技术领域
本发明涉及组织粘合性止血产品，其包含多孔固体基质和含有亲电活化的聚噁唑啉(EL-POX)的涂料。这种新型的止血产品表现出优异的可生物降解性、粘合性以及止血性能。本发明涵盖的止血产品的实例包括止血网、止血泡沫和止血粉末。
还提供了制备组织粘合性止血产物的方法，其包括用亲电活化的聚噁唑啉(EL-POX)涂布多孔固体基质。
发明背景
伤口敷料形成了全球伤口护理市场的一个重要部分。这些产品广泛用于治疗诸如伤口、出血、受损组织和出血组织的伤病。理想的敷料应当在合理的成本以及对患者造成最小不便的情况下防止过度的出血并且促进快速治愈。
伤口敷料的止血性能由材料的质地和孔隙度决定。对于孔隙度，敷料的孔通常很小以至于它们在粗略观察时对于人眼是不可见的。然而，所述孔具有足够的尺寸，其不仅允许皮肤水分和伤口蒸汽充分散发，并且允许吸收血液，使得一旦血液凝固，所述敷料牢固地固定于组织。
伤口敷料应当能够维持伤口附近湿润的环境、有效的氧气循环以便帮助细胞和组织再生，并且有助于低的细菌负荷。在手术期间使用的伤口敷料以及留在体内的伤口敷料应当是可生物降解的和完全可吸收的。
常规的组织粘合性伤口敷料包括纤维蛋白密封剂、基于氰基丙烯酸酯的密封剂以及其他合成的密封剂和可聚合的单体。这些组织粘合剂由于具有许多缺点仅适于特定的应用，所述缺点包括释放有毒的降解产物，高成本，需要冷藏储存，固化慢，受限的机械强度和感染风险。因此，基于反应性的聚乙二醇(PEG)前体，研发了水凝胶组织粘合剂。然而，这些水凝胶组织粘合剂过快地溶胀或溶解，或者缺乏足够的凝聚力，由此降低了其作为手术粘合剂的效果。此外，这类基于PEG的材料的性能不容易控制。
止血粉末是广泛使用的止血产品的另一个实例。市售的止血粉末(也被称为止血剂(styptic)粉末)的实例包括可吸收的止血明胶粉末(粉末)和钙负载形式的沸石(也被称为)。这些止血粉末可以用于阻止严重的出血。
US 5,614,587描述了基于胶原的组合物，其用于连接组织，或将组织与合成的植入材料连接。所述组合物包含纤维状胶原、纤维分解剂和多官能团活化的合成的亲水聚合物，如聚乙二醇，其中所述胶原与合成聚合物共价键合以形成胶原-合成聚合物缀合物。
WO2004/028404描述了由合成胶原或合成明胶与亲电交联剂(以干燥状态提供)组成的组织密封剂。在该国际公开中，所述交联剂包含亲电活化的(EA)聚(乙二醇)(PEG)或EA PEG衍生物，例如PEG-琥珀酰亚胺酯，尤其是PEG-丙酸琥珀酰亚胺酯、PEG-丁酸琥珀酰亚胺酯或PEG-戊二酸琥珀酰亚胺酯。该组合物在适当pH下润湿时，则2个组分发生反应，并且形成具有密封性能的凝胶。
US 2011/0251574描述了止血的多孔复合海绵，其包含生物材料基质和含反应性基团的亲水性聚合物组分，其中所述聚合物组分涂布在所述生物材料基质(matrix)的表面上，或者用所述聚合物材料浸渍所述基质，或者两种情况均存在。在优选的实施方案中，所述聚合物是聚氧化烯聚合物，更特别地是多-亲电聚乙二醇(PEG)。所述基质材料可以选自胶原、明胶、纤维蛋白、多糖(例如壳聚糖)、合成的可生物降解的生物材料(例如聚乳酸或聚乙醇酸)，及其衍生物。
US 2010/069579描述了末端活化的聚噁唑啉(POZ)化合物，所述POZ化合物包含在其末端具有单一活性官能团的POZ聚合物，所述官能团能够与目标分子上的基团反应以产生目标分子-POZ缀合物，其中目标分子与POZ化合物之间的所有键是水解稳定的键。
WO2012/057628描述了由于存在能够与天然组织中存在的含亲核体的化学实体反应的亲电基团而具有组织粘合性能的交联聚噁唑啉聚合物。
本发明的目的是提供具有改善性能的组织粘合性止血产品。
发明概述
发明人发现可以通过以下方法来产生具有改善性能的组织粘合性止血产品，所述方法包括以下步骤：
·提供多孔固体基质；
·用包含亲电活化的聚噁唑啉(EL-POX)和溶剂的涂料液体来涂布所述基质，以产生经涂布的基质，所述EL-POX含有至少2个反应性亲电基团；
·从所述经涂布的基质去除溶剂。
发明人意外地发现可以通过本方法，在不对基质的多孔结构造成不利影响的情况下，将EL-POX涂覆(apply)于多孔固体基质上。本方法能够涂覆EL-POX涂料而保留基质的孔结构大部分完整，使得多孔基质吸收体液(例如血液)的能力基本上保持不受影响。通过本方法获得的经EL-POX涂布的止血产品，因为存在能够通过形成共价键与组织中天然存在的例如胺基团反应的亲电反应性基团，而具有优异的粘合性质。
本发明还提供选自经涂布的网、经涂布的泡沫和经涂布的粉末的组织粘合性止血产品，所述止血产品包含：
·多孔固体基质，其具有至少5vol.％的孔隙度并且包含含有亲核聚合物的外表面，所述亲核聚合物含有反应性的亲核基团；
·粘合涂料，其覆盖至少一部分固体基质，所述涂料包含亲电活化的聚噁唑啉(EL-POX)，所述EL-POX平均含有至少1个反应性亲电基团。
止血产品的涂料中含有的EL-POX聚合物提供了以下优点：所述聚合物可以携带大量的亲电反应性基团，因为实际上所述EL-POX聚合物可以含有大量的侧基，各个侧基可以携带一个或多个这类反应性基团。因此，通过选择具有最佳亲电基团密度的EL-POX，可以针对某一应用优化止血产品的粘合性能。通过改变侧基的浓度和/或性能，还可以适当地优化EL-POX的其他性质，例如亲水/疏水平衡以及更低的临界溶解温度。
发明详述
因此，本发明的一个方面涉及制备组织粘合性止血产品的方法，所述方法包括以下步骤：
·提供多孔固体基质；
·用包含亲电活化的聚噁唑啉(EL-POX)和溶剂的涂料液体涂布所述基质，以产生经涂布的基质，所述EL-POX含有至少2个反应性亲电基团；
·从所述经涂布的基质去除溶剂。
如本文所用，术语“组织粘合”指止血产品由于在所述产品与组织之间形成共价键而附着于组织的能力。在本发明的情况下，组织粘合性止血产品与组织粘合可以需要水的存在。
除非另外表明，如本文所用的术语“多孔的”意指止血产品包含允许液体进入产品的孔和/或间隙。
术语“孔隙度”指基质或止血产品中的空隙(即，“空的”)空间的量度，并且为空隙相对总体积的体积百分比。可以适当地通过本领域已知的方法来确定本发明止血产品的孔隙度，所述方法例如气体吸附分析。气体吸附分析包括在各种条件下将固体多孔材料暴露于气体或蒸汽，并评估重量上升或样品体积的变化。这些数据的分析提供了关于固体物理特性的信息，包括：骨架密度、孔隙度和总孔体积。骨架密度通常通过氦测比重实验来评估，并且当不存在闭合的孔隙时表示材料的真实固体密度。应理解，基质由多于一个部分组成时，孔隙度指单个部分的平均孔隙度。因此，如果基质是多孔粉末，孔隙度等于多孔颗粒被孔占据的体积百分比。
