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1、(10)申请公布号 CN 103103137 A(43)申请公布日 2013.05.15CN103103137A*CN103103137A*(21)申请号 201210154183.3(22)申请日 2012.05.17CCTCC NO：M 2011495 2011.12.31C12N 1/16(2006.01)C12P 7/56(2006.01)C05F 11/08(2006.01)C12R 1/74(2006.01)(71)申请人西安交通大学地址 710049 陕西省西安市咸宁西路28号(72)发明人杨水云 王玲 吴耀彬 林杰黄敬亮 龙建纲 刘健康(74)专利代理机构西安通大专利代理有限责。
2、任公司 61200代理人陆万寿(54) 发明名称一种解淀粉产乳酸固氮的酵母菌及其应用(57) 摘要本发明公开了一种解淀粉产乳酸固氮的酵母菌及其应用，该酵母菌属于热带假丝酵母（Candida tropicalis），保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC M 2011495。该酵母菌不仅可水解淀粉，还可分泌乳酸、自生固氮，成为目前报道的首例多功能型新型酵母菌株；可以应用于乳酸发酵、单细胞蛋白生产，或作为微生物氮肥中的活性菌源；在食品工业、农业、制药等方面，具有极为广泛的应用前景。(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图3页(19。
3、)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图3页(10)申请公布号 CN 103103137 ACN 103103137 A1/1页21.一种产乳酸解淀粉固氮的酵母菌，其特征在于，该酵母菌属于热带假丝酵母（Candida tropicalis)，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC M 2011495。2.如权利要求1所述的酵母菌，其特征在于，该酵母可以发酵糖类分泌胞外乳酸。3.如权利要求1或2所述的酵母菌，其特征在于，该酵母可以可溶性淀粉作为唯一的碳源和能源生长。4.如权利要求1或2所述的酵母菌，其特征在于，该酵母可自。
4、生固氮。5.如权利要求14任何一项所述的酵母菌作为发酵生产乳酸的菌株的应用。6.如权利要求14任何一项所述的酵母菌作为固氮菌肥中的微生物活体种源的应用。7.如权利要求14任何一项所述的酵母菌作为单细胞蛋白生产菌株的应用。权 利 要 求 书CN 103103137 A1/6页3一种解淀粉产乳酸固氮的酵母菌及其应用 技术领域0001 本发明属于微生物技术领域，涉及一种新的酵母菌，特别涉及一种产乳酸解淀粉固氮酵母菌及其应用。 背景技术0002 酵母菌是一群单细胞真核微生物，以其可以在富糖环境生长、兼性好氧、在缺氧环境中可产生酒精和二氧化碳而著称。常见用于酒类发酵和面包、馒头制作。本发明酵母可在厌氧条。
5、件下以淀粉为碳源分泌乳酸、可以在好氧条件下自生固氮，具有广泛的应用价值。 0003 乳酸是一种无毒无污染的天然化合物，用途十分广泛。目前用于乳酸发酵的生产菌种主要是乳酸细菌和米根霉。在乳酸发酵过程中，pH值会随着乳酸的生成而逐渐降低，而低pH值会抑制细菌和根霉菌的生长和发酵能力（张勤等,代谢工程改造野生耐酸酵母生产L-乳酸.生物工程学报,2011.27(7):1024-1031）。酵母菌具备更好的耐酸特性，可在强度更高的酸性条件下生存和生长，因此近些年来，科学家开始了用基因工程方法构建乳酸产生酵母菌的研究（崔黎等,乳酸酵母菌的研究现状及其在饲料添加剂中的功能.食品与发酵工业,2009(5):1。
