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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610140153.5 (22)申请日 2016.03.14 (71)申请人 武汉纺织大学 地址 430200 湖北省武汉市江夏区阳光大 道1号 (72)发明人 周应山 董齐 殷先泽 杨红军 柏自奎 顾绍金 陶咏真 徐卫林 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 (51)Int.Cl. A61L 24/08(2006.01) A61L 24/00(2006.01) C08B 37/08(2006.01) (54)发明名称 一种透明质酸生物粘合剂。
2、的制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种生物粘合剂的制备方法， 特 别是一种透明质酸生物粘合剂的制备方法， 属于 生物材料制备技术领域。 本发明是通过在冷冻干 燥法制得的无定型透明质酸分子链上接枝烯基 基团， 经溶解、 混合制备得到的生物粘合剂。 本发 明采用混合溶剂环境下的冷冻干燥工艺， 大大破 坏透明质酸的晶型结构， 形成无定型结构的透明 质酸分子， 使得透明质酸的接枝率大大提高， 完 全克服因接枝率低下引起的紫外固化速度缓慢、 形成的凝胶强度差的问题。 本发明方法制得的生 物粘合剂在紫外光的照射下迅速凝胶， 且凝胶安 全、 生物相容性好、 可完全降解吸收。 本发明制备 方法简单、 成本低。
3、， 易工业化生产。 权利要求书1页 说明书4页 CN 105770983 A 2016.07.20 CN 105770983 A 1.一种透明质酸生物粘合剂的制备方法， 其特征在于， 所述制备方法按以下步骤进行： a. 糊状无定型透明质酸的制备 将透明质酸和非质子溶剂置于去离子水中， 透明质酸与去离子水质量体积比为1： 10 200， 非质子溶剂与去离子水体积比为1： 1050， 室温下搅拌124小时， 将透明质酸、 非质 子溶剂、 去离子水形成的溶液在温度为-10-50、 压强为50200Pa条件下， 干燥2472 小时， 得到糊状无定型透明质酸； b. 马来酰化透明质酸的制备 将由步骤a得。
4、到的糊状无定型透明质酸和马来酸酐置于非质子溶剂中， 糊状无定型透 明质酸与非质子溶剂质量体积比为1： 5200， 糊状无定型透明质酸分子链上羟基与马来酸 酐的酸酐基摩尔比为1： 0.120， 室温下搅拌均匀， 在2580条件下反应， 反应时间为12 48小时， 反应结束后， 在糊状无定型透明质酸、 马来酸酐、 非质子溶剂的混合溶液中加入 1mol/L的NaHCO3溶液， 调整混合溶液的pH至7-8， 将混合溶液进行透析， 透析时间为2天， 形 成马来酰化透明质酸溶液， 将马来酰化透明质酸溶液在温度为-50、 压强为120Pa条件 下， 冷冻干燥2472小时， 得到摩尔取代度为0.30.8的马来。
5、酰化透明质酸； c. 透明质酸生物粘合剂的制备 将由步骤 b得到的马来酰化透明质酸与紫外光引发剂、 磷酸盐缓冲溶液按照质量百分 比分别为： 马来酰化透明质酸 18% 光引发剂 0.050.1% 磷酸盐缓冲溶液 91.998.95% 的比例， 室温下混合均匀， 得到粘度为5000500000cps的透明质酸生物粘合剂。 2.根据权利要求1所述的一种透明质酸生物粘合剂的制备方法， 其特征在于： 所述非质 子溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺或二甲基亚砜中的一种。 3.根据权利要求1所述的一种透明质酸生物粘合剂的制备方法， 其特征在于： 所述光引 发剂为2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮或1。
6、-羟基环己基苯基甲酮或2,2-二甲氧 基-苯基苯乙酮中的一种。 4.根据权利要求1所述的一种透明质酸生物粘合剂的制备方法， 其特征在于： 所述磷酸 盐缓冲溶液为pH为7.07.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中的一 种。 权 利 要 求 书 1/1 页 2 CN 105770983 A 2 一种透明质酸生物粘合剂的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种生物粘合剂的制备方法， 特别是一种透明质酸生物粘合剂的制备 方法， 属于生物材料的制备技术领域。 背景技术 0002 生物粘合剂是一种用于防止组织粘连、 止血、 手术中防止空气和体液泄漏的生物 。
