新的蒽醌衍生物 技术领域 本发明涉及新的蒽醌衍生物， 其制备方法以及其作为抗感染药物， 特别是抗多重 抗药性病原体的抗感染药物， 和抗癌药物应用的方法。
背景技术 在 20 世纪 60 年代末和 20 世纪 70 年代初， 由于抗菌药物的使用非常成功， 人们 设想感染性疾病不会再构成任何风险。然而， 这被证明是一种误解， 而且， 四十年后微生物 正构成比以往任何时候更大的威胁。由于这些原因， 迫切需要新的抗菌药物。现今， 感染 性疾病在美国是构成死亡的第三常见原因， 在全球范围是构成死亡的第二常见的原因。无 效的抗菌药物是这些情况的原因， 而特定细菌和真菌对这些药物的抗药性使我们社会面临 严重的问题。根据美国的统计数据， 多数在医院发生的感染 ( 所谓的医院内感染 ) 是由少 数几种细菌引起的， 即由屎肠球菌、 金黄色葡萄球菌、 肺炎克雷伯菌、 鲍曼不动杆菌、 绿脓 杆菌、 和肠杆菌引起， 这些细菌， 基于其首字母， 被统称为 “ESKAPE”病原体 (Boucher 等，
“IDSA Report on Development Pipeline” ， CID 2009 ： 48， Infectious Disease Society of America， 2009-01-01)。 同时， 这指出这些抗药性病原体可逃避抗菌药物的效果的情况， 特别是在分子水平对抗生素的抗药性， 无非是微生物为了抵抗抗菌物质的生长抑制或杀菌 作用获得的能力。这意味着这些抗菌物质在临床上变得无效。抗甲氧西林金黄色葡萄球菌 ( 缩写为 MRSA ； 然而该缩写也用于 “多重抗药性金黄色葡萄球菌” 的更普遍意义 ) 意味着在 金黄色葡萄球菌的治疗中使用 β- 内酰胺无效， 而糖肽经常仍然有效果。因此， 测试新的抗 感染药物对多重抗药性菌株的作用是绝对必要的， 即使它们对抗对其敏感的菌种和菌株有 效， 这并不自动意味着其对多重抗药性细菌也有效， 就像抗革兰氏阳性菌的药物不是自动 的对革兰氏阴性菌有效， 反之亦然 ( 见 Boucher 等， 前述， 等 )。
除了对细菌和真菌的策略， 我们目前还缺乏对抗呼吸道病毒的有效策略。多数情 况下， 仅仅是治愈症状， 而没有对抗病毒本身。未来的解决方案主要在于活性药物的组合。
过去， 在内生真菌中发现多种抵抗微生物增殖的物质。 在许多情况下， 这些物质具 有非常好的抗细菌、 抗真菌、 和抗病毒活性并可以用于多种应用 (G.A.Strobel， Crit.Rev. Biotechnol.22， 315-333(2002))。由于该领域的研究主要在学术水平进行， 没有直接针对 新活性制剂的开发， 今天几乎没有适合的药物可在市场上买到。尤其过去忽视了对抵抗抗 药性微生物的药物的筛选， 以至于仅有少数抵抗抗药性微生物的物质已被测试。呼吸道病 毒的情况甚至更糟 ； 到目前为止， 几乎没有筛选出任何有效抵抗呼吸道病毒的物质。
在 1969， A.Stoessl， Can.J.Chem.47， 767(1969) 已 经 描 述 了 从 茄 链 格 孢 菌 (Alternaria solani) 中分离一种新的代谢色素， 茄链格孢菌是引起被称为马铃薯早疫病 的疾病的一种真菌。该色素被命名为 altersolanol A， 其结构被认定如下 ：
因 此， 这 种 蒽 醌 的 化 学 名 为 7- 甲 氧 基 -2- 甲 基 -(1R， 2S， 3R， 4S)-1， 2， 3， 4- 四 氢 -1， 2， 3， 4， 5- 五羟基 - 蒽 -9， 10- 二酮。
随后， 在更多的链格孢菌种 ( 如葱链格孢菌 ) 和某些其他真菌属中检测到该 色 素 及 其 多 种 异 构 体 和 衍 生 物 ( 见， 例 如 R.Suemitsu 等 .， Agric.Biol.Chem.45(10)， 2363-2364(1981))。多数异构体和衍生物对应于下面的化学通式 (1) 和 (2) 之一 ：
(1) (2)
其中， R1 到 R4 可以分别代表 H 或 OH， 其在化学式 (2) 中为 OH 的情况下， 导致了一 个手性碳原子， 其可以为 R 或 S 构型。
随后， 二聚体， 即二蒽醌， 作为代谢产物首先在链格孢菌属的另一个代表， 葱链 格孢菌中被发现， 其相比其他种， 能在洋葱中引起紫色斑病， 这是这些二聚体被命名为 alterporriols 的原因。这些二聚体， 例如， 对应于下面的化学式 (3) ：
