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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610876493.4 (22)申请日 2016.10.09 (71)申请人 湖南科技大学 地址 411201 湖南省湘潭市雨湖区石马头 (72)发明人 周智华 张巧 刘文娟 潘一峰 周虎 刘清泉 王卫 (74)专利代理机构 张家界市慧诚商标专利事务 所 43209 代理人 高红旺 (51)Int.Cl. A61L 27/58(2006.01) A61L 27/56(2006.01) A61L 27/52(2006.01) A61L 27/18(2006.01) A61L 。
2、27/22(2006.01) A61L 27/20(2006.01) C08G 63/08(2006.01) (54)发明名称 一种EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微球仿生复合 支架的制备方法 (57)摘要 本发明提供一种EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微 球仿生复合支架的制备方法。 高真空下熔融聚合 制备高分子量聚丙乙交酯 （PLGA） ， 减压、 100下 接枝马来酸酐得到酸酐化聚丙乙交酯 （MPLGA） 。 在三氯甲烷溶液将乙二胺和MPLGA在室温下反应 3060min， 沉淀， 真空干燥， 得乙二胺改性MPLGA 聚合物 （EMPLGA） ， 用造孔法制备多孔EMPLGA “硬” 。
3、支架。 往含有span-80的液体石蜡中加入配制好 的明胶/明质酸混合水溶液， 戊二醛交联， 固化成 球。 将明胶和透明质酸分别加入冰醋酸溶液中溶 解， 均匀混合， 向混合溶液中加入Gel/HA微球得 到复合体系。 将EMPLGA “硬” 支架材料浸泡于复合 体系中， 抽真空2030min， 取出冷冻， 干燥， 先后 用碳化二亚胺的乙醇溶液和乙醇浸泡， 真空干燥 后得到EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微球复合支架。 本 发明制备的仿生复合支架材料兼具类天然组织 环境与良好机械强度。 权利要求书2页 说明书8页 CN 106620884 A 2017.05.10 CN 106620884 A 。
4、1.一种EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微球仿生复合支架的制备方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： （1） 将D,L-丙交酯、 乙交酯加入干燥处理后的安瓿瓶中， 再加入一定量辛酸亚锡(Sn (Oct)2)； 真空干燥1224 h后， 在常温下采用扩散泵抽高真空0.51.0 h， 使安瓿瓶内压强 低于5.0Pa， 封管； 将封管后的安瓿瓶放入恒温箱中， 在120170温度下反应1260 h后取 出； 将粗产物溶于三氯甲烷中， 配制成1.05.0wt%溶液， 然后滴入35倍体积的乙醇中沉析， 反复沉析3-5次， 将提纯后的产物真空干燥至恒重即得PLGA聚合物； （2） 将纯化后的PLGA与一定。
5、量的马来酸酐、 过氧化二苯甲酰 （BPO） 混合， 置于减压、 100 的环境中反应24h即得到MPLGA粗聚物； 将粗聚物置于Soxhelt抽提器内， 以三氯甲烷为溶 剂抽提8 h， 每小时回流46次以除去均聚物， 将抽提后的共聚物40下真空干燥至恒重； 将 共聚物加入到三氯甲烷中， 配制成15wt%溶液， 滴入35倍体积的乙醇中沉析， 反复沉析35 次， 然后将提纯物40下真空干燥至恒重， 得到纯MPLGA； （3） 将纯化后的MPLGA溶于三氯甲烷中， 配制成20.030.0wt%的MPLGA的三氯甲烷溶液； （4） 将乙二胺溶于三氯甲烷中， 配制成浓度为38.0wt%的乙二胺的三氯甲烷。
6、溶液； （5） 在搅拌的条件下， 将步骤 （4） 所得乙二胺的三氯甲烷溶液滴入到步骤 （3） 所得MPLGA 的三氯甲烷溶液中， 冰浴控制反应体系温度低于10， 保温510min， 再将温度升至室温反 应3060min， 最后将产物滴入过量的乙醇中沉析， 反复沉析35次， 用去离子水洗涤至中性， 真空干燥至恒重， 得到乙二胺改性马来酸酐化聚丙乙交酯聚合物 （EMPLGA） 固体； （6） 称取一定量EMPLGA溶入三氯甲烷中， 充分溶解后将一定量的300450 m的Na2CO3粒 子加入聚合物溶液中并搅拌均匀， 室温下挥发出大量溶剂后， 将混合物加入到钢制模具中， 压制成型； 室温下干燥6小时。