7、医学材料， 其使用可替代传统复杂耗时的外科手术缝合， 起到快速封闭创面、 避免创面感 染、 有效减轻瘢痕的效果。 0003 目前， 临床上使用较多的是氰基丙烯酸酯类粘合剂、 纤维蛋白类粘合剂等。 中国专 利公开号为CN104958781A， 公开日为2015年10月7日， 发明名称为 “一种化学医用粘合剂组 合物及其制备方法” 公开了氰基丙烯酸酯粘合剂的制备方法 ； 中国专利公开号为 CN101352581A， 公开日为2009年1月28日， 发明名称为 “关节软骨修复移植物固定用粘合剂 及人纤维蛋白原在制备该粘合剂中的应用” 等公开了纤维蛋白类粘合剂的制造方法。 然而， 这些粘合剂仍然存在各。
8、种不足之处。 氰基丙烯酸酯类粘合剂虽然能在常温下迅速固化， 但 是在其使用过程中因聚合反应产生的热量会对机体组织造成一定程度的灼伤、 组织相容性 差造成创面愈合效果差等问题； 纤维蛋白类粘合剂虽然具有良好的生物相容性和可降解 性， 但是因其来源为异体的人或动物血清而可能存在潜在的病毒感染风险， 其临床使用的 安全性受到广泛关注。 发明内容 0004 针对上述问题， 本发明的目的在于提供一种安全、 生物相容好、 可降解吸收的生物 粘合剂的制备方法。 0005 为了实现上述目的， 其技术方案如下， 一种透明质酸生物粘合剂的制备方法， 所述 制备方法按以下步骤进行： a. 糊状无定型透明质酸的制备 。
9、将透明质酸和非质子溶剂置于去离子水中， 透明质酸与去离子水质量体积比为1： 10 200， 非质子溶剂与去离子水体积比为1： 1050， 室温下搅拌124小时， 将透明质酸、 非质 子溶剂、 去离子水形成的溶液在温度为-10-50、 压强为50200Pa条件下， 干燥2472 小时， 得到糊状无定型透明质酸； b. 马来酰化透明质酸的制备 将由步骤a得到的糊状无定型透明质酸和马来酸酐置于非质子溶剂中， 糊状无定型透 明质酸与非质子溶剂质量体积比为1： 5200， 糊状无定型透明质酸分子链上羟基与马来酸 酐的酸酐基摩尔比为1： 0.120， 室温下搅拌均匀， 在2580条件下反应， 反应时间为1。
10、2 48小时， 反应结束后， 在糊状无定型透明质酸、 马来酸酐、 非质子溶剂的混合溶液中加入 1mol/L的NaHCO3溶液， 调整混合溶液的pH至7-8， 将混合溶液进行透析， 透析时间为2天， 形 成马来酰化透明质酸溶液， 将马来酰化透明质酸溶液在温度为-50、 压强为120Pa条件 说 明 书 1/4 页 3 CN 105770983 A 3 下， 冷冻干燥2472小时， 得到摩尔取代度为0.30.8的马来酰化透明质酸； c. 透明质酸生物粘合剂的制备 将由步骤 b得到的马来酰化透明质酸与紫外光引发剂、 磷酸盐缓冲溶液按照质量百分 比分别为： 马来酰化透明质酸 18% 光引发剂 0.05。
11、0.1% 磷酸盐缓冲溶液 91.998.95% 的比例， 室温下混合均匀， 得到粘度为5000500000cps的透明质酸生物粘合剂。 0006 所述非质子溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺或二甲基亚砜中的一种。 0007 所述光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮或1-羟基环己基苯基 甲酮或2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮中的一种。 0008 所述磷酸盐缓冲溶液为pH为7.07.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液或K2HPO4-KH2PO4 缓冲溶液中的一种。 0009 由于采用以上技术方案， 本发明的一种透明质酸生物粘合剂的制备方法其有益技 术效果是： （1） 本发明的制。
12、备方法中采用混合溶剂环境下的冷冻干燥工艺， 大大破坏透明质酸的 晶型结构， 使得透明质酸的接枝率大大提高， 完全克服因接枝率低下引起的紫外固化速度 缓慢、 形成的凝胶强度差的问题。 0010 （2） 本发明的制备方法中采用的是安全、 生物相容性好、 可完全降解吸收的天然高 分子， 使得制得的生物粘合剂具备安全、 生物相容、 可降解吸收的特点。 本发明制备方法简 单、 成本低， 易工业化生产。 具体实施方式 0011 下面结合具体实施例对本发明一种透明质酸生物粘合剂作进一步详细描述。 0012 一种透明质酸生物粘合剂的制备方法， 所述制备方法按以下步骤进行： a. 糊状无定型透明质酸的制备 将透。
