一种天然冷鲜肉涂膜保鲜剂及应用 【技术领域】
本发明属于食品加工技术领域， 具体涉及一种一种天然冷鲜肉涂膜保鲜剂的制备及应用。 背景技术 近年来人民生活水平大幅度提高， 迫切要求食用干净卫生、 营养价值高的冷鲜肉。 冷鲜肉是今后生鲜肉消费的主流， 如何延长其保质期是目前急待解决的问题。冷鲜肉富含 营养物质， 且水分活度较高， 在通常的加工、 运输、 贮藏和消费过程中， 很容易受到微生物的 污染及其他环境因素的影响， 使其发生腐败变质。 冷鲜肉从开始生产到今天在欧美、 日本等 国的普及和在发展中国家的迅速发展， 其货架贮存期始终是生产流通过程关注的中心问题 ( 胡燕飞， 王长海， 2005)。冷鲜肉货架期长短主要取决于原料肉的初始菌数和保鲜处理方 式 ( 卢智等， 2004 ； 李雪梅等， 2005)， 降低冷鲜肉初始菌数和抑制残留微生物的生长繁殖是 延长冷鲜肉保质期的关键问题。目前， 国内外普遍采用的冷鲜肉保鲜方法， 诸如气调包装、 微波处理、 辐照处理、 高压处理等方法取得了良好效果， 防腐保鲜剂的应用也有较多报道。 近年来， 研究者将可食性涂膜应用于冷鲜肉的保鲜， 其中采用单一或复合保鲜液如壳聚糖、 Nisin 喷洒或浸渍处理冷鲜肉研究报道最多 ( 段静芸等， 2001 ； 孙向军等， 2002 ； 蒋建平等， 2005)。添加保鲜剂具有效果好、 操作简便、 成本低等优点， 成为在实际生产中常使用的方 法。 但使用化学保鲜剂超过一定的数量， 会对人体的健康产生一些不利的影响， 因此开发天 然防腐保鲜剂成为今后研究的热点及趋势。
多甲氧基黄酮是柑橘类水果的特征成分， 由于其具有很好的生物活性而备受国内 外关注。目前我国柑橘种植面积与产量已占世界第一位， 锦橙是我国最重要的加工用甜橙 品种， 其果皮中含有丰富的多甲氧基黄酮， 加工产生的大量皮渣未得到很好的利用， 造成了 资源的极大浪费 ( 单杨， 2008)。因此， 从柑桔皮渣中分离、 提取各种功能性成份， 利用其特 有的生理功能开发新食品添加剂或者药品， 对我国柑桔类资源深度开发利用具有重要的经 济价值和广阔的市场前景。据研究报道， 黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态 ( 苷元、 单糖苷、 双糖苷或三糖苷 ) 不同而有很大差异。一般游离苷元难溶或不溶于水， 易溶于甲 醇、 乙醇、 乙酸乙酯、 乙醚等有机溶剂及稀碱水溶液中， 其中黄酮、 黄酮醇、 查耳酮难溶于水， 而二氢黄酮及二氢黄酮醇等， 较易溶于水。 黄酮苷一般易溶于水、 甲醇和乙醇等强极性溶剂 中。糖链越长， 则水溶解度越大。因此， 采用水提法不能使柑橘中黄酮类化合物有效浸出， 而用乙醇则可大大提高提取率。由于甜橙皮中黄酮多以极性较大的糖苷形式存在， 目前国 内外广泛采用有较大极性的有机溶剂进行浸提 (Li et al.， 2006a)， 文献报道有热回流法 ( 赵雪梅等， 2003 & 2004)、 微波辅助萃取法 ( 张熊禄， 2005 ； 张海德等， 2003)、 超声波辅助 萃取法 ( 王万能等， 2006 ； 蒋志国， 2006) 等， 溶剂主要为甲醇、 乙醇等。
酶解法提取是在传统的溶剂提取方法的基础上， 根据植物细胞壁的构成， 利用酶 解反应具有高度专一等特点， 选择相应的酶将细胞壁组成成分水解或降解， 破坏细胞壁结 构， 使有效成分充分暴露出来， 溶解或混悬于提取溶剂中， 从而达到提取细胞内有效成分的