其中， 不同替代的可能数目和芳香环的水化模式类似于 “单体” altersolanols 中 的。由于蒽醌核间化学键轴被限制的旋转自由度， 大量 alterporriol 衍生物以两个阻转异 构体的形式存在。
有关于被称为 altersolanols 和 alterporriols 的一些化合物抗特定微生物有 效的报道， 而其他的化合物被描述为没有任何抗感染效果。例如， Aly 等， Phytochemistry
69， 1716-1725(2009)， 测试了白粉寄生菌属中内生真菌的生物活性代谢物以及其抗感染作 用。在其他物质中， 他们发现 altersolanol J， alterporriols D 和 E( 阻转异构体 )， 以 及与 altersolanols 密切相关的化合物 ampelanol， 不显示任何抗细菌和真菌的活性， 而 altersolanol A 被证明在测试的物质中最有效。此外， 例如 Okamura 等， Phytochemistry 42(1)， 77-80(1996) 没有发现 tetrahydroaltersolanol B 任何抗革兰氏阳性菌和革兰 氏阴性菌绿脓杆菌的效果。Yagi 等， Phytochemis-try 34(4)， 1005-1009(1993) 报道了 altersolanols A、 B、 C、 和 E 的抗菌活性， 然而 altersolanols D、 E、 和 F 在同样的测试中被 证明完全无效。另一方面， 美国申请号 2007/258913 公开了阻转异构的 altersolanol D 和 E 是适合防止口腔生物膜形成的化合物， 尽管只是以非常一般的方式， 而没有列出任何关于 其有效性的具体数据。
因此， 不可能预测特定的 altersolanol 或 alterporriol 异构体或衍生物是否会 显示出抗感染效果， 更不可能预测抗哪个属或种的微生物。
一些年来， 抗癌药领域里也显现与抗感染药领域相似的趋势， 即对现有疗法的 抗药性不断增加。在这种情况下， 抗药性的发展主要是主要是由于完整的膜转运蛋白， 如 P- 糖蛋白的过度表达， 导致活性物质从癌细胞中流出， 以至于其不再有效。到此， 这 样的多重抗药性 (“多重抗药” ， MDR) 细胞已形成了抵抗多种结构和机制不同的化疗药 物 (chemotherapeutics) 的 抗 药 性 ( 见，例 如 E.L.Cooper， Evid.Based Complement. Alternat.Med.1 ， 215-217(2004) ； M.D ′ Incalci 等， J.Chemother.16(Suppl.4) ， 86-89(2004) ； Z.Shi 等， Cancer Res.67， 11012-11020(2007))。因此， 除了发展新的对抗病 原体的抗感染物质， 为了抑制抗药性的发展， 也需要发现和应用新的抗癌活性药物。
几十年来， 相比其他各种物质， 蒽醌已经被用作癌症治疗中有效的化疗药物。 结构 相似的活性药物阿霉素 ( 示例性示于下面 )、 柔红霉素、 去甲氧基柔红霉素、 表阿霉素可以 用于对抗多种类型的癌症， 是该组中熟知的药物。
阿霉素
除了其理想的治疗效果， 这样的活性药物也显示出超氧自由基形成的负面效果。 由于分子中醌基的自由基稳定效果， 蒽醌经常导致这样的自由基形成， 当这样的分子被用 于治疗目的时， 其相比其他种类， 其经常会引起心脏毒性。 醌基的治疗效果和自由基稳定效 果都受到取代基的显著影响。见， 例如， Debbab 等使用小鼠淋巴瘤细胞进行的研究 J.Nat. Prod.72(4)， 626-631(2009)。
推测蒽醌的毒性效果作用机制主要是由于分子插入 DNA 双螺旋， 这就阻止了 DNA 的复制和 DNA 向 RNA 的转录的正确进行。除了这种效果， 推测蒽醌抑制 II 型拓扑异构酶， 该酶与其他酶相比， 负责 DNA 的超螺旋形成， 有时还诱导凋亡。蒽醌或其他相似物 进行， 即插入， 分子是否可以成功的被引入双螺旋， 如上面提及的， 显著的依赖于取代基 的类型和位置。目前使用不同蒽醌衍生物的研究 ( 见， 例如， J.Zhang 等， Mar.Drugs 8， 1469-1481(2010)) 已显示了环取代基之间非常细微的差别可以决定分子的细胞毒性。
在此背景下， 本发明的目的在于鉴定、 分离和制备可用作药物组合物中的抗感染 制剂或抗癌制剂的新物质， 特别是显示有抵抗多重抗药性 (“多重抗药” MDR) 病原体和细胞 的活性的化合物。