7、后将样品在稀盐酸溶液中浸泡3小时， 洗涤后再用蒸馏水浸泡 12小时， 每34小时换一次水， 得到的多孔支架在空气中干燥24小时， 真空干燥48小时； （7） 将明胶 （Gel） 和透明质酸 （HA） ， 按重量比95:5， 配制明胶/明质酸混合水溶液； 向容 器中加入液体石蜡加热至60， 再向容器中加入少量span-80， 机械搅拌； 取明胶/透明质酸 混合溶液加入到容器中， 搅拌， 使液滴均匀的分散于油相中， 所述加入容器中的明胶/透明 质酸混合溶与液体石蜡的体积比为13:87； 然后将容器置于冰水浴中， 待体系冷却， 温度低 于4后， 加入少量戊二醛作为交联剂， 交联、 固化成球； 用丙酮。
8、与水 （体积比3:1） 的混合溶 液洗涤23次， 滤去液体石蜡和水， 最后用纯丙酮洗涤， 抽滤， 自然凉干， 所得复合微球表面 光滑； （8） 取一定量冰醋酸， 用蒸馏水稀释到PH值4.7左右， 将明胶和透明质酸， 按重量比8:2 分别加入溶解， 均配制成5mg/mL的溶液； 将配制好的明胶溶液与透明质酸溶液均匀混合； （9） 向步骤 （8） 中的混合溶液中加入一定量步骤 （7） 制得的Gel/HA微球得到复合体系， 所加溶胶与微球的质量比为10:1； 将Gel/HA 溶胶与微球的复合体系置于连有真空装置的 烧瓶中， 然后将圆柱体状EMPLGA 多孔 “硬” 支架材料浸泡于复合体系中， 抽真空。
9、2030min； 将复合支架取出放入冷冻干燥机中冷冻12h， 干燥48h； 取出后， 用碳化二亚胺 （EDC） 的乙醇 溶液浸泡24h， 然后用乙醇溶液浸泡12h， 每4h 换一次水； 将浸泡好的复合支架材料放入空 气中干燥48h， 真空干燥， 得EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微球仿生复合支架。 2.根据权利要求1所述的EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微球仿生复合支架的制备方法， 其特 征在于， 步骤 （1） 中， 所述D,L-丙交酯、 乙交酯、 辛酸亚锡的重量比为： D,L-丙交酯70.0 权 利 要 求 书 1/2 页 2 CN 106620884 A 2 80.0wt%、 乙交酯2。
10、0.030.0wt%、 辛酸亚锡0.010.03wt%， 且辛酸亚锡经脱水处理。 3.根据权利要求1所述的EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微球仿生复合支架的制备方法， 其特 征在于， 步骤 （1） 中， 所述三氯甲烷溶液 （1.05.0wt%） 的浓度直接与PLGA分子量大小有关， 分子量越大， 配制的三氯甲烷溶液浓度应越小。 4.根据权利要求1所述的EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微球仿生复合支架的制备方法， 其特 征在于， 步骤 （2） 中， 所述马来酸酐的量为D,L-丙交酯、 乙交酯单体总量的510 wt%， 过氧化 苯甲酰的加入量为马来酸酐重量的15 wt%； 所述的减压环境为压力。
11、低于0.09MPa。 5.根据权利要求1所述的EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微球仿生复合支架的制备方法， 其特 征在于， 步骤 （5） 中， 所述乙二胺的加入量为MPLGA质量的20.030.0%。 6.根据权利要求1所述的EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微球仿生复合支架的制备方法， 其特 征在于， 步骤 （6） EMPLGA与三氯甲烷的浓度为1.05.0wt%， 盐酸的浓度为5.0-10.0wt%， EMPLGA与Na2CO3的质量比为1:5。 7.根据权利要求1所述的EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微球仿生复合支架的制备方法， 其特 征在于， 步骤 （7） 中， 明胶/透明质酸混合。