目的。由于有效成分提取过程中的天然屏障——细胞壁被破坏， 因而酶解法有利于提高有 效成分的浸出率， 成为近年来现代提取方法的研究热点 (Toebes et al.， 2005 ； Chung et al.， 2005)。已有报道采用酶解法提取柑橘皮中酚类物质， 以酶的种类、 提取温度及酶液浓 度等为衡量指标， 研究发现酶解法较水提法效率更高， 其实质为较低温度下酶可通过降解 细胞壁多糖而达到较好的提取效果 (Li et al.， 2006b)。
本专利采用纤维素酶对锦橙皮进行酶解处理， 然后以乙醇为溶媒浸提， 目的是探 讨锦橙皮中黄酮类物质提取的最佳工艺。 目前尚未见有关多甲氧基黄酮对冷却肉保鲜应用 研究的报道， 故本专利以冷却猪肉为试材， 将多甲氧基黄酮制成保鲜剂溶液， 对鲜猪肉进行 涂膜处理， 并采用 PE( 聚乙烯 ) 有氧包装形式， 以色泽、 pH 值、 挥发性盐基氮值 (TVB-N 值 )、 细菌总数和假单胞菌数的变化为指标， 评价多甲氧基黄酮保鲜剂对冷却肉的保鲜效果， 为 多甲氧基黄酮在食品保藏中的应用提供依据。 发明内容
本发明的目的在于提供一种天然冷鲜肉涂膜保鲜剂， 以提高冷鲜肉的新鲜度， 延 长冷鲜肉的货架期。 本发明的要点是从柑橘果皮即橙皮果皮中分离提取一种适用于冷鲜肉 保鲜的多甲氧基黄酮类化合物， 利用该保鲜剂提高冷鲜肉细胞膜通透性， 抑制微生物的呼 吸作用， 从而抑制冷鲜肉中的腐败菌的生长和繁殖。
本发明通过下列技术方案实现 ：
一种天然冷鲜肉涂膜保鲜剂， 各组分的配比如下所示 ：
以配制 1000ml 保鲜剂计 ： 多甲氧基黄酮提取物粉末 5g ； 吐温 10mL ； 900mL95％食 用酒精 ； 将吐温加入食用酒精中， 使溶液中的多甲氧基黄酮终浓度为 5.0mg/mL。所述的天 然冷鲜肉涂膜保鲜剂是通过如下步骤制备得到的 ： 1) 将橙皮 ( 例如甜橙品种锦橙， 但不限于此 ) 于 40℃下烘干至恒重， 粉碎后过 40 目筛， 得到橙皮粉末 ；
2) 按质量体积比为 1 ∶ 20， 将 100g 橙皮粉末置于 80％浓度的乙醇溶液中， 再向所 述的乙醇溶液中加入 5％质量分数的纤维素酶 ( 分析纯， 购自上海东风生化技术有限公司 产品 )， 调 pH 至 4， 用 60℃水浴浸提， 酶解时间为 2h， 得到黄酮乙醇提取液 ；
3) 将黄酮乙醇提取液浓缩去醇， 按质量体积比为 1 ∶ 30 加入乙醚萃取 3 次， 使有 效成分全部溶出， 合并三次醚层 ；
4) 用 0.4％浓度的 NaOH 弱碱溶液洗涤所述的醚层， 至水相部分无色为止， 蒸发去 除乙醚 ；
5) 将步骤 4) 的提取物放入冷冻干燥机 ( 德国产 christ 冷冻干燥机， 型号 BETR 2-8LD plus， 按照产品说明书操作 ) 中， 干燥时间为 28-32h， 得多甲氧基黄酮粗提物 ( 约 564mg) ；
6) 将 多 甲 氧 基 黄 酮 粗 提 物 复 溶 于 甲 醇 溶 液 中， 过 Sephadex LH-20 凝 胶 柱 (2.5cm×30cm)， 采用甲醇 - 水梯度洗脱， 用紫外检测仪于 340nm 检测， 收集最大吸收峰的产 物， 浓缩冷冻干燥得纯度较高的多甲氧基黄酮提取物， 将所得的多甲氧基黄酮提取物用高 效液相色谱仪 (HPLC) 进行定性定量分析， 并采用 LC-MS 分析方法对其结构进行鉴定。
7) 将步骤 (6) 所得的多甲氧基黄酮提取物用无水乙醇复溶， 按质量比为 1 ∶ 7 加
活性炭脱色， 浓缩， 冷冻干燥得多甲氧基黄酮提取物粉末 ；
