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1、10申请公布号CN103276013A43申请公布日20130904CN103276013ACN103276013A21申请号201310207265422申请日20130529C12N15/84200601A01H5/0020060171申请人陕西师范大学地址710062陕西省西安市长安南路199号72发明人俞嘉宁王蕾何鹏周丹丹74专利代理机构西安永生专利代理有限责任公司61201代理人申忠才54发明名称棉花子叶瞬时表达外源基因的方法57摘要一种棉花子叶瞬时表达外源基因的方法，由棉花种植、制备转化液、注射侵染、棉花培养、GUS基因表达检测步骤组成。本发明具有方便、快捷、易于操作、染色清晰等优。
2、点，适合检测棉花来源的外援基因的表达，亚细胞定位及启动子活性。51INTCL权利要求书2页说明书8页序列表1页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书8页序列表1页附图3页10申请公布号CN103276013ACN103276013A1/2页21一种棉花子叶瞬时表达外源基因的方法，其特征在于它由下述步骤组成（1）棉花种植棉花种子37浸泡12小时，将营养土与蛭石按质量比为31混合成栽培土，吸水8小时，待表面湿润后，种植棉花种子，覆土，25、湿度512、16小时光照、8小时黑暗、光照强度24000LUX的培养箱中培养至棉花种子萌发；（2）制备转化液吸取含有外源基。
3、因GUS表达载体的农杆菌GV3101与LB液体培养基按150的体积比加入到LB液体培养基中，在LB液体培养基中加入50MG/ML的卡那霉素、50MG/ML的利福平、20MG/ML的庆大霉素，LB液体培养基与50MG/L的卡那霉素、50MGL/的利福平、50MG/L的庆大霉素的体积比为1000100010001，28，180转/分钟振荡培养1518小时，制备成600NM的OD值为0306的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为19010，得到转化液；上述外源基因用PCAMBIA1301或PCAMBIA。
4、2301或PBI121按常规的载体构建方法构建并转化进农杆菌GV3101中，外源基因与GUS基因连接成融合基因；上述的侵染液由100MOL/L的乙酰丁香酮与10MMOL/L的硫酸镁的体积比为11混合制成；（3）注射侵染用蒸馏水清洁生长218天的棉花子叶，用质量浓度为75的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射30150L转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面；（4）棉花培养将注射侵染后的棉花植株放入241、光照强度24000LUX、湿度51的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时培养2496小时，在培养过程中GUS基因表达；（5）GUS基因表达检测将培养。
5、2496小时的子叶用蒸馏水清洗，置于PH70的GUS染色液中，180转/分钟，37振荡染色24小时，浸泡在染色液中的棉花子叶用水循环式真空泵008MPA抽真空30分钟，继续振荡染色48小时，用乙醇脱色8小时，脱去叶绿素。2根据权利要求1所述的棉棉花子叶瞬时表达外源基因的方法，其特征在于在制备转化液步骤（2）中，吸取含有外源基因GUS表达载体的农杆菌GV3101与LB液体培养基按150的体积比加入到LB液体培养基中，在LB液体培养基中加入50MG/ML的卡那霉素、50MG/ML的利福平、20MG/ML的庆大霉素，LB液体培养基与50MG/L的卡那霉素、50MGL/的利福平、50MG/L的庆大霉素。
6、的体积比为1000100010001，28、180转/分钟振荡培养1518小时，制备成600NM的OD值为05的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为19010，得到转化液。3根据权利要求1所述的棉花子叶瞬时表达外源基因的方法，其特征在于在注射侵染步骤（3）中，用蒸馏水清洁生长6天的棉花子叶，用质量浓度为75的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射50L转化液，权利要求书CN103276013A2/2页3用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。4根据权利要求1所述。
7、的棉花子叶瞬时表达外源基因的方法，其特征在于在棉花培养步骤4中，将注射侵染后的棉花植株放入241、光照强度24000LUX、湿度51的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时培养48小时，外源基因和GUS表达。权利要求书CN103276013A1/8页4棉花子叶瞬时表达外源基因的方法技术领域0001本发明属于生物技术领域，具体涉及到农杆菌介导的棉花子叶瞬时表达系统的建立。背景技术0002瞬时表达是指外源基因导入到植物细胞后，作为一种基因组外的遗传物质进行转录和翻译，并在转化细胞内积累表达产物的技术，转录和翻译的时间通常为几天到十几天。瞬时表达系统具有表达效率高，实验周期短，操作简单而且对材料限制小等。