12、溶液的浓度为20.025.0wt%， span-80的浓度为 0.0160.020g/L， 搅拌速率200800r/min， 戊二醛的浓度为0.3mL/g。 8.根据权利要求1所述的EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微球仿生复合支架的制备方法， 其特 征在于， 步骤 （9） 中真空度为0.070.09MPa， 碳化二亚胺的乙醇溶液浓度为0.1wt%。 权 利 要 求 书 2/2 页 3 CN 106620884 A 3 一种EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微球仿生复合支架的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种可降解软/硬仿生复合软骨组织支架材料的生产技术领域， 具体 涉及一种兼具类天。
13、然组织环境与良好机械强度的仿生复合支架的制备方法， 可望应用于软 骨组织工程支架材料领域。 背景技术 0002 由于机械损伤或关节炎造成的软骨缺损是医学上长期难以克服的问题。 成年软骨 修复能力有限， 软骨缺损直径小于3mm能自发修复， 但当直径大于3mm时， 缺损部位无法自行 修复。 组织工程学技术为骨缺损的修复提供了新的方法， 它具有对供体损伤小、 无抗原性、 可制成三维立体、 解剖结构精确等优点， 因而具有广阔的应用前景。 0003 应用于软骨组织修复的合成可降解高分子主要有聚乳酸 （PLA） 、 聚丙乙交酯 （PLGA） 等。 其中PLGA由于具有一定的机械强度和易调控的降解速率， 容。
14、易宏观塑形等优点， 广泛应用于组织工程和药物缓释等领域， 但其低的亲水性、 活性基团和生物信号分子的缺 乏以及体内酸性降解产物的累积等缺陷导致其应用受到限制。 0004 目前对PLA或PLGA等进行共聚或接枝改性是改善其性能的重要方法之一。 如采用 表面可控胺解技术、 接枝-涂层、 偶联或层-层 （LBL） 自组装技术将细胞相容性物质如胶原、 纤维蛋白等固定到聚乳酸类物质表面， 可改善高聚物支架的亲水性能和细胞识别能力。 0005 马来酸酐是一种可在生物体内正常代谢的多官能团物质， 其酸酐中的碳-碳双键 可发生自由基反应。 采用接枝法将马来酸酐和脂肪二胺引入PLA或PLGA链制备可降解聚合 物。
15、， 可望在进一步提高材料亲水性能的同时有效缓解材料在降解过程中酸性物质积累的问 题。 本课题组采用D,L-丙交酯、 乙交酯和马来酸酐通过直接熔融聚合获得了马来酸酐接枝 聚丙乙交酯 （MPLGA） ， 已成功申请专利 （见ZL2013.10564511.1） ， 该方法操作简单， 获得的共 聚物中具有较高的酸酐接枝率 （2.010.0wt%） 。 在MPLGA骨架中进一步引入乙二胺， 可获得 含有碱性基团的共聚物EMPLGA （见专利ZL201410420672.8） ， 有效缓解材料在降解过程中酸 性物质积累的问题。 但由于直接熔融共聚制备MPLGA过程中共聚物的分子量受单体和马来 酸酐的纯度。
16、影响很大， 且参与反应的物质越多， 其分子量的影响因素越复杂， 实验重现性越 差， 同时获得的MPLGA分子量较小 （1.0 105Da） ， 无法满足不同医用材料的需求， 限制 了其在生物医用材料临床的应用。 0006 水凝胶在组成和性能上与正常的细胞外基质极为相似， 具有优异生物相容性： 细 胞可以悬浮于水凝胶中生长， 呈天然的球形， 有利于维持细胞的正常表型。 用于软骨组织修 复的天然水凝胶主要包括胶原、 纤维蛋白胶、 海藻酸盐、 明胶、 透明质酸和琼脂等。 但水凝胶 多孔材料存在机械强度小、 形状保持能力差以及消毒比较困难等不足。 0007 本发明采用D,L-丙交酯、 乙交酯熔融共聚获。
17、得高分子量的PLGA， 再以马来酸酐直 接接枝到PLGA骨架中， 接枝过程中PLGA分子量下降程度小， 可获得高分子量MPLGA， 进一步 引入乙二胺， 获得具有碱性功能基团的高分子量EMPLGA， 采用造孔剂法制备高分子量的 EMPLGA多孔 “硬” 支架。 说 明 书 1/8 页 4 CN 106620884 A 4 0008 通过对软骨组织细胞外基质组成和结构的仿生模拟， 将明胶/透明质酸水凝胶 “软” 支架和明胶/透明质酸微球复合到预先成型的EMPLGA “硬” 支架中。 水凝胶 “软” 支架能 为软骨细胞提供一个类天然组织的生长环境， 以有效保持软骨细胞的自然形态， 引导细胞 的正常。