8) 将步骤 7) 所得的多甲氧基黄酮提取物粉末 5g， 用加有 10mL 吐温的 900mL 的 95％浓度的食用酒精溶解， 使溶液中的多甲氧基黄酮提取物的终浓度为 5.0mg/mL， 即为天 然冷鲜肉涂膜保鲜剂。
本发明制备的天然冷鲜肉涂膜保鲜剂在冷鲜肉保鲜中的应用方法是， 将冷鲜肉切 成条状或块状， 按照肉重 10g 涂抹 10mL 的量将所述的保鲜剂涂抹在肉块或肉条的表面， 晾 干后用聚乙烯膜包装， 置 4℃ ±1℃的冷藏条件下贮藏， 保质期可达到 8 天。
本发明的与现有冷鲜肉保鲜剂相比具有以下优点 ：
1、 本发明充分利用柑橘下脚料果皮的提取物作为天然保鲜剂， 提高了橙皮的利用 价值， 节约了资源。
2、 本发明的保鲜剂具有广谱抑菌活性， 延长了冷鲜肉的保质期和货架期。
3、 本发明的保鲜剂对冷鲜肉质量和感官无不良影响。 附图说明
图1： 是本发明的实施例中酶液浓度对橙皮中总黄酮得率的影响分析。 图2： 是本发明的实施例中酶解温度对橙皮中总黄酮得率的影响分析。 图3： 是本发明的实施例中酶解时间对橙皮中总黄酮得率的影响分析。 图4： 是本发明的实施例中 pH 值对橙皮中总黄酮得率的影响分析。 图5： 是本发明的实施例中料液比对橙皮中总黄酮得率的影响分析。 图6： 是本发明的实施例中乙醇浓度对橙皮中总黄酮得率的影响分析。 图7： 是本发明的实施例中多甲氧基黄酮提取物的 HPLC 分析。 图8： 是本发明的实施例中多甲氧基黄酮的化学结构分析。 图9： 是本发明的实施例中多甲氧基黄酮提取物的正离子检出模式下 ESI-MS 总离 图 10 ： 是本发明的实施例中本发明的保鲜剂对冷却肉亮度的影响分析。 图 11 ： 是本发明的实施例中本发明的保鲜剂对冷却肉红度的影响分析。 图 12 ： 是本发明的实施例中本发明的保鲜剂对冷却肉 pH 值的影响分析。 图 13 ： 是本发明的实施例中本发明的保鲜剂对冷却肉中挥发性盐基氮的影响分 图 14 ： 是本发明的实施例中本发明的保鲜剂对冷却肉中细菌总数的影响分析。 图 15 ： 是本发明的实施例中本发明的天然保鲜剂对冷却肉中假单胞菌的影响分子流图。
析。
析。 具体实施方式
实施例 1( 基本制备实施例 )
本实施例的柑橘品种为甜橙品种 “锦橙” ， 该品种是柑橘类果品中的一个甜橙品 种， 该品种原产于四川江津 ( 现属重庆市江津区 )。六十年代引进湖北， 为湖北的一个主栽 柑橘品种。本实施例的锦橙果皮收集于湖北省松滋市洈水柑橘场， 将收集得到的锦橙的果 皮于 -18℃下冷冻保藏。试验方法如下 ：
1) 将橙皮 ( 甜橙品种 ： 锦橙， 但不限于此品种 ) 于 40℃下烘干至恒重， 粉碎后过 40 目筛， 得到橙皮粉末 ；
2) 按质量体积比为 1 ∶ 20， 将 100g 橙皮粉末置于 80％浓度的乙醇溶液中， 再向所 述的乙醇溶液中加入 5％质量份的纤维素酶 ( 分析纯， 购自上海东风生化技术有限公司产 品 )， 调 pH 至 4， 用 60℃水浴浸提， 酶解时间为 2h， 得到黄酮乙醇提取液 ；
3) 将黄酮乙醇提取液浓缩去醇， 按质量体积比为 1 ∶ 30 加入乙醚萃取 3 次， 使有 效成分全部溶出， 合并三次醚层 ；
4) 用 0.4％浓度的 NaOH 弱碱溶液洗涤所述的醚层， 至水相部分无色为止， 蒸发去 除乙醚 ；
5) 将步骤 4) 的提取物放入冷冻干燥机中， 干燥时间为 28-32h， 得多甲氧基黄酮粗 提物 ；
6) 将多甲氧基黄酮粗提物复溶于甲醇溶液中， 过 2.5cm×30cm 的 Sephadex LH-20 凝胶柱， 采用甲醇 - 水梯度洗脱， 用紫外检测仪 (HID-5 电脑紫外检测仪， 南京大学产品， 按 说明书的方法操作 ) 于 340nm 处检测， 收集最大吸收峰， 浓缩冷冻干燥得多甲氧基黄酮提取 物；