如本文所用的术语“平均孔径”指通过扫描电子显微镜(SEM)确定的平均孔直径。Faraj等人,Tissue Engineering,2007,13,10,2387-2394中描述了适合的方法。
如本文所用的术语“水吸收容量”是多孔固体基质吸收水的能力的量度。通过以下步骤来确定多孔固体基质的水吸收容量：将干燥多孔基质样品称重(重量＝Wd)，然后将多孔基质浸入蒸馏水(37℃)中，持续45分钟。然后，将样品从水中移除，并将附着在基质外部的水去除，然后将样品再次称重(重量＝Ww)。水吸收容量＝100％×(Ww-Wd)/Wd。水吸收容量表明基质的孔隙度以及其在存在水时溶胀的能力。
如本文所用的术语“聚噁唑啉”指聚(N-酰基亚烷基亚胺)或聚(芳酰基亚烷基亚胺)，并且还被称为POX。POX的实例为聚(2-乙基-2-噁唑啉)。术语“聚噁唑啉”还涵盖POX共聚物。
术语“亲电基团”指容易被亲核基团亲核进攻的官能团，以及能够通过形成共价键与这类亲核基团反应的官能团。亲电基团通常是带正电的和/或缺电子的。
术语“亲核基团”指容易被亲电基团亲电进攻的官能团，以及能够通过形成共价键与亲电基团反应的官能团。亲核基团通常是富电子的，具有未共用的电子对作为反应位点。
除非另外表明，术语“活化”指修饰聚合物以生成或引入新的反应性官能团，其中所述新的反应性官能团能够与另一官能团进行反应以形成共价键。
如本文所用的术语“交联”指诸如通过共价键在分子间结合的聚合物的组分。两个可交联组分之间的共价键合可以是直接的，或是通过连接基团间接的。
如本文所用的术语“缓冲系统”指可以用于水性系统中以使溶液达到某一缓冲pH值的物质或物质的组合，并且其中所述缓冲系统具有能力防止该缓冲pH值的变化。
如本文所用的液体的“缓冲pH值”指将该液体用蒸馏水稀释10倍后测量得到的在20℃下的pH值。
如本文所用的“缓冲容量”指液体抵抗pH值变化的能力。液体(涂料液体或缓冲液体)的缓冲容量β通过在用蒸馏水稀释10倍后于20℃下来测量，并用mmol.l-1.pH-1来表达。缓冲容量定义如下：
其中dn为加入的碱的无穷小量，而d(p[H+])为得到的氢离子浓度的余对数的无穷小的变化。
根据本发明使用的EL-POX优选地来源于重复单元由下式(I)表示的聚噁唑啉：
(CHR1)mNCOR2
R2和各个R1独立地选自H、任选取代的C1-22烷基、任选取代的环烷基、任选取代的芳烷基、任选取代的芳基；并且m为2或3。
根据优选的实施方案，聚噁唑啉为2-烷基-2-噁唑啉的聚合物，甚至更优选为其均聚物，所述2-烷基-2-噁唑啉选自2-甲基-2-噁唑啉、2-乙基-2-噁唑啉、2-丙基-2-噁唑啉、2-丁基-2-噁唑啉及其组合。优选地，聚噁唑啉为2-丙基-2-噁唑啉的均聚物，并且更优选为2-乙基-噁唑啉的均聚物。
EL-POX可以在其侧链(还被称为侧链亲电基团)、在其末端、或在这两处携带亲电基团。末端封端的EL-POX的实例为琥珀酰亚胺基琥珀酸酯，如CH3O-POX-O2C-CH2-C(CH2CO2-NHS)3。侧链活化的EL-POX的实例为在烷基侧链中含有NHS基团的POX。EL-POX的另一个实例为用NHS-酯终端官能化的星型POX-聚合物。
EL-POX中存在的亲电基团优选地选自：羧酸酯、磺酸酯、膦酸酯、五氟苯基酯、对硝基苯基酯、对硝基硫代苯基酯、酰卤基团、酸酐、酮、醛、异氰酸根、硫代异氰酸根(异硫代氰酸根)、异氰基、环氧化物、活化的羟基、烯烃、缩水甘油醚、羧基、琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺碳酸酯、琥珀酰亚胺氨基甲酸酯、磺基琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺碳酸酯、马来酰亚氨基(马来酰亚胺基)、乙烯磺酰基、酰亚氨基酯、乙酰乙酸酯、卤代缩醛、邻吡啶基二硫化物、二羟基-苯基衍生物、乙烯基、丙烯酸酯、丙烯酰胺、碘乙酰胺及其组合。更优选地，EL-POX中存在的亲电基团选自：羧酸酯、酰氯基、酸酐、酮、醛、异氰酸根、硫代异氰酸根、环氧化物、活化的羟基、烯烃、羧基、琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺碳酸酯、琥珀酰亚胺氨基甲酸酯、磺基琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺碳酸酯、马来酰亚氨基、乙烯磺酰基及其组合。甚至更优选地，EL-POX中存在的亲电基团选自醛、异氰酸根、硫代异氰酸根、琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚氨基及其组合。最优选地，EL-POX中存在的亲电基团选自异氰酸根、硫代异氰酸根、琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚氨基及其组合。
可以用作亲电基团的磺酸酯的实例包括甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、硝基苯磺酸酯(nosylate)、三氟甲磺酸酯及其组合。可以使用的烯烃的实例包括丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙基丙烯酸酯及其组合。活化的羟基的实例包括用选自对硝基苯基氯甲酸酯、羰基二咪唑(例如，1,1-羰基二咪唑)和磺酰氯的活化剂活化的羟基。
本方法使用的EL-POX优选地含有至少10个反应性亲电基团。更优选地，EL-POX含有至少25个反应性亲电基团，甚至更优选地含有至少35个反应性亲电基团，并且最优选地含有至少50个反应性亲电基团。
本发明的EL-POX有利地含有一个或多个侧链亲电基团。通常，EL-POX在每100个单体中含有3至50个侧链亲电基团，更优选地在每100个单体中含有4至35个侧链亲电基团，甚至更优选地在每100个单体中含有至少5至25个侧链亲电基团。