18、增殖、 分化和功能表达， 明胶/透明质酸微球能复合生物活性因子， 可望实现其分步 可控释放， 进一步赋予该复合仿生支架更为优越的生物学性能。 EMPLGA “硬” 支架能在软骨 修复过程中提供足够高的机械强度、 可控的降解速率和良好的形状保持能力。 该仿生复合 支架兼具类天然组织环境与良好机械强度， 可望应用于软骨组织工程支架材料领域。 发明内容 0009 本发明的目的是提供支架兼具类天然组织环境与良好机械强度的仿生复合支架 的制备方法。 0010 本发明方法的步骤如下： （1） 将D,L-丙交酯、 乙交酯加入干燥处理后的安瓿瓶中， 再加入一定量辛酸亚锡(Sn (Oct)2)； 真空干燥122。
19、4 h后， 在常温下采用扩散泵抽高真空0.51.0 h， 使安瓿瓶内压强 低于5.0Pa， 封管。 将封管后的安瓿瓶放入恒温箱中， 在120170温度下反应1260 h后取 出。 将粗产物溶于三氯甲烷中， 配制成1.05.0wt%溶液， 然后滴入35倍体积的乙醇中沉析， 反复沉析35次， 将提纯后的产物真空干燥至恒重即得PLGA聚合物。 0011 （2） 将纯化后的PLGA与一定量的马来酸酐、 过氧化二苯甲酰 （BPO） 混合， 置于减压、 100的环境中反应24h即得到MPLGA粗聚物。 将粗聚物置于Soxhelt抽提器内， 以三氯甲烷 为溶剂抽提8 h， 每小时回流46次以除去均聚物， 将。
20、抽提后的共聚物40下真空干燥至恒 重。 将共聚物加入到三氯甲烷中， 配制成15wt%溶液， 滴入35倍体积的乙醇中沉析， 反复沉 析35次， 然后将提纯物40下真空干燥至恒重， 得到纯MPLGA。 0012 （3） 将纯化后的MPLGA溶于三氯甲烷中， 配制成20.030.0wt%的MPLGA的三氯甲烷 溶液。 0013 （4） 将乙二胺溶于三氯甲烷中， 配制成浓度为38.0wt%的乙二胺的三氯甲烷溶液。 0014 （5） 在搅拌的条件下， 将步骤 （4） 所得乙二胺的三氯甲烷溶液滴入到步骤 （3） 所得 MPLGA的三氯甲烷溶液中， 冰浴控制反应体系温度低于10， 保温510min， 再将温。
21、度升至室 温反应3060min， 最后将产物滴入过量的乙醇中沉析， 反复沉析35次， 用去离子水洗涤至 中性， 真空干燥至恒重， 得到乙二胺改性马来酸酐化聚丙乙交酯聚合物 （EMPLGA） 固体。 0015 （6） 称取一定量EMPLGA溶入三氯甲烷中， 充分溶解后将一定量的300450 m的 Na2CO3粒子加入聚合物溶液中并搅拌均匀， 室温下挥发出大量溶剂后， 将混合物加入到钢制 模具中， 压制成型。 室温下干燥6小时后将样品在稀盐酸溶液中浸泡3小时， 洗涤后再用蒸馏 水浸泡12小时， 每34小时换一次水， 得到的多孔支架在空气中干燥24小时， 真空干燥48小 时。 0016 （7） 将明。
22、胶 （Gel） 和透明质酸 （HA） ， 按重量比95:5， 配制明胶/明质酸混合水溶液。 向容器中加入液体石蜡加热至60， 再向容器中加入少量span-80， 机械搅拌。 取明胶/透明 质酸混合溶液加入到容器中， 搅拌， 使液滴均匀的分散于油相中， 所述加入容器中的明胶/ 透明质酸混合溶与液体石蜡的体积比为13:87。 然后将容器置于冰水浴中， 待体系冷却， 温 度低于4后， 加入少量戊二醛作为交联剂， 交联、 固化成球。 用丙酮与水 （体积比3:1） 的混 说 明 书 2/8 页 5 CN 106620884 A 5 合溶液洗涤23次， 滤去液体石蜡和水， 最后用纯丙酮洗涤， 抽滤， 自然。
23、凉干， 所得复合微球 表面光滑。 0017 （8） 取一定量冰醋酸， 用蒸馏水稀释到PH值4.7左右， 将明胶和透明质酸， 按重量比 8:2分别加入溶解， 均配制成5mg/mL的溶液。 将配制好的明胶溶液与透明质酸溶液均匀混 合。 0018 （9） 向步骤 （8） 中的混合溶液中加入一定量步骤 （7） 制得的Gel/HA微球得到复合体 系， 所加溶胶与微球的质量比为10:1。 将Gel/HA 溶胶与微球的复合体系置于连有真空装置 的烧瓶中， 然后将圆柱体状EMPLGA 多孔 “硬” 支架材料浸泡于复合体系中， 抽真空20 30min。 将复合支架取出放入冷冻干燥机中冷冻12h， 干燥48h。 。
24、取出后， 用碳化二亚胺 （EDC） 的乙醇溶液浸泡24h， 然后用乙醇溶液浸泡12h， 每4h 换一次水。 将浸泡好的复合支架材料 放入空气中干燥48h， 真空干燥， 得EMPLGA/Gel-HA水凝胶-微球仿生复合支架。 0019 步骤 （1） 中， 所述D,L-丙交酯、 乙交酯、 辛酸亚锡的重量比为： D,L-丙交酯70.0 80.0wt%、 乙交酯20.030.0wt%、 辛酸亚锡0.010.03wt%， 且辛酸亚锡经脱水处理。 0020 步骤 （1） 中， 所述三氯甲烷溶液 （1.05.0wt%） 的浓度直接与PLGA分子量大小有关， 分子量越大， 配制的三氯甲烷溶液浓度应越小。 00。