在他们的研究工作过程中， 发明人能够鉴定多种物质 - 它们中的一些迄今还未发 表结构， 即新的化合物 - 其显示出抗微生物和呼吸道病毒， 特别是抵抗 MDR 病原体， 以及抵 抗癌细胞的良好活性。尽管平行的， 同时提交的申请号 A 843/09 的奥地利专利申请涉及 了已知结构的多种化合物， 然而其有效性迄今未知， 本发明涉及提供两种新化合物， 一种 altersolanol 和一种 alterporriol 衍生物。 发明内容
更具体的， 发明人已制备、 分离并描述了下列新化合物 ：根据化学式 (4) 的 (1R， 2S， 3S， 4R)-3- 乙酸基 -1， 2， 4， 5- 四羟基 -7- 甲氧基 -2- 甲 基 -1， 2， 3， 4- 四氢蒽 -9， 10- 二酮， 其最初被发明人命名为 “altersolanol M” ， 但现在被重 新命名为 “3-O- 乙酰基 altersolanol M” ( 因为根据国际通行的做法， 特征字母被用于指非 乙酰化的形式 ) ：
(4)
和 根 据 化 学 式 (5) 的 8-(4， 5， 6- 三 羟 基 -7- 甲 基 -2- 甲 氧 基 -9， 10- 二 氧 -9H， 10H-1- 蒽 基 )-(1S， 2S， 3R， 4S)-1， 2， 3， 4， 5- 五 羟 基 -7- 甲 氧 基 -2- 甲 基 -1， 2， 3， 4- 四氢 -9H， 10H- 蒽 -9， 10- 二酮， 以两种阻转异构体的形式存在， 其被发明人命名为 alterporriol I 和 J ：
由于在筛选试验中， 化合物 (4) 和 (5) 都显示出优良的抗菌， 抗病毒效果， 特别是 化合物 (4) 显示出优良的抗癌效果， 本发明的第二方面在于这两种新化合物作为抗感染， 优选抗革兰氏阳性和革兰氏阴性菌、 真菌、 和呼吸道病毒， 特别是作为抗多重抗药 (MDR) 病 原体的抗感染药， 以及这些药物作为抗癌药的用途。
这两种化合物优选用于抵抗抗甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)、 表皮葡萄球菌、 肺炎链球菌、 粪肠球菌或屎肠球菌、 大肠杆菌、 克雷伯菌、 绿脓杆菌、 曲霉菌的多重抗药菌 株， 以及抵抗来自人鼻病毒和呼吸道合胞病毒的组的呼吸道病毒， 这将由下面示例性的实 施方式详细证明。
更多乙酰化的 altersolanol M 衍生物， 即其他位置上有乙酰基的两种 3-O- 乙酰 基 altersolanol M 异构体， 如 4-O- 乙酰基 altersolanol M 和 5-O- 乙酰基 altersolanol M， 以及有多个乙酰基的衍生物如 3， 4- 二 -O- 乙酰基 - 和 3， 5- 二 -O- 乙酰基 altersolanol M， 也在预实验中测试其抗感染和细胞毒性作用， 部分也得到了优良的结果， 因此发明人进 一步的研究工作将集中于这些化合物的制备和研究。
本发明也涉及制备化学式 (4) 和 (5) 的化合物的方法， 所述方法主要包括在生长 条件下发酵微生物以产生所述化合物或其前体之一， 并从培养物中获得相应的化合物， 可 选是在破裂微生物细胞之后从培养物中获得相应的化合物以增加产量。 这样的发酵方法优 选使用纯的小球匍柄霉菌株， 因为发明人使用该种菌获得了最高的产量。 或可选， 任何其他 能产所述新化合物或其前体的菌株， 如链格孢菌， 也可用于发酵。如果发酵得到的是前体， 所述前体可以通过任何有机合成领域技术人员已知的方法被转化成想要的化学式 (4) 和 (5) 的新化合物， 可选在酶催化影响下进行方法的某些步骤， 以获得更高的对映选择性。
例如， 可以培养链格孢菌以从发酵液中获得 altersolanol A 或 altersolanol 家 族的其他成员， 这些可以通过乙酰化 C3 上的 OH 基 ( 可选使用传统保护基团保护其他 OH 基 ) 被转化为 3-O- 乙酰基 altersolanol M 或其一个立体异构体。其他合成途径主要有从 C3 或 C4 上将 OH 基连同相邻的氢原子一起切除， 即脱水， 以获得 C3 与 C4 间的双键和这些位置 上的两个前手性中心。随后， 可以酶促再水化该双键， 如果适当选择酶的立体特异性 ( 如水 合酶， 过氧酶 )， 这将得到想要的 altersolanol M。 altersolanol I 和 J 可以， 例如， 通过化 学 ( 再次， 例如， 酶促 ) 连接相应的蒽醌取代基到 altersolanol M 的位置 8 来获得， 其可选 在之前已被衍生化， 随后乙酰基被从位置 3 的 OH 基上水解除去。