7) 将步骤 (6) 所得的多甲氧基黄酮提取物用无水乙醇复溶， 按质量比为 1 ∶ 7 加 活性炭脱色， 浓缩， 冷冻干燥得多甲氧基黄酮提取物粉末 ；
8) 将步骤 7) 所得的多甲氧基黄酮提取物粉末 5g， 用加有 10mL 吐温的 900mL 的 95％浓度的食用酒精溶解， 使溶液中的多甲氧基黄酮提取物的终浓度为 5.0mg/mL， 即为天 然冷鲜肉涂膜保鲜剂。
实施例 2 ： ( 优选方法实施例 )
本实施例的材料来源同实施例 1。实验方法参照按照实施例 1 的基本步骤。申请 人在试验比较实施例的酶解提取过程中， 分别考察了酶用量、 反应的 pH 值、 酶解温度、 酶解 时间以及乙醇浓度和料液比对酶解效果的影响， 并对酶解条件进行了优化， 以确定酶解的 最佳工艺条件。
(1) 纤维素酶酶液浓度对总黄酮浸出率的影响
本实施例中的纤维素酶为分析纯， 购自上海东风生化技术有限公司产品。本实 施例的纤维素酶的酶液浓度梯度分别设定为 2 ％、 3 ％、 4 ％、 5 ％、 6 ％， 料液比 ( 以质量体 积比计 ) 为 1 ∶ 10， 乙醇浓度为 80％， pH 值为 5， 水浴温度为 50℃， 水浴时间为 3h。测定 的提取液中总黄酮浸出率如图 1 所示。当纤维素酶浓度为 4 ％时总黄酮浸出率最高， 达 2.23±0.04％， 继续增大纤维素酶的浓度， 总黄酮浸出率则有所下降。
(2) 纤维素酶酶解温度对橙皮中总黄酮浸出率的影响
本实施例中设置了 30℃、 40℃、 50℃、 60℃、 70℃五个提取温度水平， 纤维素酶的酶 液浓度为 4％， 其余条件不变， 考察了纤维素酶酶解温度对总黄酮浸出率的影响， 试验结果 如图 2 所示。 由图 2 可知， 提取温度为 50℃以下橙皮中的总黄酮浸出率随温度升高而增大， 当温度达 50℃时橙皮中的总黄酮浸出率最大。
(3) 纤维素酶酶解时间对橙皮中总黄酮浸出率的影响
设计纤维素酶的酶液浓度为 4％， 酶解温度为 50℃， 其他条件不变。纤维素酶解时间对橙皮中总黄酮浸出率的结果如图 3 所示。随着酶解时间的增加， 橙皮中的总黄酮提 取率逐渐提高， 至 2.5h 时总黄酮浸出率最大， 继续延长酶解时间黄酮提取率浸出率反而下 降， 因此纤维素酶的酶解时间以 2.5h 为宜。
(4)pH 值对橙皮中总黄酮浸出率的影响
鉴于纤维素酶的活性中心为偏酸性条件， 故考察了当酶液浓度为 4 ％， 酶解温度 50℃， 酶解时间 2.5h， 其他条件不变时， 比较了不同 pH 值对从橙皮中总黄酮浸提的影响。 结 果如图 4 所示， 在酸性环境中纤维素酶活性较高， 这是由于酶活力受 pH 影响较大， 当 pH 为 4 时有利于复合酶发挥最大活力， 破坏细胞壁， 降低传质阻力， 从而有利于锦橙皮中总黄酮的 提取 ； 过高或过低都不利于酶解作用， 故而浸提效率较低。
(5) 料液比对橙皮中总黄酮浸出率的影响
实施例分别以 1 ∶ 5、 1 ∶ 10、 1 ∶ 15、 1 ∶ 20、 1 ∶ 25 料 ( 橙皮 ) 液比加入乙醇， 纤维素酶的酶液浓度为 4％， 酶解温度 50℃， 酶解时间 2.5h， 溶液 pH 值为 4 时， 考察了不同 料液比对浸提宗黄酮的影响。由图 5 可以看出， 当料液质量体积比为 1 ∶ 20 时总黄酮浸出 率达到最大， 料液比为 1 ∶ 25 时总黄酮浸出率与 1 ∶ 20 时浸出率差异不大。考虑到经济 成本等原因， 建议料液比选用 1 ∶ 20 即可。 (6) 乙醇浓度橙皮中总黄酮浸出率的影响