25、21 步骤 （2） 中， 所述马来酸酐的量为D,L-丙交酯、 乙交酯单体总量的510 wt%， 过氧 化苯甲酰的加入量为马来酸酐重量的15 wt%。 所述的减压环境为压力低于0.09MPa。 0022 步骤 （5） 中， 所述乙二胺的加入量为MPLGA质量的20.030.0%。 0023 步骤 （6） EMPLGA与三氯甲烷的浓度为1.05.0wt%， 盐酸的浓度为5.0-10.0wt%， EMPLGA与Na2CO3的质量比为1:5。 0024 步骤 （7） 中， 明胶/透明质酸混合溶液的浓度为20.025.0wt%， span-80的浓度为 0.0160.020g/L， 搅拌速率200800。
26、r/min， 戊二醛的浓度为0.3mL/g。 0025 步骤 （9） 中真空度为0.070.09MPa， 碳化二亚胺的乙醇溶液浓度为0.1wt%。 0026 本发明成功设计出了兼具类天然组织环境与良好机械强度的由高分子量EMPLGA 和明胶/透明质酸水凝胶-微球构成的可降解仿生复合支架材料， 为该仿生复合支架的制备 方法提供了详细的说明。 0027 本发明所得到的EMPLGA/水凝胶-微球仿生复合支架具有以下优点： （1） 采用直接熔融共聚制备的PLGA分子量可达1.02.0 105Da， 共价引入马来酸酐 和乙二胺， 获得了含马来酸酐和胺基活性基团的高分子量EMPLGA， 拓展其降解性能的调。
27、控 范围， 同时能有效缓解材料在降解过程中酸性物质积累。 0028 （2） 设计出了兼具类天然组织环境与良好机械强度的仿生复合支架， EMPLGA “硬” 支架能提供足够高的机械强度、 可控的降解速率和良好的形状保持能力。 水凝胶 “软” 支架 能为软骨细胞提供一个类天然组织的生长环境， 明胶/透明质酸微球能复合生物活性因子， 可望实现其分步可控释放， 进一步赋予该复合仿生支架更为优越的生物学性能。 具体实施方式 0029 下面通过具体实施例来对本发明作进一步详细的描述， 所述的原料份数除特别说 明外， 均为重量份数。 0030 实施例1： 说 明 书 3/8 页 6 CN 106620884。
28、 A 6 将78.0g干燥后的D,L-丙交酯、 22.0g乙交酯加入干燥处理后的安瓿瓶中， 再加入 0.015g经脱水处理的辛酸亚锡(Sn(Oct)2)； 真空干燥12 h后， 在4.0Pa的条件下用酒精喷灯 封管。 将封管后的安瓿瓶放入恒温箱中， 在140温度下反应24 h， 敲碎安瓿瓶， 取出得粗产 物PLGA。 所得产品Mw=1.76105Da， Mw/Mn=1.21。 0031 将粗产物溶于三氯甲烷中， 配制成2.0wt%溶液， 滴入3倍体积的乙醇中沉析3次， 真 空干燥。 将纯化后的PLGA与6.0g马来酸酐、 0.20g过氧化二苯甲酰混合， 置于三颈烧瓶中， 在 压强为0.084M。
29、Pa、 100的条件下反应24h得MPLGA粗聚物。 将接枝后的粗聚物置于Soxhelt 抽提器内， 以三氯甲烷为溶剂抽提8 h， 将抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中， 配制 成2.0wt%溶液， 滴入3倍体积的乙醇中沉析3次， 然后将提纯物真空干燥至恒重， 得到淡黄色 纯接枝共聚物MPLGA。 所得产品Mw=1.71105Da， Mw/Mn=1.24， 接枝率为1.11%。 0032 将10.0g MPLGA溶于20mL三氯甲烷中配制20.0wt% MPLGA的三氯甲烷溶液， 等体积 的乙二胺和三氯甲烷混合配制38.0wt%乙二胺的三氯甲烷溶液。 将MPLGA的三氯甲烷加入装 有搅拌器和。
30、温度计的三口烧瓶中， 在搅拌的条件下滴加2mL乙二胺的三氯甲烷溶液， 冰浴控 制体系温度低于10。 滴加完毕， 保温5min后， 再将温度升至室温反应60 min。 将产物滴入 过量的乙醇溶液中沉淀析出， 用去离子水洗涤呈中性， 产物40真空干燥至恒重， 得到黄色 的EMPLGA固体。 0033 称取2.0gEMPLGA溶入25mL三氯甲烷中， 充分溶解后将10.0g粒径为300450 m的 Na2CO3粒子加入聚合物溶液中并搅拌均匀， 室温下挥发出大量溶剂后， 将混合物加入到钢制 模具中， 压制成型。 室温下干燥6小时后将样品在5.0wt%溶液中浸泡3小时， 洗涤后再用蒸馏 水浸泡12小时，。