6、18-121），但还处于实验研究阶段，尚未见有酵母用于乳酸生产的报道。已发现个别酵母菌可以水解利用淀粉（Chi,Z.,et al.,Saccharomycopsis fibuligera and its applications in biotechnology.Biotechnology Advances,2009.27(4):423-431），但却未见既解淀粉又产乳酸酵母菌的报道。 0004 有研究称解淀粉乳酸细菌可降低乳酸生产成本（赵国振等,解淀粉乳酸细菌在-乳酸发酵生产中的应用.中国生物工程杂志,2009.29(7):134-139.），类似地，解淀粉产乳酸酵母的应用，也将大大降低乳酸。
7、发酵中因淀粉预糖化工序所带来的高成本。 0005 单细胞蛋白，亦称微生物蛋白或菌体蛋白，是指通过人为方式选择性培 养适宜种类的微生物而获得的微生物来源的蛋白质。由于单细胞蛋白的蛋白质含量高、且含有人或动物的多种限制性或必需氨基酸，因此具有比一般粮食更高的生物学效价（齐银霞等,利用废弃资源发酵生产单细胞蛋白的研究进展.食品工业科技,2009(5):366-369），是目前公认的最具前景的蛋白质新资源，对解决世界蛋白质资源不足问题有重要的补充作用（董婷婷等,可食性单细胞蛋白的研究进展.食品工业科技,2012.33(3):417-421）。酵母菌由于其高度安全的可食性、细胞体积大易于分离等优势，因而。
8、成为细胞蛋白生产的最主要的菌种（刘宁等,单细胞蛋白概况及其应用的探讨.农业科技与装备,2007(6):50-52）。但却未见有固氮酵母用于单细胞蛋白生产的任何报道。本发明酵母来源于果蔬发酵，是天然可食酵母。已发现其可以固氮，无需添加有机氮或无机氮就可良好生长，因此比起普通酵母菌将会因培养成本降低而在单细胞蛋白生产中具有更强的竞争优势。 0006 微生物肥料是指含有活体微生物的制品，应用于农业生产中，能够获得特定的肥料效应，其中活体微生物起关键作用。目前应用于微生物肥料的活体微生物均为原核生物，如根瘤菌、固氮菌、固氮蓝藻等（吴建峰，林先贵,我国微生物肥料研究现状及发展趋势.土壤,2002.34(。
9、2):68-73.），尚未见真核生物如酵母菌固氮的报道，本发明提供的酵母菌填补说 明 书CN 103103137 A2/6页4了这个空白。原核固氮微生物不能耐高温和干燥处理，在存储和运输上十分不便；而酵母菌可以形成子囊孢子抗热抗干燥，可以制成粉剂而方便储运，因此在生产中具有更大优势。 发明内容0007 本发明解决的问题在于一种新的产乳酸解淀粉固氮酵母菌及其应用，该酵母不仅产乳酸，且可解淀粉作为碳源和能源，同时可以固定大气氮；可应用于乳酸发酵而降低乳酸发酵成本，或者可以作为单细胞蛋白的生产菌种，或者可以作为微生物氮肥的活体微生物种源，具有广泛的应用价值。 0008 本发明是采用以下技术方案来实现。
10、： 0009 一种产乳酸解淀粉固氮的酵母菌，该酵母菌属于热带假丝酵母（Candida tropicalis)，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC M2011495。 0010 所述的酵母菌可以发酵糖类分泌胞外乳酸。 0011 所述的酵母菌可以可溶性淀粉作为唯一的碳源和能源生长。 0012 所述的酵母菌可自生固氮。 0013 所述的酵母菌作为发酵生产乳酸的菌株的应用。 0014 所述的酵母菌作为固氮菌肥中的微生物活体种源的应用。 0015 所述的酵母菌作为单细胞蛋白生产菌株的应用。 0016 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果： 0017 本发明提供的产乳酸。