根据本发明使用的EL-POX通常具有1,000g/mol至100,000g/mol，更优选5,000g/mol至50,000g/mol并且最优选10,000g/mol至30,000g/mol的平均分子量。
在本发明的一个实施方案中，多孔固体基质含有至少50wt.％的多糖，最优选至少80wt.％的多糖，所述多糖选自葡聚糖、海藻酸酯、氧化的纤维素、氧化再生纤维素(ORC)、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、透明质酸及其组合。在特别优选的实施方案中，多孔固体基质含有至少50wt.％的ORC，最优选至少80wt.％的ORC。
纤维素是通过β-糖苷键聚合的吡喃葡萄糖的均聚多糖。在氧化前，纤维素可以保持为未再生的并且具有未经组织组织的纤维，或者可以经再生以形成经组织的纤维。当用四氧化二氮处理纤维素纤维时，羟基被氧化为羧酸基团，产生聚糖醛酸。虽然聚糖醛酸是氧化的纤维素的主要组分，但未氧化的羟基作为纤维组分保留。
在本发明的另一实施方案中，多孔固体基质包含含有亲核聚合物的外表面，所述亲核聚合物含有反应性亲核基团。优选地，多孔固体基质含有至少5wt.％，更优选至少10wt.％并且更优选至少50wt.％的亲核聚合物。最优选地，基质由所述亲核聚合物组成。
亲核聚合物通常含有至少2个亲核基团，更优选地含有至少10个亲核基团，最优选地含有至少20个亲核基团。
亲核聚合物的亲核基团优选地选自胺基团，硫醇基团，膦基团及其组合。更优选地，这些亲核基团是胺基团。这些胺基团优选地选自伯胺基团、仲胺基团及其组合。
多孔固体基质外表面中的亲核聚合物优选为富氮聚合物，所述富氮聚合物具有至少1wt.％，更优选5wt.％-10wt.％并且最优选15wt.％-25wt.％的氮含量。
亲核聚合物优选地选自含有反应性亲核基团的蛋白质、壳聚糖和合成聚合物或碳水化合物聚合物，所述反应性亲核基团选自胺、硫醇、膦及其组合。更优选地，所述亲核聚合物选自胶原、壳聚糖及其组合。
如本文所用的术语胶原指胶原的所有形式，包括经处理的衍生物。优选的胶原不具有端肽区域(“端肽胶原”)，是可溶的，并且可以是纤维状形式或非纤维状形式。胶原可以选自微纤维胶原、合成的人胶原，如I型胶原、III型胶原，或I型胶原与III型胶原的组合。也可以将使用加热、辐射或者诸如戊二醛的化学试剂交联的胶原用于形成特别刚性的交联组合物。干燥、多孔、冻干的胶原海绵是特别优选的。
壳聚糖是可生物降解的、无毒的、甲壳质的复合碳水化合物衍生物(聚-[134]-N-乙酰基-D-葡萄糖胺)，其为天然存在的物质。壳聚糖是甲壳质的脱乙酰化形式。通常，当脱乙酰化程度高于70％时，使用通用术语壳聚糖，而当脱乙酰化不显著或低于20％时，使用通用术语甲壳质。低于100％的脱乙酰化时，壳聚糖多糖是含有N-乙酰基-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖胺单体单元的直链嵌段共聚物。
根据一个优选的实施方案，多孔固体基质表面中存在的亲核聚合物的亲核基团是胺基团，并且EL-POX中包含的亲电基团选自羧酸酯、磺酸酯、膦酸酯、五氟苯基酯、对硝基苯基酯、对硝基硫代苯基酯、酰卤基、酸酐、酮、醛、异氰酸跟、硫代异氰酸根、异氰基、环氧化物、活化的羟基、缩水甘油醚、羧基、琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺碳酸酯、琥珀酰亚胺氨基甲酸酯、磺基琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺碳酸酯、酰亚氨基酯、二羟基-苯基衍生物及其组合。
可使用的琥珀酰亚胺基衍生物的实例包括戊二酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、琥珀酰亚胺碳酸酯、二琥珀酰亚胺辛二酸酯、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)、双(2-琥珀酰亚氨基氧基羰基氧基)乙基砜和3,3’-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯)。可以使用的磺基琥珀酰亚胺基衍生物的实例包括磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)-环己烷-1-羧酸酯、二硫代双-磺基琥珀酰亚胺丙酸酯、二磺基-琥珀酰亚胺酒石酸酯、双[2-(磺基-琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基乙基砜)]、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)、二硫代双-(丙酸琥珀酰亚胺酯)。二羟基苯基衍生物的实例包括二羟基苯基丙氨酸、3,4-二羟基苯基丙氨酸(DOPA)、多巴胺、3,4-二羟基氢化肉桂酸(DOHA)、去甲肾上腺素、肾上腺素和儿茶酚。
根据另一个优选实施方案，多孔固体基质外表面中的亲核聚合物的亲核基团为硫醇基团，并且EL-POX中含有的亲电基团选自卤代缩醛、邻吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、乙烯基砜、二羟基苯基衍生物、乙烯基、丙烯酸酯、丙烯酰胺、碘乙酰胺、琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺碳酸酯、琥珀酰亚胺氨基甲酸酯、磺基琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚胺碳酸酯及其组合。更优选地，所述亲电基团选自琥珀酰亚胺酯、卤代缩醛、马来酰亚胺或二羟基苯基衍生物及其组合。最优选地，亲电基团选自马来酰亚胺或二羟基苯基衍生物及其组合。
用于本方法的多孔固体基质优选地具有至少5vol.％的孔隙度。在基质是泡沫或网的情况下，所述基质优选地具有至少50vol.％，更优选至少70vol.％并且最优选至少85vol.％的孔隙度。在基质是多孔粉末的情况下，孔隙度优选为至少20vol.％，更优选为至少50vol.％并且最优选为至少75vol.％。
用于本方法的多孔固体基质优选地具有至少2μm的平均孔径。在基质是泡沫或网的情况下，所述基质优选地具有5μm至500μm、优选10μm至200μm的平均孔径。在基质是多孔粉末的情况下，平均孔径优选为4μm至50μm，更优选为6μm至25μm。