适合于转化想要的化合物前体的合成步骤的酶， 某些情况下也可以从用于发酵的 微生物或另外的微生物中分离。在后一种情况下， 例如， 当一种微生物产想要的产物， 但仅 有少量或者是被污染的形式， 以至于从经济的角度看， 通过培养其他菌株 ( 或甚至其他种 或属 ) 获得产物的前体并使用酶促合成来将所述前体转化为目的化合物更好的时候， 其有 用。
最后本发明涉及通过依据下面 A 到 C 中任何一个合成途径通过化学合成来制备 3-O- 乙酰基 altersolanol M， 即本发明化合物 (4) 的方法。
A) 通过顺式二羟基化
从 (1R， 2R)-1， 2， 5- 三羟基 -7- 甲氧基 -2- 甲基 -1， 2- 二氢蒽 -9， 10- 二酮 (6) 开 始， 其可以以文献中已知的方式获得 (Krohn 等， Liebigs Ann.Chem.1988， 1033-1041)， 可以 通过下面的步骤获得 3-O- 乙酰基 altersolanol M ：
a) 在 C3 和 C4 处顺式二羟基化 (6)( 根据 Houben-Weyl， Handbuch derorganischen Chemie， vol.E21d，″ Stereoselektive Synthese″， 4581-4587 页 ) 以获得 (1R， 2S， 3R， 4R)-3- 乙酸基 -1， 2， 4， 5- 四羟基 -7- 甲氧基 -2- 甲基 -1， 2， 3， 4- 四氢蒽 -9， 10- 二酮 (7) ：
b) 将 (7) 转 化 为 环 硫 酸 盐 (8)( 依 据 Y.Gao 和 K.B.Sharpless， J.Am.Chem. Soc.110， 7538-7539(1988)) ：
c) 使 用 醋 酸 酸 解 环 硫 酸 盐 (8)( 依 据 H.-S.Buyn 等， Tetrahedron 56， 7051-7091(2000)) 以获得根据化学式 (4) 的 3-O- 乙酰基 altersolanol M ：相 比 Krohn 等 ( 在 前 ) 描 述 的 制 备 ( 除 了 其 他 的 以 外 )altersolanol A 和 altersolanol M 的方法， 本发明的方法不使用间氯过氧苯甲酸氧化化合物 (6)C3 和 C4 间的 双键来获得相应的环氧化物， 而该步骤不可避免的产生顺式和反式的环氧醇的非对映混合 物， 其显著降低想要的异构体的产量。通过在本发明步骤 a) 中应用顺式二羟基化， 可以选 择性获得想要的异构体， 随后其可以通过使用醋酸简单酸解来转化为目的化合物 3-O- 乙 酰基 altersolanol M。
B) 通过狄尔斯 - 阿德耳加成和环氧化物形成
从被保护的 5- 羟基 -7- 甲氧基 -1， 4- 萘醌 (9) 开始， 其可以以文献中已知的方式 获得 (Krohn 等， Liebigs Ann.Chem.1988， 1033-1041)， 可以通过下面的步骤获得 3-O- 乙酰 基 altersolanol M ：
a) 在萘醌 (9) 和甲基丁二烯 (10) 之间狄尔斯 - 阿德耳加成， 其中 R 独立的为相同 或不同的羟基保护基团， 以获得四氢蒽醌 (11) ：
b) 使用间氯过氧苯甲酸氧化 C2 和 C3 之间的双键 ( 依据 Krohn 等 ( 上述 ))， 进行 随后或在前的 Mitsunobu 反应以反转 (invert)C4 处的氧官能度 (oxygen functionality) 来获得环氧化物 (12) ：
c) 使用醋酸酸解环氧化物 (12)， 随后或同时切除保护基团 R， 以获得 3-O- 乙酰基 altersolanol M。
相比 Krohn 等描述的狄尔斯 - 阿德耳反应， 本发明的反应已使用具有两个氧官能 度， 即， 被保护的羟基， 的丁二烯 (10)， 其同时在 C1 和 C4 非对映选择整合入蒽醌 (11)， 由于 C1 和 C2 处的取代基对氧化有定向效果， 所述蒽醌 (11) 可通过单独的氧化步骤转化为环氧 化物 (12)。因此， 用于反转 C4 处氧官能度的光延 (Mitsunobu) 反应优选在氧化后进行。由 于从环氧化物氧相对侧 C3 处的醋酸亲核攻击明显占优， 随着后者的酸解也是立体选择的 进行。
C) 通过狄尔斯 - 阿德耳加成和顺式二羟基化
再次从被保护的 5- 羟基 -7- 甲氧基 -1， 4- 萘醌 (9) 开始， 可以通过下面的步骤获 得 3-O- 乙酰基 altersolanol M ：