11、解淀粉固氮酵母菌，是一株具有特殊能力的新型酵母，其菌落颜色乳白色，具有肥厚湿润粘稠不透明等酵母菌特有的菌落特点；细胞个体椭圆到球形可以出芽繁殖，具有酵母菌特有的形态。序列比对分析发现该新型菌株与已知的热带假丝酵母的相应序列的相似性为99.0%，初步认定其属于热带假丝酵母（Candida tropicalis）。 0018 本发明提供的产乳酸解淀粉固氮酵母菌，在玉米粉琼脂培养基上可以形成假菌丝，是假丝酵母的特征之一；在该培养基上还可以形成子囊孢子，说明该菌株具有有性生殖能力，是子囊菌的特点之一。 0019 本发明提供的产乳酸解淀粉固氮酵母菌，能以淀粉作为唯一的碳源和能源生长且在无氧条件下分泌乳酸。
12、。这一特点若用于乳酸发酵，较之于只能发酵低分子糖的乳酸细菌，可以降低花在淀粉糖化工序上所产生的成本。 0020 本发明提供的产乳酸解淀粉固氮酵母菌，具有自生固氮能力，这一特点若用于单细胞蛋白生产，较之于普通酵母菌，无需添加氮源从而降低生产成本；同时该特点也可用于微生物氮肥的生产。 0021 本发明提供的产乳酸解淀粉固氮酵母菌，在厌氧条件下可以向细胞外分泌酸性物质，使含有溴甲酚紫pH指示剂的培养基变黄。收集其分泌的胞外酸，采用特异性的乳酸脱氢酶法和对羟基联苯法进行鉴定，表明胞外酸中含有乳酸。这表明该酵母菌可应用于乳酸发酵的生产。 0022 保藏说明 0023 本发明所述的解淀粉产乳酸热带假丝酵母。
13、菌进行了下述保藏： 0024 保藏时间：2011年12月31日，保藏地点：中国.武汉.武汉大学，中国典型培养物保藏中心，CCTCC；保藏号为CCTCC NO：M2011495。保藏的培养物名称：热带假丝酵母解淀说 明 书CN 103103137 A3/6页5粉产乳酸新变种ALAY-1； Candida tropicalis var.Amlolytic Acidum Lacteolus ALAY-1。 附图说明0025 图1为CCTCC M 2011495在蔗糖酵母膏培养基上的菌落形态图； 0026 图2为CCTCC M 2011495在淀粉培养基上的细胞和芽殖子在显微镜下的照片； 0027 图。
14、3为CCTCC M 2011495玉米淀粉培养基上形成的假菌丝在显微镜下的照片； 0028 图4为CCTCC M 2011495玉米淀粉培养基上形成的子囊孢子在显微镜下的照片； 0029 图5为基于ITS-5.8S rDNA序列的系统进化树； 0030 图6为CCTCC M 2011495以淀粉为唯一碳源和能源的菌苔生长测试结果； 0031 图7为CCTCC M 2011495固氮能力的单菌落生长测试结果； 0032 图8为CCTCC M 2011495厌氧发酵液的乳酸脱氢酶检测结果； 0033 图9为CCTCC M 2011495厌氧发酵液的对羟基联苯法显色结果； 0034 图10为CCTC。
15、C M 2011495厌氧发酵液的对羟基联苯法显色溶液的波长扫描曲线。 具体实施方式0035 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。 0036 以下对本发明的CCTCC M 2011495菌株的筛选和鉴定过程作进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。 0037 1.所用培养基特征、用途和配方 0038 基本无机盐：作为下述相关合成培养基的共同组分，其组成为（质量比）：K2HPO40.2%；CaCl20.02%；MgSO4.7H2O 0.02%；NaCl 0.005%，自来水配制。 0039 1)菌源富集培养基：天然培养基，模仿我国传统浆水发酵模。