多孔固体基质通常具有至少25％，更优选地具有至少100％，甚至更优选地具有至少250％并且最优选地具有至少1000％的水吸收容量。
用于本方法的多孔固体基质优选地为网或泡沫形式的物体，所述物体具有促进经涂布的基质作为伤口敷料应用的形状，例如片。通常，基质具有10mm至200mm的长度，5mm至200mm的宽度和0.5mm至10mm的厚度。
在本发明的一个实施方案中，多孔固体基质为网。网的实例为由纺织纤维或非纺织纤维制成的片或薄纱。网内包含的纤维优选地由生物相容的且可生物降解的聚合物制成，例如明胶、胶原、ORC或其组合。
在本发明的另一个实施方案中，多孔固体基质为固体泡沫，有时也被称为海绵。所述固体泡沫优选地由交联明胶(明胶海绵)制成。
在本发明的另一实施方案中，多孔固体基质为粉末。多孔粉末优选地由明胶或多糖制成。适合的多糖为淀粉、改性淀粉、海藻酸酯、壳聚糖、葡聚糖及其组合。最优选地，使用的多糖为改性淀粉。
多孔粉末优选为自由流动的无菌粉末的形式。有利地，粉末为微孔粉末。
多孔粉末通常具有10μm-200μm、更优选地具有25μm-100μm并且最优选地具有50μm-75μm的质量加权平均粒径。
用于本方法的涂料液体优选地含有至少50wt.％，更优选地含有至少60wt.％，最优选地含有至少80wt.％的溶剂。所述溶剂优选地选自2-丙醇、乙醇、甲醇、二氯甲烷、丙酮、苯甲醚、1-丁醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、异丙苯、二甲基亚砜、乙酸乙酯、乙醚、甲酸乙酯、庚烷、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、3-甲基-1-丁醇、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、2-甲基-l-丙醇、戊烷、1-戊醇、1-丙醇、乙酸丙酯及其组合。更优选地，所述溶剂选自2-丙醇、乙醇、甲醇、丙酮及其组合。
涂料液体可以适当地含有一些水。通常，涂料液体含有小于5wt.％的水，更优选地含有小于1wt.％的水。
用于本方法的涂料液体优选地含有至少1wt.％的EL-POX。更优选地，涂料液体的EL-POX含量为至少5wt.％，甚至更优选地为至少10wt.％并且最优选地为至少20wt.％。
根据本发明的优选实施方案，通过将涂料液体喷射在基质上来涂布多孔固体基质。根据特别优选的实施方案，通过超声波喷嘴将涂料液体喷射在基质上。本发明人发现，超声波喷嘴的使用使得用含有大量EL-POX的涂料液体均匀地涂布基质成为可能。
可以通过蒸发适当地将溶剂从经涂布的基质去除。蒸发优选地在减压下进行，例如在小于1mbar的压力下进行。
或者，可以通过使经涂布的基质接触液化气体或超临界流体来将溶剂从经涂布的基质去除。优选地，所述液化气体或超临界流体具有至少30bar的压力。
根据本发明的有利实施方案，多孔固体基质包含含有本文之前描述的亲核聚合物的外表面，并且用涂料液体涂布基质后，在去除溶剂之前和/或去除溶剂期间，EL-POX的反应性亲电基团与亲核聚合物的反应性亲核基团通过形成共价键而反应。优选地，所述反应在低于50℃的温度下发生，更优选地在15-25℃的温度(环境条件)下发生。本方法的该实施方案提供了以下优点：反应性亲电基团与反应性亲核基团之间的反应可以在缺乏缓冲系统的情况下发生。
在本方法中，EL-POX中的反应性亲电基团可以与多孔固体基质中存在的反应性亲核基团反应，和/或与本方法中使用的其他组分(例如，亲核交联剂)中存在的亲核基团反应。优选地，将溶剂从经涂布的基质去除后，EL-POX仍然平均含有至少一个，更优选至少5个并且最优选至少40个反应性亲电基团。这些反应性亲电基团为经涂布的基质提供了粘合性能，因为它们可以与例如组织中天然存在的胺基团形成共价键。
用于本方法的涂料液体可以含有溶解形式和/或分散形式的EL-POX。
根据本发明的一个实施方案，涂料液体含有完全溶解形式的EL-POX，并且所述涂料液体还含有分散的缓冲系统。优选地，所述涂料液体具有7至11的缓冲pH值，更优选地具有8至10的缓冲pH值。涂料液体的缓冲容量优选为至少10mmol.l-1.pH-1。更优选地，缓冲容量为至少25mmol.l-1.pH-1，最优选地，缓冲容量为至少50mmol.l-1.pH-1。
在本发明的另一个实施方案中，涂料液体含有完全溶解形式的EL-POX，并且所述方法包括用缓冲液体覆盖多孔固体基质，之后用含EL-POX的涂料液体涂布基质，所述缓冲液体包含缓冲系统。优选地，缓冲液体具有7至11的缓冲pH值，更优选地具有8至10的缓冲pH值。缓冲液体的缓冲容量优选为至少10mmol.l-1.pH-1。更优选地，缓冲容量为至少25mmol.l-1.pH-1，最优选地，缓冲容量为至少50mmol.l-1.pH-1。在缓冲液体为水性的情况下，基质优选地在用缓冲液体覆盖之后干燥，然后再用涂料液体涂布。因此，不希望的EL-POX与基质之间的交联以及EL-POX的分解可以最小化。该实施方案提供了以下优点：EL-POX可以渗透多孔固体基质的孔，并且在这些孔内侧形成涂层。根据本实施方案使用的缓冲液体可以适当地含有亲核交联剂，所述亲核交联剂含有至少2个反应性亲核基团。
在另一个实施方案中，当涂料液体涂布在多孔固体基质上时，涂料液体中存在的至少80wt.％的EL-POX是未溶解的。有利地，除了未溶解的EL-POX之外，涂料液体含有溶解的或未溶解的缓冲系统。涂料液体优选地具有7至11的缓冲pH值，更优选地具有8至10的缓冲pH值。涂料液体的缓冲容量优选为至少10mmol.l-1.pH-1。更优选地，缓冲容量为至少25mmol.l-1.pH-1，甚至更优选地，缓冲容量为至少50mmol.l-1.pH-1。优选地，在用含有未溶解的EL-POX的涂料液体涂布基质后，该基质被EL-POX在其中是可溶的液体溶剂组合物覆盖。该实施方案提供了以下优点：EL-POX不进入孔，并且EL-POX涂层在多孔基质的表面上浓缩。根据特别优选的实施方案，液体溶剂组合物含有亲核交联剂。
可以适合使用的亲核交联剂的实例包括亲核活化的PEG、亲核活化的POX、三赖氨酸及其组合。
亲核交联剂优选地含有至少3个反应性亲核基团。亲核交联剂的亲核基团优选地选自胺基团、硫醇基团、膦基团及其组合。更优选地，这些亲核基团为胺基团。根据优选的实施方案，亲核交联剂中存在的亲核基团为伯胺基团。