13、明质酸和非质子溶剂置于去离子水中， 透明质酸与去离子水质量体积比为1： 10 200， 非质子溶剂与去离子水体积比为1： 1050， 室温下搅拌124小时， 将透明质酸、 非质 子溶剂、 去离子水形成的溶液在温度为-10-50、 压强为50200Pa条件下， 干燥2472 小时， 得到糊状无定型透明质酸， 所述非质子溶剂为二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺或二甲 基亚砜中的一种。 0013 透明质酸是一种由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基葡糖为双糖单元组成的直链型高 分子多糖， 具有良好的生物相容性与生物可降解性。 作为人体组织细胞外基质的主要成分 之一， 透明质酸能与多种细胞受体相互作用， 以此促进。
14、细胞的黏附、 迁移与生长， 且在体内 可被透明质酸酶降解为氨基葡萄糖被人体吸收， 从而使得透明质酸在皮肤、 软骨、 神经等组 织工程支架领域具有广泛的应用前景。 0014 透明质酸分子链上具有自由羧基和羟基， 可以按照分子设计用途进行各种接枝反 应， 然而， 由于其分子内和分子间存在强的氢键作用力， 致使透明质酸分子链排列较为规 整， 形成较高程度的结晶区， 不利于反应试剂的进入， 反应程度低下。 因此， 透明质酸在进行 说 明 书 2/4 页 4 CN 105770983 A 4 反应的时候， 尤其是透明质酸以固体的形式进行固-液体系反应时， 要尽可能的破坏晶区， 使得反应试剂基团与透明质酸。
15、分子链上反应基团相互接触， 从而提高反应几率。 0015 本发明中将透明质酸置于非质子溶剂与去离子水的混合溶剂中， 搅拌至完全溶 解。 混合溶剂中的去离子水是透明质酸的良溶剂， 通过控制透明质酸、 非质子溶剂与去离子 水的比例， 可以保证透明质酸处于完全溶解的状态下， 且透明质酸的分子链呈现伸展状态， 分子链上羟基基团完全被溶剂分子包围。 整个溶液体系在温度为-10-50、 压强为50 200Pa条件下， 冷冻干燥2472小时， 溶液体系中的去离子水分子完全升华离开， 而非质子 溶剂由于高沸点、 难挥发的特点， 得以保留在透明质酸分子链之间， 此时透明质酸分子链上 羟基基团被非质子溶剂包围， 。
16、因而得到含有非质子溶剂的无定型结构的透明质酸糊状物。 0016 b. 马来酰化透明质酸的制备 将由步骤a得到的糊状无定型透明质酸和马来酸酐置于非质子溶剂中， 糊状无定型透 明质酸与非质子溶剂质量体积比为1： 5200， 糊状无定型透明质酸分子链上羟基与马来酸 酐的酸酐基摩尔比为1： 0.120， 室温下搅拌均匀， 在2580条件下反应， 反应时间为12 48小时， 反应结束后， 在糊状无定型透明质酸、 马来酸酐、 非质子溶剂的混合溶液中加入 1mol/L的NaHCO3溶液， 调整混合溶液的pH至7-8， 将混合溶液进行透析， 透析时间为2天， 形 成马来酰化透明质酸溶液， 将马来酰化透明质酸溶。
17、液在温度为-50、 压强为120Pa条件 下， 冷冻干燥2472小时， 得到摩尔取代度为0.30.8的马来酰化透明质酸， 所述非质子溶 剂为二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺或二甲基亚砜中的一种。 0017 在非质子溶剂中， 透明质酸与马来酸酐之间的反应属于固液体系反应。 经步骤a处 理过的透明质酸此时处于无定型态， 分子链内、 分子链间充斥着非质子溶剂， 当马来酸酐加 入后， 马来酸酐分子会在非质子溶剂的帮助下， 迅速扩散至透明质酸的分子链上羟基基团 处， 大大提高其碰撞几率， 因而反应程度能大大提高。 通过酰化反应， 透明质酸分子链上引 入了光活性基团烯酰基， 可以使得水溶性的马来酰化透明质酸在紫。
18、外光的照射下能发生光 交联反应， 得到交联的凝胶。 步骤b中， 通过控制透明质酸的羟基与马来酸酐的酸酐基的摩 尔比以及反应条件， 来实现透明质酸的羟基上定位取代， 且实现马来酰化基团的取代度在 0.30.8范围内， 保证马来酰化透明质酸具有高的双键含量， 一方面保证下一步在紫外光 照下具有高的交联速率， 能迅速凝胶， 另外一方面保证下一步在紫外光照下具有高的交联 密度， 形成的凝胶强度好。 因此， 选择合适的摩尔比为： 1： 0.120； 选择合适的反应条件为： 温度2580， 反应时间1248小时。 这里的非质子溶剂是该酰化反应的促进剂和良溶剂， 可促进该反应的进行以及反应产物的溶解。 00。