8、优点。瞬时表达系统常见的转化法有基因枪轰击法、摩擦接种法、原生质体转化法和农杆菌介导的瞬时转化法。这些转化法各有优缺点，其中基因枪的效率比较高，但费用很大；摩擦接种法虽然花费少，但是不适于大规模侵染和筛选；而农杆菌介导的瞬时表达技术不仅费用少、操作简单。而且转化的材料种类范围比较广泛，植物叶片、胚珠、愈伤组织以及原生质体等均可以被转化，目前已被用于拟南芥、烟草、玉米、甘蔗、土豆等多种植物。但是瞬时转化系统仍然存在一些问题，尤其是外源基因在其他植物中的异源表达无法真实反映蛋白质的天然活性、亚细胞定位和其他蛋白的互作情况。因此用所研究基因来源的物种做为瞬时表达的材料可以更合理、更有效、更真实的反应。
9、基因功能。0003棉花是锦葵科木棉属植物，是世界上最主要的经济作物之一，棉花的基因组测序已经完成，对棉花中功能基因的研究也进入到更深更广的阶段。近年来，棉花中瞬时表达系统主要利用棉花愈伤组织经酶解法处理后形成的原生质体来完成，该方法能快速检测棉花功能基因的瞬时表达、亚细胞定位等，但操作复杂，需要基因枪进行基因转化，费用大。0004因此，在转基因技术领域，当前需要解决的一个技术问题是建立一种更方便、更快捷的棉花瞬时表达方法以便研究棉花功能基因的亚细胞定位，蛋白互作，启动子活性等。发明内容0005本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺点，提供一种方便、快捷、有效的棉花子叶瞬时表达外源基因的方法。
10、。0006解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成00071、棉花种植0008棉花种子37浸泡12小时，将营养土与蛭石按质量比为31混合成栽培土，营养土和蛭石为市场上销售的商品，由上海亚轩绿化工程有限售公司销售，吸水8小时，待表面浸润后，种植棉花种子，覆土，25、湿度512、16小时光照、8小时黑暗、光照强度24000LUX的培养箱中培养至棉花种子萌发。00092、制备转化液0010吸取含有外源基因GUS表达载体的农杆菌GV3101与LB液体培养基按150的体积比加入到LB液体培养基中，在LB液体培养基中加入50MG/ML的卡那霉素、50MG/ML的利福平、20MG/ML的庆大霉素，LB。
11、液体培养基与50MG/L的卡那霉素、50MG/L的利福平、50MG/说明书CN103276013A2/8页5L的庆大霉素的体积比为1000100010001，28，180转/分钟振荡培养1518小时，制备成600NM的OD值为0306的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为19010，得到转化液。0011上述外源基因GUS表达载体用PCAMBIA1301或PCAMBIA2301或PBI121按常规的载体构建方法构建并转化进农杆菌GV3101中，外源基因与GUS基因应连接成融合基因，以便表达出外源基因。
12、GUS标签的融合蛋白。PCAMBIA1301和PCAMBIA2301植物表达载体购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，货号MCV033和MCV037；PBI121植物表达载体购于北京拜尔迪生物技术有限公司，货号MP091；0012上述侵染液由100MOL/L的乙酰丁香酮与10MMOL/L的硫酸镁按体积比为11混合制成。00133、注射侵染0014用蒸馏水清洁生长218天的棉花子叶，用质量浓度为75的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射30150L转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。00154、棉花培养0016将注射侵染后的棉花植株放入241、光。
13、照强度24000LUX、湿度51的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，共培养2496小时，在培养过程中GUS基因表达。00175、GUS基因表达检测0018将培养2496小时的子叶用蒸馏水清洗，置于PH70的GUS染色液中，180转/分钟，37振荡染色24小时，浸泡在染色液中的棉花子叶用水循环式真空泵008MPA抽真空30分钟，继续振荡染色48小时，用乙醇脱色8小时，脱去叶绿素。0019所用GUS染色液用1MOL/L的磷酸二氢钠、1MOL/L的磷酸氢二钠、05MOL/L的乙二胺四乙酸二钠、01MOL/L的铁氰化钾、01MOL/L的亚铁氰化钾、质量浓度为01的曲拉通X100，5溴4氯3吲哚D葡萄。
14、糖苷（XGLUC）配制成，1MOL/L的磷酸二氢钠与1MOL/L的磷酸氢二钠、05MOL/L的乙二胺四乙酸二钠、01MOL/L的铁氰化钾、01MOL/L的亚铁氰化钾、质量浓度为01的曲拉通X100、5溴4氯3吲哚D葡萄糖苷（XGLUC）的体积比为21292010101。0020在本发明的制备转化液步骤2中，吸取含有外源基因GUS表达载体的农杆菌GV3101与LB液体培养基按150的体积比加入到LB液体培养基中，在LB液体培养基中加入50MG/ML的卡那霉素、50MG/ML的利福平、20MG/ML的庆大霉素，LB液体培养基与50MG/L的卡那霉素、50MGL/的利福平、50MG/L的庆大霉素的体。