在本发明的一个实施方案中，亲核交联剂是低分子量聚胺，其具有小于1,000g/mol，更优选地小于700g/mol并且最优选地小于400g/mol的分子量。甚至更优选地，亲核交联剂选自二赖氨酸；三赖氨酸；四赖氨酸；五赖氨酸；二半胱氨酸；三半胱氨酸；四半胱氨酸；五半胱氨酸；包含两个或更多个选自赖氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸、精氨酸及其组合的氨基酸残基以及其他氨基酸残基的寡肽；精胺；三(氨基甲基)胺；精氨酸及其组合。
根据本发明的另一个实施方案，亲核交联剂是高分子量聚胺，其选自：包含至少两个胺基团的亲核活化的POX(NU-POX)；壳聚糖；壳聚糖衍生物(例如WO 2009/028965中描述的二羧基-衍生化的壳聚糖聚合物)；聚亚乙基亚胺；聚乙烯胺；聚烯丙基胺；胺官能化的聚(甲基)丙烯酸酯；含有胺官能部分的多糖，例如，诸如4,6-二取代的脱氧链霉胺(卡那霉素A、阿米卡星、妥布霉素、地贝卡星、庆大霉素、西索米星、奈替米星)、4,5-二取代的脱氧链霉胺(新霉素B、新霉素C和新霉素E(巴龙霉素))以及非脱氧链霉胺(链霉素)的氨基糖苷；苯乙烯类；包含两个或更多个选自赖氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸、精氨酸及其组合的氨基酸残基以及其他氨基酸残基的多肽；及其组合。天然来源的白蛋白或重组体是可适合用作多肽的多肽实例。胺官能化的聚乙二醇是可适合用作亲核交联剂的高分子量聚胺的另一个实例。
根据另一个优选实施方案，亲核交联剂中存在的亲核基团为硫醇(巯基)基团。
在本发明的一个实施方案中，用于交联聚合物的亲核交联剂是包含2个或更多个硫醇基团的低分子量聚硫醇，其具有小于1,000g/mol，更优选地小于700g/mol并且最优选地小于400g/mol的分子量。甚至更优选地，亲核交联剂选自三巯基丙烷、乙二硫醇、丙二硫醇、2-巯基乙醚、2,2’-(亚乙基二氧基)二乙硫醇、四(乙二醇)二硫醇、五(乙二醇)二硫醇、六乙二醇二硫醇；硫醇修饰的季戊四醇、二季戊四醇、三羟甲基丙烷或二三羟甲基丙烷；含有至少两个半胱氨酸单元的寡肽。
根据本发明的另一个实施方案，用于交联聚合物的亲核交联剂是高分子量聚硫醇，其选自：包含至少两个硫醇基团的NU-POX；硫醇官能化的聚(甲基)丙烯酸酯；含有硫醇官能部分的多糖；苯乙烯类；包含两个或更多个硫醇基团的多肽。
如本文之前限定的亲核交联剂可以适当地用于涂料液体和/或缓冲液体，以便将EL-POX共价连接至具有外表面的多孔固体基质，所述外表面包含含有反应性亲电基团的聚合物。具有亲电基团的适合的聚合物为聚(乳酸-共-乙醇酸)；硫酸软骨素-NHS；硫酸软骨素琥珀酰亚胺基琥珀酸酯；海藻酸酯-NHS；透明质酸-NHS；包含含有甲基丙烯酸酯单体的N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯的共聚物(如Cengiz等人,2010,J.of Polymer Science Part A:Polymer Chemistry,48卷,21期,4737-4746中描述)；用N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基磺基琥珀酰亚胺或其衍生物修饰含有两个或更多个羧基的生物低分子量化合物中的至少一个羧基而获得的生物低分子量的衍生物(如EP1548004中描述)。优选地，在涂料液体中使用亲核交联剂。
在本发明的另一个优选实施方案中，EL-POX和亲核交联剂存在于单独的流体中，但同时涂布至多孔固体基质上。这可以适当地通过使用两个超声波喷射喷嘴来实现。因此，根据该有利的实施方案，所述方法包括：
·提供固体多孔基质，
·提供涂料液体，其包含在第一溶剂中的EL-POX；
·提供包含缓冲系统和/或亲核交联剂以及第二溶剂的第二液体；
·通过使涂料液体流经第一超声波喷嘴来产生第一喷射流；
·通过使第二液体流经第二超声波喷嘴来产生第二喷射流；
·将固体多孔固体基质表面的至少一部分同时暴露于第一喷射流和第二喷射流，以便用包含EL-POX以及亲核交联剂和/或缓冲系统的涂料混合物覆盖固体多孔基质的所述部分；
·从涂料混合物去除第一溶剂和第二溶剂，以获得至少一部分被含有EL-POX和亲核交联剂的干燥层涂布的多孔固体基质。
该方法中的EL-POX可以适当地被PVP-丙烯酸-NHS或(聚-((N-乙烯基吡咯烷酮)50-共-(丙烯酸)25-共-(丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)25)替代。
在上述双喷射方法使用亲核交联剂的情况下，在去除溶剂之前、期间或之后，EL-POX和亲核交联剂可彼此反应形成交联聚合物。在优选的实施方案中，干燥层中包含的交联聚合物包含未反应的亲电基团。适合的溶剂如本文之前所限定。在优选的实施方案中，第一溶剂和第二溶剂是可混溶的，在更优选的实施方案中，第一溶剂和第二溶剂是相同的。
在第二液体含有缓冲系统的情况下，第二液体优选地具有7至11的缓冲pH值，更优选地具有8至10的缓冲pH值。所述第二液体的缓冲容量优选为至少10mmol.l-1.pH-1。更优选地，缓冲容量为至少25mmol.l-1.pH-1，最优选地，缓冲容量为至少50mmol.l-1.pH-1。
本发明的另一个方面涉及选自经涂布的网、经涂布的泡沫或经涂布的粉末的粘合性止血产品，所述止血产品包含：
·具有至少20vol.％的孔隙度并且包含含有亲核聚合物的外表面的多孔固体基质，所述亲核聚合物含有反应性亲核基团；
·覆盖至少一部分固体基质的粘合涂料，所述涂料包含平均含有至少1个反应性亲电基团的EL-POX。
这种粘合性止血产品可以适当地通过本文之前所述的方法来获得。
如本文之前所解释，由于存在能够与组织中天然存在的亲核基团反应的亲电反应性基团，止血产品具有优异的粘合性能。另外，这种止血产品提供了以下优点：在与血液或其他水性流体接触时，由于EL-POX中的反应性亲电基团会通过形成共价键与亲核聚合物的反应性亲核基团反应，粘合涂料将会锚定在多孔基质上。
粘合性止血材料的涂料中存在的EL-POX可以与多孔固体基质共价键合。此外，EL-POX可以交联。
多孔固体基质、EL-POX以及亲核聚合物的优选形式已在本文之前进行了描述。