a) 在萘醌 (9) 和甲基丁二烯 (10) 之间狄尔斯 - 阿德耳加成， 其中 R 独立的为相同 或不同的羟基保护基， 以获得四氢蒽醌 (11)， 如上面描述的方法 B) ：
b) 顺式二羟基化四氢蒽醌 (11)( 依据上述 Houben-Weyl)， 进行随后或在前的光延 反应以反转 C4 处的氧官能度来获得四氢蒽醌 (13) ：
c) 将 (13) 转变为环硫酸盐 (14)( 依据上述 Y.Gao 和 K.B.Sharpless) ：
d) 使用醋酸酸解环硫酸盐 (14)( 依据上述 H.-S.Buyn 等 )， 随后或同时切除保护 基团 R， 以获得 3-O- 乙酰基 altersolanol M。相比方法 B)， 四氢蒽醌 (11) 没有被氧化以获得环氧化物， 但被非对映选择氧化以 获得二羟基衍生物 (13)， 其， 如上面方法 A) 描述的， 可以被容易的转变为环硫酸盐并随后 转变为 3-O- 乙酰基 altersolanol M。
上面的二醇也可以被转变为其他环酯类， 如环状原酸酯， 来替代环硫酸盐， 其也被 纳入本发明方法的范围。
如 果 发 明 人 完 成 了 正 在 进 行 的 优 化 产 量 的 实 验， 化学合成肯定会成为制备 3-O- 乙酰基 altersolanol M， 以及 altersolanol I 和 J 选用的方法， 这是由于与发酵方法 相比， 这样获得的产品纯度更高分离性更好。发明人目前正在发展制备化学式 (5) 的化合 物的合成策略。
目前， 本发明的化合物 (4) 或 (5) 各自仍然优选通过提纯和随后的从培养物粗提 物中分离得到， 例如通过分级结晶或色谱方法， 更优选通过制备 HPLC， 其能同时得到最高的 产量和最高的纯度。 当然， 其他分离方法也可以考虑， 特别是在更大规模试验中， 如， 通过直 接分级结晶粗提物或通过吸附方法。然而， 本领域技术人员能够通过有限实验来决定每个 培养 ( 和 / 或合成或部分合成 ) 步骤的最适合的分离方法。 具体实施方式 下面， 参考具体示例性实施方式进一步详细描述本发明， 然而， 这不意味着以任何 方式限制本发明的范围。
本发明的新化合物通过培养小球匍柄霉和随后的提取获得。
分离微生物
使用新鲜、 健康的唇萼薄荷 ( 薄荷 ) 茎来分离内生真菌。使用 70％的乙醇消毒茎 的表面 1min， 随后使用无菌水冲洗去除乙醇。 为了区别内生真菌和任何剩余的附生真菌， 在 有机麦芽提取物琼脂上留下茎表面印记。 内部少量组织样品做无菌切片并压到含有一种抗 生素以抑制细菌生长的琼脂平板上。 分离培养基组成如下 ： 15g/l 麦芽提取物、 15g/l 琼脂、 和 0.2g/l 蒸馏水中的氯霉素， pH7.4-7.8。通过在麦芽提取物琼脂平板上重复接种培养获 得纯的真菌菌株。
真菌培养物通过 DNA 扩增和 IST 区域测序依据分子生物学方法鉴定为小球匍柄 霉。序列数据保存在 GenBank EU859960 访问号下。
培养
为培养小球匍柄霉， 每个含有 100g 米和 100ml 蒸馏水的 1 升锥形瓶被高压蒸汽灭 菌以使其含有膨胀的固体米培养基。 小部分含有纯真菌菌株的上述分离培养基在无菌条件 下被加到固体米培养基上， 并在室温 (20℃ ) 下培养所述真菌 40 天。
提取和分离
40 天后， 使用 300ml 乙酸乙酯 (EtOAc) 提取培养物两次。 EtOAc 提取通过使用水摇 晃进行提取。水相被蒸发至干， 残余物被加到使用 100％甲醇 (MeOH) 作为洗脱剂的 LH-20 层析柱上进行柱层析， 同时通过使用以 EtOAc/MeOH/H2O(77 ∶ 13 ∶ 10) 作为洗脱剂的硅胶 F245(Merck， Darm-stadt， 德国 ) 的薄层层析 (TLC) 方法检测。含有想要的化合物的馏分 被收集起来， 并加入使用 Eurosphere 100-10C18 柱 (300x 8mm， L x i.d.) 和线性水 - 甲 醇梯度的半制备 HPLC(Merck， Hitachi L-7100) 上。这样， 以纯的形式制得本发明的新化
合物， 即 (1R， 2S， 3S， 4R)-3- 乙酸基 -1， 2， 4， 5- 四羟基 -7- 甲氧基 -2- 甲基 -1， 2， 3， 4- 四 氢蒽 -9， 10- 二酮 (3-O- 乙酰基 altersolanol M) 和 8-(4， 5， 6- 三羟基 -7- 甲基 -2- 甲氧 基 -9， 10- 二氧 -9H， 10H-1- 蒽基 )-(1S， 2S， 3R， 4S)-1， 2， 3， 4， 5- 五羟基 -7- 甲氧基 -2- 甲 基 -1， 2， 3， 4- 四氢 -9H， 10H- 蒽 -9， 10- 二酮 ( 阻转异构体 alterporriol I 和 J)。