15、积比为1000100010001，28、180转/分钟振荡培养1518小时，制备成600NM的OD值最佳为05的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为19010，得到转化液。0021在本发明的注射侵染步骤3中，用蒸馏水清洁生长最佳6天的棉花子叶，用质量浓度为75的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处最佳各注射50L转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。0022在本发明的棉花培养步骤4中，将注射侵染后的棉花植株放入241、光照强度说明书CN103276013A。
16、3/8页624000LUX、湿度51的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，最佳培养48小时，可促进外源基因和GUS表达。0023本方法具有方便、快捷、易于操作、染色清晰等优点，适合检测棉花来源的外援基因的表达，亚细胞定位及启动子活性。附图说明0024图1是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为03时收菌配制50UL的转化液培养2天GUS染色结果照片。0025图2是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为04时收菌配制50UL的转化液培养2天GUS染色结果照片。0026图3是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为05时收菌配制50UL的转化液培养2天GUS染色结。
17、果照片。0027图4是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为06时收菌配制50UL的转化液培养2天GUS染色结果照片。0028图5是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为05时收菌配制30UL的转化液培养2天GUS染色结果照片。0029图6是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为05时收菌配制100UL的转化液培养2天GUS染色结果照片。0030图7是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为05时收菌配制150UL的转化液培养2天GUS染色结果照片。0031图8是棉花生长2天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为05时收菌配制50UL的转化液培养2。
18、天GUS染色结果照片。0032图9是棉花生长10天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为05时收菌配制50UL的转化液培养2天GUS染色结果照片。0033图10是棉花生长14天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为05时收菌配制50UL的转化液培养2天GUS染色结果照片。0034图11是棉花生长18天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为05时收菌配制50UL的转化液培养2天GUS染色结果照片。0035图12是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为05时收菌配制50UL的转化液培养1天GUS染色结果照片0036图13是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为05时收菌配制。
19、50UL的转化液培养3天GUS染色结果照片。0037图14是棉花生长6天子叶背面两条叶脉分支处注射OD600为05时收菌配制50UL的转化液培养4天GUS染色结果照片。具体实施方式0038下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。0039实施例10040本实施例棉花子叶瞬时表达外源基因的方法由下述步骤组成说明书CN103276013A4/8页700411、棉花种植0042将棉花种子40粒在37的中浸泡12小时，营养土与蛭石按质量比为31混合成栽培土，营养土和蛭石为市场上销售的商品，由上海亚轩绿化工程有限公司销售，浸泡后的棉花种子吸水8小时，种植在栽培土中，种植深度为。
20、1CM，覆土，25、湿度512、16小时光照、8小时黑暗、光照强度24000LUX的培养箱中培养至棉花种子萌发。00432、制备转化液0044外援基因D7PCAMBIA1301表达载体按如下方法构建，设计含有NCOI酶切位点的PCR上游、下游扩增引物，引物序列为0045FATTCCATGGCAGTTACACAATTCAGAG，RGGACCATGGCCTTCCTAGTAACAGTAG0046采用常规RTPCR方法扩增获得5端带NCOI酶切位点和3端带NCOI酶切位点的D7基因（基因序列号为GENBANKX132011）与EASYVECTOR连接，按EASYVECTOR试剂盒的操作步骤进行，获得的。
