圆柱状磷酸钙人工骨材料。
2、纺丝液的制备：称取左旋聚乳酸0.1019g，玉米醇溶蛋白0.2598g，分别溶于1ml六氟异丙醇有机溶剂中,磁力搅拌3h。
3、安装纺丝液：将步骤2所得的左旋聚乳酸纺丝液与玉米醇溶蛋白纺丝液分别作为同轴结构的核、壳部分纺丝液分别置入连接静电纺丝机多流体同轴喷头的供液装置中；设定静电纺丝条件:纺丝电压15kv、纺丝距离12cm、核纺丝速率为0.36ml/h、壳纺丝速率为0.48ml/h。
4、安装磷酸钙人工骨：将步骤1所得磷酸钙人工骨试样安设于本发明所提供的辅助接收装置中的载样台上(如图1所示)，调节高度调节杆，使得试样位于极板中心。根据实验设定的纺丝距离(纺丝喷针头与试样的距离)，放置辅助接收装置。
5、设定辅助接收装置工作条件：选择2个尺寸为3.5×3.5cm的极板插置于导体座板上。在绝缘体滑轨上移动导体座板，调节极板与试样的距离为1cm。设定试样转速为30RPM。
6、纺丝：静电纺丝机中，高压电场的正极连接纺丝针头，负极连接辅助接收装置中的极板(如图1所示)。开启辅助接收装置开关，磷酸钙人工骨在装置内开始自旋转运动，启动推进器，打开高压电源，即可开始纺丝。
7、根据所需材料的纤维包覆厚度，选择纺丝时间10min。纺丝结束后，将试样置于真空干燥机中，常温干燥3天。即获得表面包覆左旋聚乳酸/玉米醇溶蛋白同轴核、壳结构纳米纤维层的复合型磷酸钙人工骨。其纳米纤维层的厚度为12μm，纳米纤维丝的平均直径为378nm。
本发明所提供的辅助接收装置如图1所示，包括固设在绝缘体台架1上的绝缘体滑轨2、设置在绝缘体滑轨2上可沿滑轨纵向移动的导体座板3、插置在导体座板3上的其板面垂直于导体座板3移动方向的极板4，在对应极板4中心线一侧的绝缘体台架1上设置的可调整高度的旋转台5及设置在该旋转台中心上的载样台6；所述的旋转台5与设置在绝缘体台架1内的电机(图中未标示)驱动连接；所述的导体座板3的一端与静电纺丝机的高压静电发生装置负极相连接。图中，7为磷酸钙人工骨试样、8为静电纺丝机多流体同轴喷头。
实施例2
1、磷酸钙人工骨的制备：取1.45g磷酸钙粉末、0.65ml凝固液在无菌条件下混合，快速搅拌并置入模具中，等待7min，将磷酸钙人工骨从模具中缓慢推出，晾置10min左右，试样进一步固化，制得直径6mm，高20mm的圆柱状磷酸钙人工骨材料。
2、纺丝液的制备：称取左旋聚乳酸0.1019g，玉米醇溶蛋白0.2598g，分别溶于1ml六氟异丙醇有机溶剂中,磁力搅拌3h。
3、安装纺丝液：同实施例1；设定静电纺丝条件:纺丝电压15kv、纺丝距离12cm、核纺丝速率为0.36ml/h、壳纺丝速率为0.48ml/h。
4、安装磷酸钙人工骨：同实施例1。
5、设定辅助接收装置工作条件：选择3个尺寸为5×5cm的极板插置于导体座板上。在绝缘体滑轨上移动导体座板，调节极板与试样的距离为2cm。设定试样转速为300RPM。
6、纺丝：同实施例1。纺丝时间为60min，常温干燥5天。所获得的复合型磷酸钙人工骨，其纳米纤维层的厚度为68μm，纳米纤维丝平均直径为356nm。
实施例3
1、磷酸钙人工骨的制备：取3.77g磷酸钙粉末、1.70ml凝固液在无菌条件下混合，快速搅拌并置入模具中，等待8min，将磷酸钙人工骨从模具中缓慢推出，晾置10min左右，试样进一步固化，制得直径8mm，高30mm的圆柱状磷酸钙人工骨材料。