止血产品的涂料中的EL-POX优选地含有5个反应性亲电基团，更优选地含有25个反应性亲电基团，并且最优选地含有50个反应性亲电基团。
基质通常占止血产品的至少10wt.％，更优选至少50wt.％并且最优选至少75wt.％。
含EL-POX的涂料通常占止血产品的5wt.％-75wt.％。更优选地，所述涂料占止血产品的10wt.％-50wt.％，最优选地占止血产品的12wt.％-25wt.％。
涂料优选地含有25wt.％-100wt.％的EL-POX。更优选地，涂料的EL-POX含量为至少50wt.％，最优选为至少75wt.％。
本发明能够制备经涂布的止血产品，其中粘合涂料含有与多孔固体基质的孔相互连通的孔。
根据特别优选的实施方案，粘合止血剂具有至少50％、更优选至少80％的孔密度。
通过以下非限制性的实施例来进一步说明本发明。
实施例
实施例1
通过以下步骤合成含有25％NHS酯单元的NHS-侧链活化的聚[2-(丙基/NHS-酯-乙基)-2-噁唑啉]共聚物(＝EL-POX,25％NHS)：
通过使用阳离子开环聚合(CROP)，使用75％2-正丙基-2-噁唑啉(nPropOx)和25％2-甲氧基羰基-乙基-2-噁唑啉(MestOx)来合成聚[2-(丙基/甲氧基-羰基-乙基)-2-噁唑啉]共聚物(聚合度＝DP＝约100)。获得含有25％2-甲氧基羰基-乙基(1H-NMR)的统计共聚物。将含有25％2-甲氧基羰基-乙基的聚合物用氢氧化钠(1M)水解，得到具有25％2-羧基-乙基(1H-NMR)的共聚物。通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二异丙基碳二亚胺(DIC)将所述2-羧基-乙基活化，得到2-(丙基/NHS-酯-乙基)-2-噁唑啉]共聚物(＝EL-POX,25％NHS)。根据1H-NMR和UV-光谱，该聚合物含有25％NHS-酯基团。
根据Faraj等人,Tissue Engineering,2007,13,10,2387-2394中描述的程序制备牛胶原海绵。从奶牛的肌腱中提取胶原。如此获得的胶原海绵具有95％至98％的孔隙度和80-100μm的平均孔径。通过比较胶原膜的密度(无空隙空间)与胶原海绵的密度来计算孔隙度。根据Faraj等人,Tissue Engineering,2007,13,10,2387-2394中描述的方法，使用扫描电子显微镜来确定孔径。
将EL-POX(25％NHS)溶解于丙酮(180mg/ml)。将该溶液逐滴均匀分布至冻干的牛胶原海绵的顶部。涂布后，立即将海绵在室温和真空(1mbar)下干燥8小时。获得具有EL-POX(25％NHS)涂料(15mg/cm2)的粘合性胶原海绵。
为评估EL-POX(25％NHS)与胶原上存在的亲核胺基团的可能的交联，用丙酮冲洗经涂布的胶原海绵。丙酮萃取物中回收了所有的EL-POX(25％NHS)，说明在涂布和/或干燥期间EL-POX中的亲电基团未与胶原中的胺基团反应。
通过以下步骤来评估经涂布的胶原海绵的止血性能：
·将100μL新鲜的肝素化的全血逐滴添加至胶原海绵涂布EL-POX(25％NHS)一侧的顶部。
·将另一块经EL-POX(25％NHS)涂布的海绵置于经血液涂布的胶原海绵的顶部，使经EL-POX涂布的一侧面对血液(“夹层法”)。
·使用薄纱施加轻度的压力持续10秒。然后，将夹层物置于含水的烧杯中，并将水搅拌2分钟。在这些条件下，两块胶原海绵保持粘合，并且没有血液从海绵中漏出，说明止血和粘合。
在对照实验中，使用未经涂布的胶原海绵，在水中20秒后该海绵分离，并且水变红，说明不能止血。
实施例2
通过以下步骤合成含有15％NHS-酯基团的NHS-侧链活化的聚2-(丙基/羟基-乙基-酰胺-乙基/NHS-酯-乙基-酯-乙基-酰胺-乙基)-2-噁唑啉]三元共聚物(＝EL-POX,15％NHS)：
通过CROP，使用70％2-丙基-2-噁唑啉和30％2-甲氧基羰基-乙基-2-噁唑啉来合成聚[2-(丙基/甲氧基-羰基-乙基)-2-噁唑啉]共聚物(DP＝+/-100)。获得含有30％2-甲氧基羰基-乙基(1H-NMR)的统计共聚物。然后，使含有30％2-甲氧基羰基-乙基的聚合物与乙醇胺反应，得到具有30％2-羟基-乙基-酰胺-乙基(1H-NMR)的共聚物。之后，将一部分2-羟基-乙基-酰胺-乙基与琥珀酸酐反应，得到具有70％2-丙基、15％2-羟基-乙基-酰胺-乙基和15％2-羧基-乙基-酯-乙基-酰胺-乙基(根据1H-NMR)的三元共聚物。最后，通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二异丙基碳二亚胺(DIC)活化2-羧基-乙基-酯-乙基-酰胺-乙基，得到EL-POX(15％NHS)。根据1H-NMR，该聚合物含有15％NHS-酯基团。
将EL-POX(15％NHS)(130mg)和无水硼酸钠(47mg)称重，并添加异丙醇/2-丁酮的溶液(1,6mL,v/v,1:1)，由于无水硼酸钠在异丙醇/2-丁酮(v/v,1:1)中不可溶，得到细粒悬浮液。将该悬浮液逐滴均匀分布至冻干的牛胶原海绵的顶部。涂布后，立即将海绵在室温和真空(1mbar)下干燥8小时。获得具有EL-POX(15％NHS)和无水硼酸钠涂料(19mg/cm2)的粘合性胶原海绵。
通过以下步骤来评估经涂布的胶原海绵的止血性能：
·将100μL新鲜的肝素化的全血逐滴添加至胶原海绵涂布EL-POX(15％NHS)和无水硼酸钠一侧的顶部。
·将另一块经EL-POX(15％NHS)和无水硼酸钠涂布的海绵置于经血液涂布的胶原海绵的顶部，使经EL-POX涂布的一侧面对血液(“夹层法”)。
·使用薄纱施加轻度的压力持续10秒。然后，将夹层物置于含水的烧杯中，并将水搅拌3分钟。
在这些条件下，两块胶原海绵保持粘合，并且没有血液从海绵漏出，说明止血和粘合。
实施例3
在本实施例中，对多种聚合物测试了剪切强度，表1中提供了样品的概述。用2-正丙基-2-噁唑啉、2-乙基-2-噁唑啉和2-甲氧基-乙基-2-噁唑啉的CROP来合成聚合物(DP＝+/-100)。将用作样品1-3的EL-POX通过实施例1中描述的途径进行后修饰。将用作样品4-6的EL-POX通过实施例2中描述的途径来合成。通过1H-NMR和UV-光谱对所有活化的聚合物的NHS含量进行分析。PEG 4-臂NHS(季戊四醇聚(乙二醇)醚戊二酸四琥珀酰亚胺酯，样品7)得自NOF America公司。将牛胶原海绵(5×7×1cm(宽×长×高))作为对照(样品8)进行测试。如实施例1所描述，制备所有经涂布的海绵。