21、连接产物转化大肠杆菌DH5，提取质粒，测序鉴定后命名为TEASYD7质粒。对PCAMBIA1301载体及TEASYD7质粒分别用NCOI进行酶切，各自的酶切体系如下004700480049上述体系各自混匀，37水浴2小时，30ML质量浓度为10的琼脂糖凝胶分离条带并回收，PCAMBIA1301酶切后回收11837BP的片段，命名为PCAMBIA13011，TEASYD7质粒酶切后回收531BP条带，命名为D71，具体回收步骤按DNA纯化试剂盒说明书进行。0050T4DNA连接酶连接PCAMBIA13011与TEASYD7，反应体系如下0051说明书CN103276013A5/8页80052上述。
22、连接体系混匀，16连接16小时。连接产物转化大肠杆菌DH5，在含50MG/L的卡那霉素的LB筛选培养基上筛选阳性菌落，摇菌提取质粒，测序鉴定后命名为D7PCAMBIA1301表达载体。0053吸取200L含有D7PCAMBIA1301表达载体的农杆菌GV3101加入到10ML的LB液体培养基中，含有D7PCAMBIA1301表达载体的农杆菌GV3101与LB液体培养基的体积比为150，在LB液体培养基中加入50MG/ML的卡那霉素、50MG/ML的利福平、20MG/ML的庆大霉素，LB液体培养基与50MG/L的卡那霉素、50MGL/的利福平、50MG/L的庆大霉素的体积比为1000100010。
23、001，28，180转/分钟振荡培养1518小时，制备成600NM的OD值为0306的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为19010，得到转化液；0054上述载体构建过程中所用PCAMBIA1301植物表达载体购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，货号MCV033，T4DNA连接酶，10T4DNA连接酶缓冲液、DNA胶回收试剂盒购于PROMEGA公司，NCOI、10K缓冲液、10BSA购于大连宝生物工程有限公司，大肠杆菌DH5和EASY载体试剂盒购置于PROMEGA公司；0055上述的侵染液由10。
24、0MOL/L的乙酰丁香酮与10MMOL/L的硫酸镁的体积比为11混合制成；0056本实施例中的外源基因也可采用棉花中的其它基因，如GHATP6、GHACCD、GHPPR3等。00573、注射侵染0058用蒸馏水清洁生长6天的棉花子叶，用质量浓度为75的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射50L转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。00594、棉花培养0060将注射侵染后的棉花植株放入241、光照强度24000LUX、湿度51的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，共培养48小时，在培养过程中GUS基因表达。00615、GUS基因表达检测0062将培。
25、养48小时的子叶用蒸馏水清洗，置于PH70的GUS染色液中，180转/分钟，37振荡染色24小时，浸泡在染色液中的棉花子叶用水循环式真空泵008MPA抽真空30分钟，继续振荡染色48小时，用乙醇脱色8小时，脱去叶绿素。0063所用GUS染色液用1MOL/L的磷酸二氢钠42ML、1MOL/L的磷酸氢二钠58ML、05MOL/L的乙二胺四乙酸二钠4ML、01MOL/L的铁氰化钾2ML、01MOL/L的亚铁氰化钾2ML、质量浓度为01的曲拉通X10002ML，5溴4氯3吲哚D葡萄糖苷（XGLUC）100MG配制成，1MOL/L的磷酸二氢钠与1MOL/L的磷酸氢二钠、05MOL/L的乙二胺四乙酸二钠、。
26、01MOL/L的铁氰化钾、01MOL/L的亚铁氰化钾、质量浓度为01的曲拉通X100、5溴4氯3吲哚D葡萄糖苷（XGLUC）的体积比为21292010101。0064实施例20065本实施例棉花子叶瞬时表达外源基因的方法由下述步骤组成0066棉花种植步骤1与实施例1相同。说明书CN103276013A6/8页90067在制备转化液步骤2中，吸取200L含有D7PCAMBIA1301表达载体的农杆菌GV3101加入到10MLLB液体培养基中，在10ML的LB液体培养基中加入50MG/ML的卡那霉素10L、50MG/ML的利福平10L、50MG/ML的庆大霉素10L，LB液体培养基与50MG/L的。
27、卡那霉素、50MGL/的利福平、50MG/L的庆大霉素的体积比为1000100010001，28、180转/分钟振荡培养1518小时，制备成600NM的OD值为03的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为19010，得到转化液。0068在注射侵染步骤3中，用蒸馏水清洁生长6天的棉花子叶，用质量浓度为75的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射150L转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。0069其他步骤与实施例1相同。0070实施例30071本实施例棉花。