19、18 c. 透明质酸生物粘合剂的制备 将由步骤 b得到的马来酰化透明质酸与紫外光引发剂、 磷酸盐缓冲溶液按照质量百分 比分别为： 马来酰化透明质酸 18% 光引发剂 0.050.1% 磷酸盐缓冲溶液 91.998.95% 的比例， 室温下混合均匀， 得到粘度为5000500000cps的透明质酸生物粘合剂， 所述 光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮或1-羟基环己基苯基甲酮或2,2-二 甲氧基-苯基苯乙酮中的一种， 所述磷酸盐缓冲溶液为pH为7.07.4的Na2HPO4-NaH2PO4缓 说 明 书 3/4 页 5 CN 105770983 A 5 冲溶液或K2HPO4-KH。
20、2PO4缓冲溶液中的一种。 0019 本专利中制备的生物粘合剂， 是粘度为5000500000cps的溶液， 溶液粘度过高， 流动性较差， 不便于挤出使用； 溶液粘度过低， 塑型困难， 不便于在伤口处集中固化。 该生物 粘合剂在波长为320-480 nm、 光强为520 mW/cm2紫外光下照射560s， 可迅速由液态形 成凝胶态。 凝胶粘结强度达到1.0MPa以上， 压缩强度达到0.8MPa以上， 且富有弹性。 该凝胶 能完全降解吸收， 当其用于封闭伤口时， 无需去除， 避免给伤口造成二次损伤。 具体实施例 0020 实施例1 称取透明质酸5g， 加入到50mL去离子水中， 加入5mL二甲基。
21、甲酰胺， 室温下搅拌1小时， 将溶液置于-10、 压强为50Pa条件下， 干燥24小时， 得到糊状无定型透明质酸。 称取糊状无 定型透明质酸4g、 马来酸酐0.41g加入到20mL二甲基甲酰胺中， 室温下搅拌均匀， 在25条 件下反应12小时， 反应结束后， 加入1mol/L的NaHCO3溶液， 调整混合溶液的pH至7-8， 将混合 溶液进行透析， 透析时间为2天， 将透析液在温度为-50、 压强为1Pa条件下， 冷冻干燥24小 时， 得到摩尔取代度为0.3的马来酰化透明质酸。 0021 称取马来酰化透明质酸1g、 2-羟基-2-甲基-1-对羟乙基醚基苯基丙酮0.05g， 加入 到98.95g。
22、 pH为7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液中， 室温下混合均匀， 得到粘度为5000cps的 透明质酸生物粘合剂。 0022 实施例2 称取透明质酸5g， 加入到1000mL去离子水中， 加入20mL二甲基乙酰胺， 室温下搅拌24小 时， 将溶液置于-50、 压强为200Pa条件下， 干燥72小时， 得到糊状无定型透明质酸。 称取糊 状无定型透明质酸4g、 马来酸酐82.79g加入到800mL二甲基乙酰胺中， 室温下搅拌均匀， 在 80条件下反应48小时， 反应结束后， 加入1mol/L的NaHCO3溶液， 调整混合溶液的pH至7-8， 将混合溶液进行透析， 透析时间为2天， 将透。
23、析液在温度为-50、 压强为20Pa条件下， 冷冻 干燥72小时， 得到摩尔取代度为0.8的马来酰化透明质酸。 0023 称取马来酰化透明质酸4g、 1-羟基环己基苯基甲酮0.05g， 加入到45.95g pH为7.4 的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中， 室温下混合均匀， 得到粘度为500000cps的透明质酸生物粘合 剂。 0024 实施例3 称取透明质酸5g， 加入到500mL去离子水中， 加入20mL二甲基亚砜， 室温下搅拌12小时， 将溶液置于-25、 压强为100Pa条件下， 干燥48小时， 得到糊状无定型透明质酸。 称取糊状 无定型透明质酸4g、 马来酸酐41.40g加入到4。
24、00mL二甲基亚砜中， 室温下搅拌均匀， 在50 条件下反应24小时， 反应结束后， 加入1mol/L的NaHCO3溶液， 调整混合溶液的pH至7-8， 将混 合溶液进行透析， 透析时间为2天， 将透析液在温度为-50、 压强为10Pa条件下， 冷冻干燥 48小时， 得到摩尔取代度为0.5的马来酰化透明质酸。 0025 称取马来酰化透明质酸4g、 2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮0.07g， 加入到95.93g pH为 7.2的K2HPO4-KH2PO4缓冲溶液中， 室温下混合均匀， 得到粘度为100000cps的透明质酸生物 粘合剂。 说 明 书 4/4 页 6 CN 105770983 A 6 。