制备程序
·将多孔胶原海绵称重(n＝7)。
·通过将限定量的聚合物溶解于有机溶剂(二氯甲烷(DCM)/异丙醇(IPA)(v/v,1:1))直至300mg/mL的最终浓度来制备EL-POX溶液。
·将EL-POX溶液逐滴涂布至多孔胶原海绵的一部分(14cm2)，以获得15mg/cm2的目标涂料密度。将经涂布的多孔胶原海绵在室温下于真空烘箱(5mbar)中干燥过夜。
·将经涂布的多孔胶原海绵再次称重，并确定涂料密度。表1中提供了使用的聚合物以及涂料密度的概述。
测试程序
通过以下方式测试这些聚合物的剪切强度：
·将构建物剪成5×1cm(宽×高)的相等的块。
·使用200μL肝素化的人血液，将经涂布的一侧放置在一起，使粘合侧彼此相对。施加重量(10g)持续10秒，以提供标准压力。
·使构建物交联限定的时间：1分钟(t1)或15分钟(t15)。
·在限定的时间点，将构建物放置在剪切测试器(Zwicky Roell,20N载荷元件)中，并测量剪切强度直至断裂。
·输出：将测量的力(N)除以构建体的重叠面积(cm2)，得到剪切强度(以kPa计)。结果列于表1。
表1：剪切强度检测结果
由这些结果可以推论：
·EL-POX聚合物(1-6)随着交联时间增加显示出更高的剪切强度。
·在t15时，EL-POX聚合物(2和5)比聚合物PEG 4-臂NHS(7)显示出更高的剪切强度值。
·对照样品(8)显示出受限的剪切强度至无剪切强度，表明交联是通过NHS-酯基团产生的。
本实施例说明，涂布在胶原上的EL-POX能够在血液存在时交联，比涂布在胶原上的同样浓度的PEG 4-臂NHS产生了更高的剪切强度。
实施例4
通过以下步骤合成含有20％NHS-酯基团的NHS-侧链活化的聚2-(丙基/羟基-乙基-酰胺-乙基/NHS-酯-乙基-酯-乙基-酰胺-乙基)-2-噁唑啉]三元共聚物(＝EL-POX,20％NHS)：
通过CROP，使用70％2-丙基-2-噁唑啉和30％2-甲氧基羰基-乙基-2-噁唑啉来合成聚[2-(丙基/甲氧基-羰基-乙基)-2-噁唑啉]共聚物(DP＝+/-100)。获得含有30％2-甲氧基羰基-乙基(1H-NMR)的统计共聚物。然后，将含有30％2-甲氧基羰基-乙基的聚合物与乙醇胺反应，得到具有30％2-羟基-乙基-酰胺-乙基(1H-NMR)的共聚物。之后，一部分2-羟基-乙基-酰胺-乙基与琥珀酸酐反应，得到具有70％2-丙基、10％2-羟基-乙基-酰胺-乙基和20％2-羧基-乙基-酯-乙基-酰胺-乙基(根据1H-NMR)的三元共聚物。最后，通过N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二异丙基碳二亚胺(DIC)活化2-羧基-乙基-酯-乙基-酰胺-乙基，得到EL-POX(20％NHS)。根据1H-NMR，该聚合物含有20％NHS-酯基团。
在烷基侧链中含有丙基和胺基团的胺官能化的NU-POX通过以下合成：通过nPropOx与MestOx的CROP，以及后续的用乙二胺使甲基酯侧链酰胺化，以得到聚(2-丙基/氨基乙基酰氨基乙基-2-噁唑啉)共聚物(NU-POX)。根据1H-NMR，该聚合物含有20％NH2。
使用牛胶原海绵(7×5×1cm)，其如实施例1所述制备。对于这些实验，使用装有加热板的ExactaCoat SC超声波喷射装置(Sono-Tek)来涂布胶原海绵。
测试4A：EL-POX的溶液
根据表2示出的设置，通过超声波喷射，将EL-POX(EL-POX,20％NHS)在IPA/2-丁酮(v/v,1:1)(90mg/mL)中的溶液均匀地分布在胶原上，得到5mg/cm2的涂料密度。SEM-图像显示，维持了胶原的多孔结构。
将构建体剪切成块(2cm2)，并如实施例3所述，使用剪切强度测试在t15进行测试。结果为10.9+/-3.3kPa(n＝4)，表明了良好的粘合和止血。
表2：超声波喷射参数
测试4B：具有悬浮缓剂的EL-POX
根据表2示出的设置，通过超声波喷射，将具有悬浮的HEPES-缓冲剂(1.7g)的EL-POX在IPA/2-丁酮(v/v,1:1)(10mg/mL)中的溶液均匀地分布在胶原上，得到5mg/cm2的涂料密度。SEM-图像显示，维持了胶原的多孔结构。将构建体剪切成块(2cm2)，并如实施例3所述使用剪切强度测试在t15进行测试。测量的平均剪切强度为2.6+/-0.8kPa(n＝3)，表明良好的粘合和止血。
测试4C：(1)NU-POX与缓冲剂的溶液+(2)EL-POX的溶液
根据表2示出的设置，通过超声波喷射，将具有HEPES(1.7g)的NU-POX的水溶液(10mg/mL)均匀地分布至胶原上。将溶剂蒸发30min。之后，根据表2展示的设置，通过超声波喷射，将EL-POX在IPA/2-丁酮(v/v,1:1)(15mg/mL)中的溶液均匀地分布至经涂布的胶原顶部。涂布后，获得5mg/cm2(±40wt.％NU-POX和±60wt.％EL-POX)的涂料密度。SEM-图像显示，维持了胶原的多孔结构。将构建体切成块(2cm2)，并如实施例3所述使用剪切强度测试在t15进行测试。测量的平均剪切强度为3.9+/-2.9kPa(n＝2)，表明良好的粘合和止血。
测试4D：缓冲剂的溶液(EL-POX的悬浮液)
根据表2中示出的设置，通过超声波喷射将EL-POX在IPA/乙醚/三乙铵(v/v/v,50:50:1)中的悬浮液均匀地分布至胶原上。涂布后，获得4mg/cm2的涂料密度。SEM-图像显示，维持了胶原的多孔结构。将构建体剪切成块(2cm2)，并如实施例3所述使用剪切强度测试来进行测试。测量的平均剪切强度为4.2+/-3.5kPa(n＝3)，表明良好的粘合和止血。
另外，通过以下来评估经超声波涂布的胶原海绵4A-4D的止血性能：
·将100μL新鲜的肝素化的全血逐滴添加至胶原海绵涂布EL-POX一侧的顶部。
·将另一块经EL-POX涂布的海绵置于经血液涂布的胶原海绵的顶部，使经EL-POX涂布的一侧面对血液(“夹层法”)。
·使用薄纱施加轻度的压力持续10秒。然后，将夹层物置于含水的烧杯中，并将水搅拌两分钟。
在这些条件下，两块胶原海绵4A-4D都保持粘合，并且没有血液从海绵漏出，表明止血和粘合。