31、 每4小时换一次水， 得到的多孔支架在空气中干燥24小时， 真空干燥48小时。 0034 取15.8g明胶和0.83g透明质酸， 配制成20.0%的明胶/透明质酸混合溶液； 向250mL 圆底烧瓶中加入50mL液体石蜡， 水浴加热至60后， 再加入0.8g浓度为0.012g/L的span- 80， 以200r/min机械搅拌30min， 形成稳定的乳液后， 加入10mL明胶/透明质酸混合溶液， 乳 化10min， 待乳化完全后迅速冷却至4以下， 再加入200 L的戊二醛交联固化2小时。 0035 取10mL冰醋酸， 用蒸馏水稀释到PH值4.7左右， 得到醋酸溶液。 将8.0g明胶和2.0g 透。
32、明质酸， 分别加入溶解， 均配制成5mg/mL的溶液。 将配制好的明胶溶液与透明质酸溶液均 匀混合。 0036 向40mL明胶/透明质酸混合溶胶中加入20.0mgGel/HA微球。 将Gel/HA 溶胶与微球 的复合体系置于连有真空装置的烧瓶中， 然后将圆柱体EMPLGA 多孔 “硬” 支架材料浸泡于 复合体系中， 在0.082MPa的条件下抽真空2030min。 将复合支架取出放入冷冻干燥机中冷 冻12h， 干燥48h。 取出后， 用0.1%的碳化二亚胺的乙醇溶液浸泡24h， 然后用乙醇溶液浸泡 12h， 每4h 换一次水。 将浸泡好的复合支架材料放入空气中干燥48h， 真空干燥。 0037。
33、 实施例2： 将76.0g干燥后的D,L-丙交酯、 24.0g乙交酯加入干燥处理后的安瓿瓶中， 再加入 0.022g经脱水处理的辛酸亚锡(Sn(Oct)2)； 真空干燥12 h后， 在5.0Pa的条件下用酒精喷灯 封管。 将封管后的安瓿瓶放入恒温箱中， 在120温度下反应36 h， 敲碎安瓿瓶， 取出得粗产 物PLGA。 所得产品Mw=1.45105Da， Mw/Mn=1.31。 0038 将粗产物溶于三氯甲烷中， 配制成3.0wt%溶液， 滴入4倍体积的乙醇中沉析4次， 真 空干燥。 将纯化后的PLGA与6.5g马来酸酐、 0.25g过氧化二苯甲酰混合， 置于三颈烧瓶中， 在 说 明 书 4。
34、/8 页 7 CN 106620884 A 7 压强为0.065MPa、 100的条件下反应24h得MPLGA粗聚物。 将接枝后的粗聚物置于Soxhelt 抽提器内， 以三氯甲烷为溶剂抽提8 h， 将抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中， 配制 成3.0wt%溶液， 滴入4倍体积的乙醇中沉析4次， 然后将提纯物真空干燥至恒重， 得到淡黄色 纯接枝共聚物MPLGA。 所得产品Mw=1.39105Da， Mw/Mn=1.35， 接枝率为0.98%。 0039 将10g MPLGA溶于20mL三氯甲烷中配制25.0wt% MPLGA的三氯甲烷溶液， 等体积的 乙二胺和三氯甲烷混合配制38.0wt%乙。
35、二胺的三氯甲烷溶液。 将MPLGA的三氯甲烷加入装有 搅拌器和温度计的三口烧瓶中， 在搅拌的条件下滴加2mL乙二胺的三氯甲烷溶液， 冰浴控制 体系温度低于10。 滴加完毕， 保温5min后， 再将温度升至室温反应60 min。 将产物滴入过 量的乙醇溶液中沉淀析出， 用去离子水洗涤呈中性， 产物40真空干燥至恒重， 得到黄色的 EMPLGA固体。 0040 称取3.0gEMPLGA溶入37.5mL三氯甲烷中， 充分溶解后将15.0g粒径为300450 m的 Na2CO3粒子加入聚合物溶液中并搅拌均匀， 室温下挥发出大量溶剂后， 将混合物加入到钢制 模具中， 压制成型。 室温下干燥6小时后将样品。
36、在7.5wt%溶液中浸泡3小时， 洗涤后再用蒸馏 水浸泡12小时， 每4小时换一次水， 得到的多孔支架在空气中干燥24小时， 真空干燥48小时。 0041 取15.8g明胶和0.83g透明质酸， 配制成22.5%的明胶/透明质酸混合溶液； 向250mL 圆底烧瓶中加入50mL液体石蜡， 水浴加热至60后， 再加入0.8g浓度为0.016g/L的span- 80， 以300r/min机械搅拌30min， 形成稳定的乳液后， 加入10mL明胶/透明质酸混合溶液， 乳 化10min， 待乳化完全后迅速冷却至4以下， 再加入200 L的戊二醛交联固化2小时。 0042 取10mL冰醋酸， 用蒸馏水稀释。