16、式设计培养基，用于自然界解淀粉酵母的富集；其组成为（质量比）：普通小麦面粉2%，食盐1%，自来水配制，自然pH。 0040 2)淀粉合成培养基：以可溶性淀粉为唯一碳源和能源，以溴甲酚紫作pH指示剂，微生物一旦发酵产酸，其菌落周围的培养基颜色则变黄；用于解淀粉产酸酵母菌的筛选，即解淀粉乳酸菌的初筛。其组成为（质量比）：基础无机盐；可溶性淀粉2%；NH4Cl 0.3%；琼脂2%；自来水配制;自然pH；添加0.1%溴甲酚紫溶液200ul。 0041 3)加富培养基：含有最适碳源和铵盐并添加酵母膏，用于菌株一般形态观察和厌氧产酸验证。其组成为（质量比）：基础无机盐；蔗糖2%；酵母膏0.2%；NH4Cl。
17、 0.3%，琼脂2%；自来水配制；pH 6。 0042 4)无氮合成培养基 本培养基为不含任何含氮化合物的合成培养基，目的在于检验新型酵母菌是否具有固定大气氮的能力。其组成为，基础无机盐；蔗糖2%，琼脂2%；自来水配制；pH 6。 0043 5)玉米淀粉培养基：按照常规方法，用此培养基诱导假丝和子囊孢子的形成。其组成为（质量比）：玉米粉6%，琼脂2%，自来水配制，自然pH。 0044 2.菌源采集和富集培养： 0045 取市售葡萄用自来水清洗后晾干水分，剥取10-20颗葡萄皮置于无菌广口瓶内；说 明 书CN 103103137 A4/6页6采取新鲜的胡萝卜叶子250g左右，自来水清洗、晾干后置。
18、于同一广口瓶内作为解淀粉产乳酸菌的混合菌源。 0046 配制菌源富集培养基，充分混匀后煮沸糊化，自然冷却至80左右，注入含有菌原的广口瓶，淹没广口瓶中的混合菌源，加盖并密封，于2528室温下自然发酵，直至蔬菜叶变为黄棕色，面粉浆水变清亮。历时约3周，得到富集的培养物。 0047 所得到的富集的培养物中包含了富集得到的乳酸菌源、酵母菌源，在此期间，不排除乳酸菌和酵母菌之间可能会发生基因重组。 0048 3.解淀粉酵母菌的初筛 0049 将富集培养物稀释涂布在淀粉合成培养基的平板上，用石蜡膜密封培养皿四周，28培养，不定时观察培养基颜色变化。 0050 挑取使培养基变黄的菌落进行显微镜检查，从中检。
19、出了一株具有芽殖子的菌株，确定为酵母菌。并在蔗糖酵母膏加富培养基上对该酵母菌进行划线法分离，获得了该酵母菌的纯培养。该酵母菌即为CCTCC M 2011495。 0051 4.酵母菌CCTCC M 2011495的形态学鉴定 0052 为了对该菌进行分类，首先对分离的酵母菌进行了基本的形态学鉴定。具体方法和结果如下： 0053 4.1 菌落形态和细胞形态 0054 按照常规操作，稀释涂布法接种CCTCC M 2011495于加富培养基（培养基3）上，28培养3天后观察单菌落形态如图1所示，可见该菌菌落呈乳白色，直径35mm左右，菌落肥厚饱满，湿润不透明，符合酵母菌菌落特征。显微镜下观察培养物的。
20、形态，结果如图2所示。可见该菌株细胞呈球形至椭圆形，有芽殖子生成。可以进行单边和多边芽殖。 0055 4.2 子囊孢子和假菌丝的观察鉴定 0056 按照经典试验方法（李明霞,付秀辉，卢乡怀.现代酵母菌分类鉴定方法与新技术.微生物学通报，1992,19:56-57），在玉米粉琼脂培养基上采用盖玻片法培养该菌，显微镜下观察形态，结果如图3所示。可见该菌株产生了假菌丝，是假丝酵母的特征之一。同样地，发现该菌株在玉米粉琼脂培养基上也形成了子囊孢子，如图4所示，说明该菌株具有有性生殖能力，是子囊菌的特征之一。 0057 5.菌株的分子生物学分类鉴定：ITS-5.8S rDNA序列分析 0058 在编码r。