2、纺丝液的制备：称取左旋聚乳酸0.2038g，玉米醇溶蛋白0.5196g，分别溶于2ml六氟异丙醇有机溶剂中,磁力搅拌3h。
3、安装纺丝液：同实施例1；设定静电纺丝条件:纺丝电压15kv、纺丝距离12cm、核纺丝速率为0.36ml/h、壳纺丝速率为0.48ml/h。
4、安装磷酸钙人工骨：同实施例1。
5、设定辅助接收装置工作条件：选择4个尺寸为7×7cm的极板插置于导体座板上。在绝缘体滑轨上移动导体座板，调节极板与试样的距离为3cm。设定试样转速为500RPM。
6、纺丝：同实施例1。纺丝时间120min，常温干燥7天。所获得的复合型磷酸钙人工骨，其纳米纤维层的厚度为132μm，纳米纤维丝平均直径为342nm。
附图3为该实施例制得的复合型磷酸钙人工骨在15kv电压下的截面扫描电镜图。
附图4A、B为该实施例制得的复合型磷酸钙人工骨在不同倍率下的局部截面扫描电镜图。图3中a为磷酸钙人工骨、b为左旋聚乳酸/玉米醇溶蛋白纳米纤维膜。
实施例4
1、磷酸钙人工骨的制备：取1.80g磷酸钙粉末、0.80ml凝固液在无菌条件下混合，快速搅拌并置入模具中，等待7min，将磷酸钙人工骨从模具中缓慢推出，晾置10min左右，试样进一步固化，制得截面6×6mm，高50mm的方柱状磷酸钙人工骨材料。
2、纺丝液的制备：称取左旋聚乳酸0.2038g，玉米醇溶蛋白0.5196g，分别溶于2ml六氟异丙醇有机溶剂中,磁力搅拌3h。
3、安装纺丝液：同实施例1；设定静电纺丝条件:纺丝电压15kv、纺丝距离12cm、核纺丝速率为0.36ml/h、壳纺丝速率为0.48ml/h。
4、安装磷酸钙人工骨：同实施例1。
5、设定辅助接收装置工作条件：选择6个尺寸为5×5cm的极板插置于导体座板上。在绝缘体滑轨上移动导体座板，调节极板与试样的距离为6cm。设定试样转速为1000RPM。
6、纺丝：同实施例1。纺丝时间180min，常温干燥7天。所获得的复合型磷酸钙人工骨，其纳米纤维层的厚度为193μm，纳米纤维丝平均直径为369nm。
实施例5
1、磷酸钙人工骨的制备：取1.45g磷酸钙粉末、0.65ml凝固液在无菌条件下混合，快速搅拌并置入模具中，等待7min，将磷酸钙人工骨从模具中缓慢推出，晾置10min左右，试样进一步固化，制得直径6mm，高20mm的圆柱状磷酸钙人工骨材料。
2、纺丝液的制备：分别称取左旋聚乳酸0.1019g与骨形态发生蛋白2(BMP2)0.0101g混合，玉米醇溶蛋白0.2598g与地塞米松0.260g混合，分别溶于1ml六氟异丙醇有机溶剂中,磁力搅拌3h。
3、安装纺丝液：同实施例1；设定静电纺丝条件:纺丝电压15kv、纺丝距离12cm、核纺丝速率为0.36ml/h、壳纺丝速率为0.48ml/h。
4、安装磷酸钙人工骨：同实施例1。
5、设定辅助接收装置工作条件：选择3个尺寸为5×5cm的极板插置于导体座板上。在绝缘体滑轨上移动导体座板，调节极板与试样的距离为2cm。设定试样转速为300RPM。
6、纺丝：同实施例1。纺丝时间60min，常温干燥5天。所获得的复合型磷酸钙人工骨，其纳米纤维层的厚度为65μm，纳米纤维丝平均直径为354nm。
本发明方法制得的复合型磷酸钙人工骨，通过人骨髓间充质干细胞生物相容性实验，证明该材料具有优异的细胞粘附、生长和增殖、促进组织再生诱导性能。