37、到PH值4.7左右， 得到醋酸溶液。 将7.0g明胶和1.75g 透明质酸， 分别加入溶解， 均配制成5mg/mL的溶液。 将配制好的明胶溶液与透明质酸溶液均 匀混合。 0043 向50mL明胶/透明质酸混合溶胶中加入25.0mgGel/HA微球。 将Gel/HA 溶胶与微球 的复合体系置于连有真空装置的烧瓶中， 然后将圆柱体EMPLGA 多孔 “硬” 支架材料浸泡于 复合体系中， 在0.085MPa的条件下抽真空2030min。 将复合支架取出放入冷冻干燥机中冷 冻12h， 干燥48h。 取出后， 用0.1%的碳化二亚胺的乙醇溶液浸泡24h， 然后用乙醇溶液浸泡 12h， 每4h 换一次水。。
38、 将浸泡好的复合支架材料放入空气中干燥48h， 真空干燥。 0044 实施例3： 将73.0g干燥后的D,L-丙交酯、 27.0g乙交酯加入干燥处理后的安瓿瓶中， 再加入 0.025g经脱水处理的辛酸亚锡(Sn(Oct)2)； 真空干燥12 h后， 在6.0Pa的条件下用酒精喷灯 封管。 将封管后的安瓿瓶放入恒温箱中， 在130温度下反应36 h， 敲碎安瓿瓶， 取出得粗产 物PLGA。 所得产品Mw=1.85105Da， Mw/Mn=1.23。 0045 将粗产物溶于三氯甲烷中， 配制成4.0wt%溶液， 滴入5倍体积的乙醇中沉析5次， 真 空干燥。 将纯化后的PLGA与6.8g马来酸酐、 。
39、0.18g过氧化二苯甲酰混合， 置于三颈烧瓶中， 在 压强为0.076MPa、 100的条件下反应24h得MPLGA粗聚物。 将接枝后的粗聚物置于Soxhelt 抽提器内， 以三氯甲烷为溶剂抽提8 h， 将抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中， 配制 成4.0wt%溶液， 滴入5倍体积的乙醇中沉析5次， 然后将提纯物真空干燥至恒重， 得到淡黄色 纯接枝共聚物MPLGA。 所得产品Mw=1.80105Da， Mw/Mn=1.27， 接枝率为0.89%。 0046 将10.0g MPLGA溶于20mL三氯甲烷中配制30.0wt% MPLGA的三氯甲烷溶液， 等体积 的乙二胺和三氯甲烷混合配制38w。
40、t%乙二胺的三氯甲烷溶液。 将MPLGA的三氯甲烷加入装有 说 明 书 5/8 页 8 CN 106620884 A 8 搅拌器和温度计的三口烧瓶中， 在搅拌的条件下滴加2mL乙二胺的三氯甲烷溶液， 冰浴控制 体系温度低于10。 滴加完毕， 保温5min后， 再将温度升至室温反应60 min。 将产物滴入过 量的乙醇溶液中沉淀析出， 用去离子水洗涤呈中性， 产物40真空干燥至恒重， 得到黄色的 EMPLGA固体。 0047 称取2.5gEMPLGA溶入31mL三氯甲烷中， 充分溶解后将12.5g粒径为300450 m的 Na2CO3粒子加入聚合物溶液中并搅拌均匀， 室温下挥发出大量溶剂后， 将。
41、混合物加入到钢制 模具中， 压制成型。 室温下干燥6小时后将样品在6.0wt%溶液中浸泡3小时， 洗涤后再用蒸馏 水浸泡12小时， 每4小时换一次水， 得到的多孔支架在空气中干燥24小时， 真空干燥48小时。 0048 取15.8g明胶和0.83g透明质酸， 配制成25.0%的明胶/透明质酸混合溶液； 向250mL 圆底烧瓶中加入50mL液体石蜡， 水浴加热至60后， 再加入0.8g的浓度为0.02g/L的span- 80， 以400r/min机械搅拌30min， 形成稳定的乳液后， 加入10mL明胶/透明质酸混合溶液， 乳 化10min， 待乳化完全后迅速冷却至4以下， 再加入200 L的戊。
42、二醛交联固化2小时成球。 0049 取10mL冰醋酸， 用蒸馏水稀释到PH值4.7左右， 得到醋酸溶液。 将6.0g明胶和1.5g 透明质酸， 分别加入溶解， 均配制成5mg/mL的溶液。 将配制好的明胶溶液与透明质酸溶液均 匀混合。 0050 向45mL明胶/透明质酸混合溶胶中加入22.5mgGel/HA微球。 将Gel/HA 溶胶与微球 的复合体系置于连有真空装置的烧瓶中， 然后将圆柱体EMPLGA 多孔 “硬” 支架材料浸泡于 复合体系中， 在0.078MPa的条件下抽真空2030min。 将复合支架取出放入冷冻干燥机中冷 冻12h， 干燥48h。 取出后， 用0.1%的碳化二亚胺的乙醇。
43、溶液浸泡24h， 然后用乙醇溶液浸泡 12h， 每4h 换一次水。 将浸泡好的复合支架材料放入空气中干燥48h， 真空干燥。 0051 实施例4： 将75.0g干燥后的D,L-丙交酯、 25.0g乙交酯加入干燥处理后的安瓿瓶中， 再加入 0.026g经脱水处理的辛酸亚锡(Sn(Oct)2)； 真空干燥12 h后， 在7.0Pa的条件下用酒精喷灯 封管。 将封管后的安瓿瓶放入恒温箱中， 在150温度下反应36 h， 敲碎安瓿瓶， 取出得粗产 物PLGA。 所得产品Mw=1.54105Da， Mw/Mn=1.35。 0052 将粗产物溶于三氯甲烷中， 配制成5.0wt%溶液， 滴入3倍体积的乙醇中。