设计纤维素酶的酶液浓度定为 4％， 乙醇浓度为变量， 酶解温度定为 50℃， 酶解时 间定为 2.5h， 溶液 pH 值定为 4， 料液比定为 1 ∶ 20 时考察不同乙醇浓度对橙皮中总黄酮浸 出率的影响， 试验效果如图 6 所示。当乙醇浓度为 80％时， 橙皮中总黄酮浸出率最高， 继续 增加浓度浸出率反而下降， 这是由于一些弱极性成分溶出量增加， 减缓了橙皮黄酮向主体 溶剂的扩散， 从而导致橙皮黄酮提取得率的降低。因此选用 80％乙醇提取效果最佳。
(7) 纤维素酶酶解法的正交实验
根据单因素实验结果， 以纤维素酶为酶解的微生物 ( 本实施例的纤维素酶为分析 纯， 购自上海东风生化技术有限公司产品 )， 选用酶液浓度、 酶解温度、 酶解时间、 反应的 pH 值为影响因素， 设计了 4 因素 3 水平的正交实验， 见表 1， 试验结果及数据分析见表 2。由表 2 可知， 四因素的最佳组合为 A2B3C1D2， 即当酶液浓度 5％、 酶解温度 60℃、 酶解时间 2h、 pH 值 4 时， 总黄酮浸出率最高。影响酶解效果的主次因素依次 B ＞ D ＞ A ＞ C， 即酶解温度对 酶解效果的影响最为显著， 其次依次为 pH 值、 加酶量、 酶解时间。通过优化提取工艺后， 甜 橙皮中总黄酮浸出率达 2.67±0.06％。
表 1 纤维素酶酶解条件的 L9(34) 正交设计表
表 2 正交实验结果a 表中数据为均值 ±SD.
实施例 3 ： 锦橙皮中多甲氧基黄酮提取物的分离鉴定
本实施例的多甲氧基黄酮提取物的制备参照实施例 1 的方法获得。
高效液相色谱 (HPLC) 分析方法 ：
取 1mg 本发明制备的多甲氧基黄酮提取物粉末溶解于 10mL 甲醇中， 过 0.45μm 滤 膜后， 用 WatersHPLC 及二极管阵列检测器 (PDA) 定量分析。 色谱条件 ： 色谱柱 Hypersil ODS C18 柱 (250mm×4.6mm， 依利特 ) ； 检测波长 ： 330nm ； 流动相 ： 1.5％冰乙酸水溶液 - 乙腈， 以 50％乙腈水溶液洗脱 25min ； 流速 ： 0.6mL/min ； 进样量 ： 20μL ； 柱温 ： 30℃。 紫外扫描范围 ： 200-400nm。上样前色谱柱需平衡 15min。川陈皮素和桔皮素含量采用外标法确定。其余组 分含量通过添加黄芪素 ( 最大吸收峰为 330nm) 为内标作为参照半定量。
图 7 为 330nm 下本发明制备的多甲氧基黄酮提取物的 HPLC 分析图， 图中显示本发 明制备的多甲氧基黄酮提取物中共含有 7 种组分， 主要成分为 1、 3、 4、 5、 7 峰。其中保留时 间为 11.454min 的 3# 峰峰值最大， 相对含量达 32.7％， 其次为保留时间为 12.103min 的 4# 峰， 相对含量约为 20.1％， 保留时间为 9.574min 的 1# 峰、 14.803min 的 7# 峰和 12.859min 的 5# 峰， 其相对含量分别为 17.6％、 15.6％和 8.3％。
锦橙皮中多甲氧基黄酮的结构鉴定 ：
样品用 Agilent HPLC-MS/ESI 系统分析。考虑到兼容性， 采用 ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱 (2.1mm×150mm I.D.， Agilent)， 流动相为甲醇 (A)-1.5％冰乙酸水溶液 (B)， 洗 脱条件改变为 65min 内 B 相由 35-71％， 65-70min 内 B 相由 71％到 35％。再次进样之前用 35％ B 平衡 10min。流速 ： 0.25mL/min， 进样量 ： 10μL。