实施例5
如实施例2所述合成NHS-侧链活化的聚2-(丙基/羟基-乙基-酰胺-乙基/NHS-酯-乙基-酯-乙基-酰胺-乙基)-2-噁唑啉]三元共聚物(＝EL-POX,20％NHS)。
将EL-POX(20％NHS)溶解于甲醇(180mg/ml)。将该溶液逐滴均匀地分布至氧化再生纤维素贴片(ORC,Gelita-Cel)的顶部。涂布后，立即将贴片在室温和空气流下干燥4小时。获得具有EL-POX(20％NHS)涂料(12mg/cm2)的ORC。
通过以下来评估经涂布的ORC的止血性能：
·将100μL新鲜的肝素化的全血逐滴添加至ORC涂布EL-POX(20％NHS)一侧的顶部(1×1cm)。
·将另一块经EL-POX(20％NHS)涂布的ORC置于经血液涂布的ORC的顶部，使经EL-POX涂布的一侧面对血液(“夹层法”)。
·使用薄纱施加轻度的压力持续10秒。然后，将夹层物置于含水的烧杯中，并将水搅拌五分钟。在这些条件下，两块ORC块保持粘合持续五分钟，并且介质没有变红。
在使用未经涂布的ORC对照实验中，在水中搅拌的过程中，ORC在一分钟内分离并且水变红，表明不能止血。
实施例6
如实施例2所述合成NHS-侧链活化的聚2-(丙基/羟基-乙基-酰胺-乙基/NHS-酯-乙基-酯-乙基-酰胺-乙基)-2-噁唑啉]三元共聚物(＝EL-POX,20％NHS)。壳聚糖粉末得自Sigma-Aldrich(脱乙酰化程度75-85％，Mn 10,000)。淀粉粉末得自BioCer,Germany。
通过以下方法用EL-POX(20％NHS(EL-POX))单独涂布粉末。
·将粉末(壳聚糖或淀粉)称重，并用EL-POX(15mg/mL)在DCM中的溶液涂布。
·将悬浮液在减压下干燥。
·之后，将干燥的经涂布的粉末磨碎，形成均匀的细粉末。经涂布的壳聚糖粉末含有约25wt.％EL-POX。经涂布的淀粉粉末含有约10wt.％EL-POX。
作为对照，测试了磨碎的未经涂布的壳聚糖粉末、磨碎的未经涂布的淀粉粉末和磨碎的EL-POX。
将经EL-POX涂布的粉末和对照样品与(1)碳酸盐缓冲剂(0.1M,pH 9)或(2)肝素化的人血液(pH 7.4)混合，以评估止血性能。通过以下方式测试止血性能：将粉末在Eppendorf管中称重，并且与250uL的缓冲剂(1)或血液(2)混合。通过将管上下反转直至形成凝胶来确定凝胶时间。
表3中给出了所使用的材料的量以及交联测试的结果。
表3：交联测试的结果
*由经涂布的粉末中的wt％EL-POX计算
这些结果显示，壳聚糖能够与EL-POX(样品2)交联，并且淀粉不能与EL-POX(样品7)交联。经EL-POX涂布的壳聚糖和淀粉都能够与血液交联(样品1和10)，而未经涂布的壳聚糖和淀粉粉末在存在缓冲剂和/或血液的情况下不形成凝胶(样品3、4、8和9)。EL-POX粉末能够通过与血液中的胺反应而形成凝胶(样品5)，然而当EL-POX粉末与缓冲剂结合时未观察到凝胶形成(样品6)。
发现含EL-POX的凝胶在水中是稳定的。相比之下，通过将200mg淀粉或壳聚糖添加至250μL血液而制备的血液凝胶在水中不稳定。
实施例7
如实施例3所述合成NHS-侧链活化的聚2-(丙基/羟基-乙基-酰胺-乙基/NHS-酯-乙基-酯-乙基-酰胺-乙基)-2-噁唑啉]三元共聚物(＝EL-POX,20％NHS)。PEG 4-臂NHS(季戊四醇聚(乙二醇)醚戊二酸四琥珀酰亚胺酯，EL-PEG)得自NOF America公司。牛胶原海绵(7×5×1cm)如实施例1所述制备。
比较两种应用方法：(I)熔化方法和(II)涂布液体方法。
(I)熔化方法(比较例)
将已知量的聚合物粉末、EL-POX(20％NHS)和EL-PEG均匀地分布至胶原海绵的顶部，以获得表4中示出的涂料密度。将EL-POX(20％NHS)和EL-PEG在表4中示出的温度下加热，在预热的烘箱中保持5min以熔化聚合物粉末。该时间范围和温度设置内，EL-POX和EL-PEG均保持稳定。
制备的构建体的SEM-图像显示，形成的聚合物膜将胶原顶层的多孔结构密封。
表4：设置(I)熔化方法
聚合物 烘箱温度(℃) 涂料密度(mg/cm2) EL-POX,20％NHS 140 12 EL-PEG 60 11
(II)涂布液体方法
将EL-POX(20％NHS)粉末溶解于IPA/DCM(v/v,1:1)(15mg/mL)并通过滴液涂布将该溶液均匀地分布在胶原海绵的顶部，以获得12mg/cm2的涂料密度。将该海绵在真空烘箱中干燥2小时。SEM-图像显示，维持了胶原的多孔结构。
通过以下来评估经涂布的胶原海绵的止血性能：
·将100μL新鲜的肝素化的全血逐滴添加至胶原海绵经EL-POX,20％NHS或EL-PEG涂布的一侧的顶部。
·将另一块经涂布的海绵置于经血液涂布的胶原海绵的顶部，使经涂布的一侧面对血液(“夹层法”)。
·使用薄纱施用轻度的压力持续10秒。然后，将夹层物置于含水的烧杯中，并将水搅拌一分钟。
通过熔化制备的胶原海绵(EL-POX和EL-PEG)在一分钟内分离，表明不存在止血和粘合。通过滴液涂布制备的胶原海绵(使用EL-POX)在1分钟的时间内保持粘合，表明止血和粘合。
本实施例显示出应用方法影响胶原中的孔的可用性，并且解释了由熔化获得的海绵与由涂布液体获得的海绵之间的止血和粘合的区别。
实施例8
创伤肝脏和脾脏破裂的治疗是手术的主要挑战。因为脾脏具有优异的血液供给，并且脾脏的破裂经常伴随大量的腹部出血。
使n＝1的麻醉的猪(家猪，雄性，体重范围：40kg，成年)经受标准化结合的穿透脾脏破裂。进行中线刨腹手术以到达脾脏。使用手术刀，n＝3(S1…S3)进行包囊下标准化损伤(10mm×10mm)。
测试三种止血产品，表5提供了概述。
表5：测试产品的描述
用轻度的压力来应用止血产品。应用产品后，对止血时间进行评估，参见表6。
表6：动物模型结果
TTH＝止血时间；n＝实现止血需要的产品编号
本实施例显示出经EL-POX涂布的海绵在猪脾脏上的止血功效。根据表6的目的(end point)，经EL-POX涂布的海绵在本模型中获得止血作用时表现与参考产品(HemopatchTM)同样好，并且好于对照。此外，观察到经EL-POX涂布的海绵的血液吸收容量优于参考产品的血液吸收容量。因此，用经EL-POX涂布的海绵实现的止血受助于血液凝固的快速开始。