分析
Alterporriol I 和 J
基于 alterporriol I 和 J 的 HRESI MS 谱， 显然分子离子位于 m/z635， 1406[M+1]+， 结 果 是 经 验 式 C32H26O14 和 20 ％ 的 不 饱 和。1H- 和 13C-NMR 谱 以 及 ESI/MS 谱 (m/z 635， 9[M+1]+) 的数据与已知的相关蒽醌 alterporriol A 和 6-O- 甲基意大利鼠李蒽醌的相 似。两个蒽醌单位之间键的类型从 COSY- 和 HMBC 谱的解读以及化合物 alterporriol A 和 6-O- 甲基意大利鼠李蒽醌的 NMR 数据比较可以清晰得到。下面表 1 列出的 1H-NMR 谱 显示了在 δ1.110(CH3-7′ ) 和 1.114(CH3-7′ *) 的两个第三级甲基， 在 δ2.17(CH3-2) 和 * δ2.16(CH3-2 ) 的两个芳香甲基， 以及四个甲氧基的信号， 所述四个甲氧基部分重叠并在 δ3.68， 3.70， 和 3.71 处共振 ( 得自积分 )。此外， 观察到在 δ4.04 重叠的单峰 (H-8′ / * * H-8′ )， δ4.45 重叠的双峰 (H-5′ /H-5’ )， 和 δ3.54 重叠的双峰 (H-6’ /H-6′ *)。芳 香区域在 δ7.40、 6.94、 6.93、 6.91、 和 6.90 显示 5 个质子共振。而且， alterporriol 的 1 H-NMR 中没有显现间位连接的质子。然而， COSY 谱， 显示 CH3-2 和 H-1 之间清晰的长范围关 联， 证明了 7-O- 甲基意大利鼠李蒽醌基团在 C-6 或 C-8 与 alterporriol A 基团关联。 HMBC * 谱的解读也列于表 1， 显示了在 δ6.93/δ6.94 观察到的芳香质子 (H-6/H-6 ) 与 δ165.1 和 165.5 的两个带氧的碳原子 (C-5 和 C-7) 强关联。在 δ6.90/δ6.91 共振的芳香质子 (H-3′ /H-3′ *) 与 δ164.2 和 164.3 的两个带氧的碳原子 (C-2′和 C-4′ ) 关联， 这表明 C-8 为两个单体间的连接点。
此 外， 表 1 中 HMBC 谱 的 解 读 显 示 H-1 与 C-9(δ180.4)、 C-4a(δ129.0)、 和 * C-3(δ150.9) 关联， 而 H-6/6 与 C-8(δ123.0) 和 C-10a(δ109.3) 关联。除此之外， 发现 H-3′与碳原子 C-2′、 C-4′ (δ164.2， 164.3)、 C-1′ (δ123.1)、 C-4′ a (δ109.7)， 和 C-10′ (δ188.8) 的酮基强关联。后面的关联是由于 W- 连接。
为确定脂肪环中 alterporriol I 和 J 的相对构型， 进行了 ROESY 测量。在该连接 中， CH3-7′的信号显示出与 H-6′， H-8′， OH-6′和 OH-8′的强关联， 表明 CH3-7′是中轴
线。 而且， 质子 H-8′与质子 H-6′关联， 后者存在于对 H-5′的双直键连接中 ( 其可以由连 接常数得来 )。这样， 化合物 alterporriolI 和 alterporriol J 被确认为新的天然产物。
表 1 alterporriol I 和 J 的 1H-NMR 和 13C-NMR 数据
3-O- 乙酰基 altersolanol M3-O- 乙酰基 altersolanol M 以红褐色晶体的形式被分离出来。HRESI-MS 谱显示 m/z 379([M+H]+) 处的主峰， 其对应比 altersolanol A 多 42 个质量单位 ( 即一个乙酰基 )， 1 结果是经验式 C18H18O9。 H-NMR 谱包含三个可交换的乙醇羟基， δ5.34 和 5.98 的两个双峰， 以及 δ4.86 的单峰， 其分别属于 4-OH、 1-OH 和 2-OH。 此外， 观察到 δ1.13 和 2.11 的两个单 峰 ( 得自积分 )， 对应两个甲基。间位连接的质子在 δ6.85(H-6) 和 δ7.04(H-8) 共振， 而 芳香甲氧基位于 δ3.91。