质谱条件 ： ESI 离子源， 喷射电压 ： 4500V， 喷射压力 ： 30psi， 干燥气流速 ： 8L/min， 干燥气温度 ： 250℃， 扫描质量范围 ： 100-1000m/z， 正离子模式。
表 3 和图 8 显示 LC-MS 分析得到的多甲氧基黄酮单一组分的结构， 并通过与已报 道文献比对其光谱数据来鉴定。 数据与文献非常吻合， 文献数据来源于对柑橘精油、 果汁和
果皮的分析 (Wang et al.， 2007 ； Zhou et， al.， 2007 ； Lu et al.， 2006 ； Mata Bilbao， 2007 ； Raman et al.， 2005 ； Dugo et al.， 2000)。图 9 为多甲氧基黄酮在正离子检出模式下的总 离子流图， 考虑到兼容性， 将流动相进行了调整， 出峰时间发生了延迟， 但出峰顺序未发生 改变。表 3 分析归纳了多甲氧基黄酮各个组分的分子量和结构分析。
表 3 多甲氧基黄酮单一组分的分子量和结构分析
注： “～” 表示肩峰
实施例 4 ： ( 本发明的保鲜剂在猪冷鲜肉中的应用举例 )
猪冷鲜肉的来源 ： 本实施例及其他的实施例所用的猪冷鲜肉菌购自武汉市洪山区 珞狮路中百仓储超级市场。
微生物培养的试剂来源 ： 假单胞分离琼脂 ( 分析纯， 购自北京奥博星生物技术有 限责任公司 ) ； 营养琼脂 ( 分析纯， 购自青岛海博生物技术有限公司 )。
多甲氧基黄酮提取物粉末的制备和保鲜剂的配制参照实施例 1 的方法。
冷却肉的处理 ： 选猪背最长肌的冷却肉， 首先在猪肉表面均匀喷洒 75％酒精进行 表面杀菌， 切成 10g 左右的正方形小肉块， 随机分成两组， 分别放在已消毒的聚酯托盘内。 处理组用无菌毛刷在肉表面均匀涂抹 10mL 多甲氧基黄酮溶液 ； 对照组用无菌毛刷均匀涂 抹 10mL 含 1％吐温的 95％ ( 以百分浓度计 ) 食用酒精在肉表面， 两组处理均在无菌室常温 放置并晾干表面， 用聚乙烯保鲜膜包装， 立即放入 4±1℃的冰箱中存放， 分别于第 0、 2、 4、 6 和 8 天测定理化及微生物指标。
理化指标评价 ：
(1) 色泽的测定 (L* 值、 a* 值 ) ： 取肉样于比色皿中用色度仪 ( 购自美国 HunterLab
公司产品 ) 测定。从图 10-11 中可以看出， 在贮存过程中处理组与对照组冷却肉的色泽变 化趋势基本一致， 冷却肉的亮度值与红度值均呈现先升高再降低变化趋势。 但总体来说， 对 照组比处理组冷却肉的亮度值高而红度值低， 说明涂抹本发明的保鲜剂可降低冷却肉亮度 而提高红度。
(2)pH 值测定 ： 采用 pH 计 (410A 型 PH 计， 美国 Thermo orion 公司粗产品 )， 按照 智能规划人民共和国国家标准 GB/T9695.5-2008《肉与肉制品 pH 测定》 ， 中国标准出版社， 2009 版介绍的方法进行检测。将 10g 肉样绞碎后加入 40mL 蒸馏水， 过滤后的滤液用上述 pH 计测定其 pH 值。从图 12 可以看出， 在贮存过程中对照组与处理组冷却肉的 pH 值变化趋 势基本一致， 对照的冷却肉的 pH 值逐渐升高， 但处理组的比对照组的冷却肉 pH 值低。说明 本发明的保鲜剂在冷却肉贮存过程中发挥了抑菌活性， 有效降低了微生物生长繁殖， 降低 了微生物对蛋白质的分解速率， 从而达到一定的保鲜效果。