44、沉析3次， 真 空干燥。 将纯化后的PLGA与7.0g马来酸酐、 0.15g过氧化二苯甲酰混合， 置于三颈烧瓶中， 在 压强为0.086MPa、 100的条件下反应24h得MPLGA粗聚物。 将接枝后的粗聚物置于Soxhelt 抽提器内， 以三氯甲烷为溶剂抽提8 h， 将抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中， 配制 成5.0wt%溶液， 滴入3倍体积的乙醇中沉析3次， 然后将提纯物真空干燥至恒重， 得到淡黄色 纯接枝共聚物MPLGA。 所得产品Mw=1.48105Da， Mw/Mn=1.38， 接枝率为1.05%。 0053 将10.0g MPLGA溶于20mL三氯甲烷中配制22.5wt% M。
45、PLGA的三氯甲烷溶液， 等体积 的乙二胺和三氯甲烷混合配制38.0wt%乙二胺的三氯甲烷溶液。 将MPLGA的三氯甲烷加入装 有搅拌器和温度计的三口烧瓶中， 在搅拌的条件下滴加2mL乙二胺的三氯甲烷溶液， 冰浴控 制体系温度低于10。 滴加完毕， 保温5min后， 再将温度升至室温反应60 min。 将产物滴入 过量的乙醇溶液中沉淀析出， 用去离子水洗涤呈中性， 产物40真空干燥至恒重， 得到黄色 的EMPLGA固体。 0054 称取3.0gEMPLGA溶入37.5mL三氯甲烷中， 充分溶解后将15.0g粒径为300450 m的 Na2CO3粒子加入聚合物溶液中并搅拌均匀， 室温下挥发出大量。
46、溶剂后， 将混合物加入到钢制 说 明 书 6/8 页 9 CN 106620884 A 9 模具中， 压制成型。 室温下干燥6小时后将样品在8.0wt%溶液中浸泡3小时， 洗涤后再用蒸馏 水浸泡12小时， 每4小时换一次水， 得到的多孔支架在空气中干燥24小时， 真空干燥48小时。 0055 取15.8g明胶和0.83g透明质酸， 配制成21.0%的明胶/透明质酸混合溶液； 向250mL 圆底烧瓶中加入50mL液体石蜡， 水浴加热至60后， 再加入0.8g的浓度为0.012g/L的span- 80， 以500r/min机械搅拌30min， 形成稳定的乳液后， 加入10mL明胶/透明质酸混合溶液。
47、， 乳 化10min， 待乳化完全后迅速冷却至4以下， 再加入200 L的戊二醛交联固化2小时成球。 0056 取10mL冰醋酸， 用蒸馏水稀释到PH值4.7左右， 得到醋酸溶液。 将5.0g明胶和1.25g 透明质酸， 分别加入溶解， 均配制成5mg/mL的溶液。 将配制好的明胶溶液与透明质酸溶液均 匀混合。 0057 向35mL明胶/透明质酸混合溶胶中加入17.5mgGel/HA微球。 将Gel/HA 溶胶与微球 的复合体系置于连有真空装置的烧瓶中， 然后将圆柱体EMPLGA 多孔 “硬” 支架材料浸泡于 复合体系中， 在0.086MPa的条件下抽真空2030min。 将复合支架取出放入冷。
48、冻干燥机中冷 冻12h， 干燥48h。 取出后， 用0.1%的碳化二亚胺的乙醇溶液浸泡24h， 然后用乙醇溶液浸泡 12h， 每4h 换一次水。 将浸泡好的复合支架材料放入空气中干燥48h， 真空干燥。 0058 实施例5： 将80.0g干燥后的D,L-丙交酯、 20.0g乙交酯加入干燥处理后的安瓿瓶中， 再加入 0.030g经脱水处理的辛酸亚锡(Sn(Oct)2)； 真空干燥12 h后， 在8.0Pa的条件下用酒精喷灯 封管。 将封管后的安瓿瓶放入恒温箱中， 在160温度下反应36 h， 敲碎安瓿瓶， 取出得粗产 物PLGA。 所得产品Mw=1.32105Da， Mw/Mn=1.38。 0059 将粗产物溶于三氯甲烷中， 配制成4.0wt%溶液， 滴入3倍体积的乙醇中沉析3次， 真 空干燥。 将纯化后的PLGA与6.2g马来酸酐、 0.18g过氧化二苯甲酰混合， 置于三颈烧瓶中， 在 压强为0.068MPa、 100的条件下反应24h得MPLGA粗聚物。 将接枝后的粗聚物置于Soxhelt 抽提器内， 以三氯甲烷为溶剂抽提8 h， 将抽提的剩余物真空干燥后溶于三氯甲烷中， 配制 成15wt%溶液， 滴入3倍体积的乙醇中沉析3次， 然后将提纯物真空干燥至恒重， 得到淡黄色 纯接枝共聚物MPLGA。 所得产品Mw=1.27105D。