在 COSY 谱中， 强场双峰 (1-OH) 与脂肪低场质子 H-1 关联 ； 而且， 质子 H-4 出现在 δ4.68， 与碳原子 C4 上的羟基 (4-OH) 和质子 H-3 关联。总脂肪自旋系统 在 H-1、 H-3、 和 H-4 施加压力， 这连同对应的羟基官能度， 清楚的显示了在 C3 位置存在乙酰 基。此外， HMBC 谱中由质子， 即 H-1、 H-3、 和 H4 引起的关联 ( 与 1、 2、 9、 9a、 2-Me) 和芳香质 子的关联充分支持了上面的 3-O- 乙酰基 altersolanol M 结构。 3-O- 乙酰基 altersolanol 1 M 的相对立体化学结构由在 H-NMR 谱中观察到的连接常数和在 ROESY 谱中检测到的关联得 来。J1-2 的高值 (7.52Hz) 显示了 H-4 和 H-3 存在于双直键连接中， 这由 ROESY 谱证实。此 外， 甲基显示出与 H-1、 1-OH、 2-OH、 和 δ1.13 处 H-3 的关联， 这可以由其中轴位置解释。最 后， 质子 H-1 显示与质子 H-1 的清楚关联， 表明了脂肪环的相对构型。
表 2 3-O- 乙酰基 altersolanol M 的 1H-NMR 和 13C-NMR 数据
活性测定 - 抗菌 / 抗真菌作用
新化合物的活性以两种不同的筛选系统进行检测。通过 MIC 测试的方法检测抗细 菌和抗真菌活性。MIC 代表 “最小抑制浓度” 是指能用肉眼观察到没有微生物增殖的最低物 质浓度。MIC 通过所谓的滴定方法测定， 其中物质被稀释， 并随后加入病原体。
通常， 应用该方法以确定刚能抑制细菌菌株生长的抗生素浓度。 MIC 以微克每毫升 表示 (μg/ml)， 通常稀释以 log2 的等级进行。这里， 250μg/ml 的起始浓度被稀释数次， 每 次将体积加倍， 得到 250μg/ml、 125μg/ml、 62.5μg/ml、 31.2μg/ml、 15.6μg/ml、 7.8μg/ ml 等的测试浓度。因此， 较低的值表示较好的抗感染活性。
测试依据 EUCAST 标准 ( 欧洲抗菌敏感性测试委员会 ) 和欧洲临床微生物学和感 染性疾病学会 (ESCMID) 的 AFST- 方案 (“抗真菌敏感性测试” 方案 ) 进行。
病毒的筛选系统为包括体外感染宿主细胞的感染系统， 被测试物质在感染前或后 加入以确定其活性。所有这些测试依据 SeaLife Pharma 药物筛选的内部标准方案进行， 使 用与上述抗菌 / 抗真菌测试类似的稀释系列。
在下面的表 3 中， 测试结果表示 3-O- 乙酰基 altersolanol M、 alterporriolI 和 J 以及一些已知的和结构相似的比较物质抗某些多重抗药性细菌和真菌 ( 所有菌由维也纳 医科大学 Georgopulos 教授向我们提供 ) 的抗感染活性。数据由进行多个测试获得的平均 值组成。
已清楚所述新化合物抗四种细菌， 即抗粪肠球菌或屎肠球菌、 抗甲氧西林金黄色 葡萄球菌、 肺炎链球菌和表皮葡萄球菌的优良活性， 此外， 其也有效抵抗更多的病原体， 在 这一系列测试中 3-O- 乙酰基 altersolanol M 显示出比 alterporriol I 和 J 更广范围的 活性。
表3： 多重抗药性细菌和真菌的 MHK 值
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EC 125 7.8 125 62.5 15.6 62.5 125 15.6 31.2 62.5 31.2 15.6 7.8 62.5 7.8 7.8 62.5 31.2 7.8 7.8 15.6 125 125 7.8 7.8 7.8 7.8 7.8 125 31.2 KL PS EK MRSA STR SE ASP 62.5 125 15.6 7.8 62.5 62.5 7.8 125 62.5 62.5 31.2 125 62.5 62.5
CN 102482188 AEC KL PS物质例1： 3-O- 乙酰基 altersolanol M大肠杆菌 克雷伯菌 绿脓杆菌例2： alterporriol I+J卷线孢菌素细格菌素说Alterporriol A+B明19Altersolanol A书Altersolanol JAmpelanol巨孢子素巨孢子素硫酸盐吲哚甲醛 ( 甲醛 )15/17 页CN 102482188 A
说明书16/17 页EK 粪肠球菌或屎肠球菌
MRSA 抗甲氧西林金黄色葡萄球菌
STR 肺炎链球菌
SE 表皮葡萄球菌
AB 鲍曼不动杆菌