21、RNA的rDNA转录区中有3个区域，18S、5.8S和28S，依序串联在一起组成一个大的转录单元。每个区域之间由间隔序列（ITS）相连，连接18S-5.8S和5.8S-28S的ITS分别称为ITS1和ITS2。5.8S rDNA位于2个ITS之间。由于ITS区不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速率快，在绝大多数的真核生物中表现出极为广泛的序列多态性，因而广泛用于真核生物亲缘关系和系统发育关系的分析。 0059 将菌株CCTCC M 2011495送北京三博远志生物技术公司进行ITS-5.8SrDNA序列扩增和测序分析，获得序列如SEQ.ID.NO.1所示。该序列已提交至NCBI数据。
22、库，并获得GenBank序列号（accession number）为JQ951603。 0060 借用NCBI的BLAST分析工具，将JQ951603序列与GenBank数据库中的其他DNA序列进行序列比对分析，发现该序列与多株已知的热带假丝酵母对应序列覆盖率高达96%以上，且相似性高达99%。借用mega软件构建依赖于ITS-5.8S rDNA序列的系谱树状图，并计说 明 书CN 103103137 A5/6页7算菌株间的序列相似性，结果如图5所示。该结果表明，菌株CCTCC M 2011495，即图中命名为CCTCC M 2011495(JQ951603)的比对菌株，与已知的热带假丝酵母（。
23、Candida tropicalis voucher MCCC2E00325（EF196807）的ITS-5.8S rDNA序列相似性高达99.0%，没有大的差异。树状图中涉及的菌株，全部属于热带假丝酵母同一个种。由此推定菌株CCTCC M 2011495可能是 热带假丝酵母的一个新变种。 0061 6.对酵母菌CCTCC M 2011495的解淀粉能力的验证 0062 为了验证所获菌株的解淀粉能力，采用去掉溴甲酚紫的淀粉合成培养基（即不添加溴甲酚紫的培养基2），并分别采用碳源为，可溶性淀粉、蔗糖（作为阳性对照）和灭菌水（作为阴性对照），划线接种后在好氧条件下于28培养，对所获酵母菌进行淀粉利。
24、用能力的检测。 0063 检测结果如图6所示，可见在无碳阴性对照平板上没有生长迹象；在淀粉平板和蔗糖（阳性对照）平板上均有生长。说明所分离的酵母菌CCTCC M 2011495可以利用可溶性淀粉作为唯一碳源和能源良好生长。 0064 7.对酵母菌CCTCC M 2011495的固氮能力的验证 0065 为了验证所获菌株的自生固氮能力，以含有氯化铵的合成培养基（培养基4）做阳性对照，并去掉培养基4）当中的蔗糖作为无碳无氮培养基作为阴性对照，采用无氮合成培养基4），将酵母菌洗涤后稀释倾倒平板后在好氧条件下于28培养，对新型酵母菌进行固氮能力的测试。 0066 结果如图7所示，可见在阴性对照平板上因。
25、为无碳源而没有生长迹象；而在阳性对照（含铵盐、蔗糖）和无氮培养基（含蔗糖无氮）上均有生长，说明酵母菌CCTCC M 2011495的确可以自生固氮，即可固定大气氮作为其氮源进行生长繁殖。 0067 8.对酵母菌CCTCC M 2011495的产乳酸的鉴定 0068 依据乳酸脱氢酶和对羟基联苯显色两种乳酸特异的定性反应，对初筛所得解淀粉产酸酵母菌的产酸种类进行鉴定。 0069 8.1 乳酸脱氢酶法鉴定胞外酸 0070 借用乳酸脱氢酶（LDH）催化乳酸和氧化型辅酶I（NAD+）生成的还原型辅酶I（NADH）在340nm处有特异吸收峰的特点，测定NADH的OD340随时间的量变曲线，进而判断体系中是。
26、否有乳酸存在。 0071 配制加富培养基3），置于抽滤瓶中连接真空泵，摇晃脱气除氧后分装于三角瓶。接种CCTCC M 2011495，覆盖一层灭菌液体石蜡达到厌氧状态，28静置发酵。以啤酒酵母作为体系阴性对照。 0072 发酵5-7天后，离心弃菌体，取上清液调节pH至猪心源L-乳酸脱氢酶（LDH）的最适pH8.8左右；再次离心弃沉淀，取上清液加入NAD+和少量LDH混匀，立即检测并绘制“OD340-时间”关系曲线。 0073 CCTCC M 2011495厌氧发酵液的乳酸脱氢酶紫外检测结果如图8所示，从“OD340-时间”关系曲线可见，NADH的生成曲线表现为典型的酶促曲线，说明菌株的胞外发酵。