(3) 挥 发 性 盐 基 氮 (TVB-N) 检 测 ： 按 照 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB/ T5009.44-2003 《肉与肉制品卫生标准的分析方法》 ， 中国标准出版社， 2003 版介绍的方法进 行进行， 采用半微量定氮法。具体步骤是 ： 取 10g 肉样于 100mL 蒸馏水， 振摇 30min 后过滤， 进行蒸馏滴定。试样中挥发性盐基氮的含量按下式进行计算 ：
式中 ：
X——试样中 TVB-N 的含量， 单位为毫克每百克 (mg/100g) ；
V1——测定用样液消耗盐酸标准溶液体积， 单位为毫升 (mL) ；
V2——试剂空白消耗盐酸标准溶液体积， 单位为毫升 (mL) ；
c——盐酸标准溶液的实际浓度， 单位为摩尔每升 (mol/L) ；
14——与 1.00mL 盐酸标准滴定溶液 [c(HCL) ＝ 1.000mol/L] 相当的氮的质量， 单 位为毫克 (mg) ；
m——试样质量， 单位为克 (g)。
从图 13 中可以看出， 在贮藏的第 6 天时 TVB-N 值为 13.2mg/100g， 达到国家一级鲜 肉卫生标准， 第 8 天时为 16.6mg/100g， 达到国家二级鲜肉卫生标准， 而对照组在第 6 天时 TVB-N 值已大于 20.0mg/100g， 已接近腐败变质。
2.4 微生物指标检测
采用平板倾注计数法 ( 参照 ： 牛天贵主编， 食品微生物学实验技术， 中国农业大学 出版社 ) 细菌总数检测使用营养琼脂培养基， 37℃培养 24h。 假单胞菌数检测采用假单胞分 离琼脂培养基， 27℃培养 48h。上述操作均在无菌环境中进行。
中华人民共和国国家标准 GB/T5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》 中明确规定一级鲜肉细菌总数≤ 106 个 /g ； 二级鲜肉 106 个 /g ＜细菌总数≤ 107 个 /g。腐 败肉细菌总数＞ 108 个 /g。由图 14-15 所示， 使用本发明天然保鲜剂涂膜处理的冷鲜肉在 0-4 天的细菌总数处于较低水平， 至第 4 天细菌总数对数值为 3.54， 第 4 天后增加迅速， 第6 天细菌总数为 4.93， 属于一级鲜肉， 在第 8d 时细菌总数对数值为 6.79， 属于二级鲜肉。而 对照组 0-4 天细菌总数增加很快， 第 4 天时细菌总数对数值已达到 6.00， 在第 8 天时细菌总 数对数值高达 8.48， 已完全腐败变质。假单胞菌与细菌总数变化趋势相似， 对照组 0-4 天
假单胞菌数增加很快， 而天然保鲜剂涂膜处理组假单胞菌数在 0-4 天处于较低水平。至第 4 天后假单胞菌数增加较快， 但与对照组相比， 处理组假单胞菌数明显处于较低水平。至第 6 天时对照组假单胞菌数对数值达到 4.48， 而处理组仅为 1.90。贮存第 8 天时对照组假单 胞菌数对数值达到 4.83， 而处理组为 2.85。表明本发明的天然保鲜剂能杀死或抑制冷鲜肉 腐败菌的生长和繁殖， 从而使细菌总数明显减少。
主要参考文献
1 单杨， 中国柑橘工业的现状、 发展趋势与对策， 中国食品学报， 2008， 8： 1-8 ；
2 段静芸等， 壳聚糖在冷却鲜猪肉保鲜中的应用研究， 食品工业科技， 2001， 22 ： 26-28 ；
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