ASP 烟曲霉或粪曲霉
作为测试本发明的新化合物抗三种不同呼吸道病毒， 即抗从 ATCC 获得的人鼻病 毒 (hrv)、 呼吸道合胞病毒 (rsv)、 和副流感病毒的结果， 发明人发现在 0.1μg/ml 的浓度 下， 两种 ( 或所有三种 ) 化合物已能给细胞提供 100％的保护。 使用流感病毒和腺病毒的预 测试也已获得初步有希望的结果。
活性测定 - 细胞毒性
在 多 个 系 列 测 试 中 测 试 了 Alterporriol I 和 J 以 及 特 别 是 3-O- 乙 酰 基 altersolanol M 的抗癌作用。系列测试包括二维标准测试和新发展的三维肿瘤模型。
a) 使用黑色素瘤细胞的阿尔玛蓝测试
在该测试中， 使用染料刃天青作为测量物质细胞毒性的指示物， 使用蓝色的刃天 青水溶液。 所述溶液被正常功能的细胞逐渐还原为试卤灵 ( 消耗 NADH)， 试卤灵颜色为水红 色并有荧光。依赖于其毒性程度， 细胞毒性剂减少或停止这种还原。
在 该 实 验 过 程 中， 使 用 多 个 浓 度， 即 1、 10、 和 50μg/ml 的 3-O- 乙 酰 基 altersolanol M，和 作 为 比 较 物 质 的 altersolanol K 和 altersolanol F，以 及 alterporriol I+J 即本发明的化合物 (5) 处理黑色素瘤细胞， 在 10μg/ml 下的各自浓度 下， 培养 48h， 随后在 570/600nm 测定样品的荧光光谱， 荧光与样品中存活的细胞数成正比。
测量结果与空白的荧光关联， 空白中没有加入细胞毒性剂， 结果在图 1 图中显示。 从左到右， 图显示了空白对照 ( “阴性对照” )、 增加 3-O- 乙酰基 altersolanol M 的浓度 (1、 10、 和 50μg/ml)、 以及 altersolanol K、 alterporriol F、 和 Alterporriol I+J 的结果。
可以清楚的看到， 在仅 μg/ml 的浓度下， 3-O- 乙酰基 altersolanol M 已抑制存活 细胞数超过 10％。这些值在使用 altersolanol K、 alterporriol F、 和 alterporriol I/J 时只有在 10μg/ml 的浓度下才能达到， 本发明的 alterporriol I/J 比两个比较例获得了 略好的结果。在这个 10μg/ml 的浓度， 3-O- 乙酰基 altersolanol M 已经实现了将黑色素 瘤细胞数降低约 50％， 而在 50μg/ml， 几乎不能检测到任何存活的细胞。这意味着在该测 试中本发明的两种化合物都显示出细胞毒性活性， 而 3-O- 乙酰基 altersolanol M 至少更 有效 10 倍。
电子细胞基质阻抗判别 -(ECIS-) 测试中也获得了类似结果 ( 此处未显示 )， 3-O- 乙酰基 altersolanol M 再次清楚的得到了比 alterporriol I/J 更好的结果。
b) 三维肿瘤测试
除 上 述 二 维 测 试 之 外， 还 在 创 新 的 三 维 检 测 系 统 中 检 验 了 3-O- 乙 酰 基 altersolanol M 细胞毒性作用。 在该检测系统中， 小肿瘤在凝胶基质中生长， 其中通过加入 不同浓度的所述制剂来直接检测抗癌制剂的活性。
空白， 即没有任何细胞毒性剂的黑色素瘤细胞， 以及相同数量的加有 30、 50 或 3,000μg/ml 3-O- 乙酰基 altersolanol M 的黑色素瘤细胞在凝胶基质中 37℃培养 120 小时。在 0、 24、 48、 和 120 小时后摄取样品的相位对比图像 ( 图 2 和 3 中显示 )。
在最上面一行， 图 2 显示了空白 ( 阴性对照 )， 其清楚显示外膜形成和随后紧密的 肿瘤中黑色素包含物， 所述肿瘤在持续生长。如预计的一样， 在 3-O- 乙酰基 altersolanol M 所有三个浓度下， 24 小时后肿瘤已显示退化迹象， 并在 120 小时后尺寸明显缩小， 3-O- 乙 酰基 altersolanol M 的退化效果在最高浓度最明显 ( 是最低浓度下的 100 倍 )， 示于图 3。
由此， 清楚显示了本发明提供了新化合物， 其抗多重抗药细菌和真菌病原体和呼 吸道病毒及癌细胞高度有效， 因此可以在广泛的应用中用作抗感染药和抗癌药。所述化合 物 (4)， 3-O- 乙酰基 altersolanol M， 对所有上面涉及的应用领域， 是一种特别有前景的药 剂。