27、液在乳酸脱氢酶作用下产生了还原型NADH；而对照菌株啤酒酵母则没有NADH的生成。这表明啤酒酵母不产乳酸而CCTCC M2011495所产酸中含有乳酸。 0074 8.2 对羟基联苯法鉴定胞外乳酸 说 明 书CN 103103137 A6/6页80075 对羟基联苯法对乳酸具有良好的反应显色特异性。在去除蛋白质和糖类的溶液中，乳酸与浓硫酸共热脱水变成乙醛，在铜离子的存在下乙醛与对羟基联苯反应生成紫红色化合物。 0076 取CCTCC M 2011495的厌氧发酵液并离心弃去酵母细胞沉淀，取发酵上清液于洁净干燥试管中，按照梁琼等报道的方法（梁琼等，对羟基联苯法定量测定发酵液中的乳酸，食品科学，2。
28、008（6）：357-360）进行乳酸测定。自来水替换发酵液上清和指示剂做体系阴性对照，用啤酒酵母发酵液作为代谢物对照，以稀乳酸作为阳性对照。 0077 各反应试管颜色变化如图9所示，其中1为纯水替代发酵液上清，2为纯水替代对羟基联苯试剂，3为啤酒酵母发酵液，4为CCTCC M 2011495发酵液上清，5为乳酸水溶液替代发酵液。与阴性对照1、2相比，啤酒酵母发酵液3无乳酸的产生所以未显示，而CCTCC M 2011495的发酵液上清4的颜色变为紫色，与乳酸水溶液5同样变色，说明发酵液上清中有乳酸存在。 此结论与乳酸脱氢酶法检测的结论一致。对羟基联苯与发酵液反应显色溶液的波长扫描曲线如图10所。
29、示，可见显色物在565nm附近具有最大吸收峰，这与对羟基联苯与乳酸反应产物的理论吸收峰特征一致，进一步支持上述结论。 0078 经过2种不同方法的乳酸检测，结果表明所分离的CCTCC M 2011495酵母菌在厌氧发酵条件下能够向胞外分泌乳酸。 0079 综上，通过菌落形态观察、细胞个体形态观察、假菌丝培养观察和ITS-5.8S rDNA序列比对分析，结果表明，该CCTCC M 2011495为热带假丝酵母的一个新变种。而且该酵母能够以淀粉为唯一碳源和能源培养，在厌氧条件下能够向细胞外分泌乳酸，在好氧条件下可以固氮生长。 0080 基于以上特点，该酵母能够应用于如下三个方面，且比现有菌株更具有。
30、显著的优势： 0081 首先，该菌株能利用可溶性淀粉作为唯一碳源和能源厌氧条件下发酵分泌乳酸，与现有的以低分子糖作为碳源的乳酸发酵菌株相比，可以省去发酵前对淀粉进行糖化的步骤，因此显著地降低发酵成本。 0082 此外，如前述由于酵母菌在食用上的安全性和菌体蛋白的高含量和高营养效价，酵母菌成为单细胞蛋白生产的最主要的微生物菌种。本发明酵母菌也可作为单细胞蛋白生产的菌株。既然该酵母不需要专门添加有机氮或无机氮就可以良好生长，因此比起其他单细胞蛋白用酵母菌，将会因培养成本降低而具有更强的竞争优势。 0083 第三，基于该酵母具有固氮能力，其可作为固氮菌肥料中的自生固氮活性微生物。鉴于该酵母可以形成子囊孢子，具有耐热耐干旱等抗逆境的能力，可以制成粉剂进行储运，解决了原核固氮微生物不能耐高温和干燥处理，在储运上造成不便的困难。因此在生产中比原核自生固氮菌更有优势。 0084 综上，本发明提供的产乳酸解淀粉固氮酵母菌，该酵母不仅产乳酸，而且可以分解淀粉作为碳源和能源，同时可以固定大气氮。可应用于乳酸发酵和单细胞蛋白的生产而降低成本，或者可以作为微生物固氮菌肥的活体种源。该酵母具有广阔的应用前景。 说 明 书CN 103103137 A1/1页90001 序 列 表CN 103103137 A1/3页10图1图2图3图4说 明 书 附 图CN 103103137 A10。