28、子叶瞬时表达外源基因的方法由下述步骤组成0072棉花种植步骤1与实施例1相同。0073在制备转化液步骤2中，吸取200L含有D7PCAMBIA1301表达载体的农杆菌GV3101加入到10MLLB液体培养基中，在10ML的LB液体培养基中加入50MG/ML的卡那霉素10L、50MG/ML的利福平10L、50MG/ML的庆大霉素10L，LB液体培养基与50MG/L的卡那霉素、50MGL/的利福平、50MG/L的庆大霉素的体积比为1000100010001，28、180转/分钟振荡培养1518小时，制备成600NM的OD值为06的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入。
29、MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为19010，得到转化液。0074在注射侵染步骤3中，用蒸馏水清洁生6天的棉花子叶，用质量浓度为75的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射30L转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。0075其他步骤与实施例1相同。0076实施例40077在以上的实施例13中，棉花种植步骤1、制备转化液步骤2、注射侵染步骤3与相应的实施例相同。0078在棉花培养步骤4中，将注射侵染后的棉花植株放入241、光照强度24000LUX、湿度51的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，共培养24小时，在培养过程。
30、中GUS基因表达。0079其他步骤与实施例1相同。0080实施例50081在以上的实施例13中，棉花种植步骤1、制备转化液步骤2、注射侵染步骤3与相应的实施例相同。0082在棉花培养步骤4中，将注射侵染后的棉花植株放入241、光照强度24000LUX、湿度51的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，共培养96小时，在培养过程中GUS基因表达。0083其他步骤与实施例1相同。说明书CN103276013A7/8页100084其他步骤与实施例1相同。0085实施例60086在以上的实施例15的制备转化液步骤2中的PCAMBIA1301用等体积的PCAMBIA2301替换，该步骤中的其他步骤与实施例1。
31、相同其他步骤与相应的实施例相同。0087实施例70088在以上的实施例15的制备转化液步骤2中的PCAMBIA1301用等体积的PBI121替换，该步骤中的其他步骤与实施例1相同其他步骤与相应的实施例相同。0089为了确定本发明的最佳步骤，发明人进行了大量的研究实验，各种实验情况如下00901、农杆菌不同OD600对棉花子叶的生长影响0091棉花种植步骤1与实施例1相同。0092在制备转化液步骤2中，吸取200L含有D7PCAMBIA1301表达载体的农杆菌GV3101加入到10MLLB液体培养基中，在10ML的LB液体培养基中加入50MG/ML的卡那霉素10L、50MG/ML的利福平10L、。
32、50MG/ML的庆大霉素10L，LB液体培养基与50MG/L的卡那霉素、50MGL/的利福平、50MG/L的庆大霉素的体积比为1000100010001，28、180转/分钟振荡培养1518小时，上述原料各取4份，分别制备成600NM的OD值为03、04、05、06的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为19010。侵染液的制备与实施例1相同。制备成4种转化液。0093其他步骤与实施例1相同，实验结果见图1图4。由图可见，600NM的OD值为0306的菌液制备的转化液注射在子叶背面两条叶脉分支处，培。
33、养2天的棉花子叶GUS染色显示转化效率较高，600NM的OD值为05时棉花子叶的转化效率最高。00942、转化液的注射量对棉花子叶的生长影响0095棉花种植步骤1、制备转化液步骤2与实施例1相同。0096在注射侵染步骤3中，用蒸馏水清洁生长6天的棉花子叶，用质量浓度为75的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射30L、50L、100L、150L转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。0097其他步骤与实施例1相同。实验结果见图3、图5、图6、图7。由图可见，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处注射30150L转化液培养2天的棉花子叶GUS染色显示转化效率较。
34、高，注射50L转化液时转化效率最高。00983、不同时期注射对棉花子叶的生长影响0099棉花种植步骤1、制备转化液步骤2与实施例1相同。0100在注射侵染步骤3中，用蒸馏水分别清洁生长2天、6天、10天、14天、18天的棉花子叶，用质量浓度为75的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射50L转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面。0101其他步骤与实施例1相同。实验结果见图3、图8、图9、图10、图11。由图可见，生长218的棉花子叶GUS染色显示转化效率较高，生长6的棉花子叶转化效率最高。01024、不同共培养时间对棉花子叶的生长影响0103棉花种。
35、植步骤1、制备转化液步骤2、注射侵染步骤3与实施例1相同。说明书CN103276013A108/8页110104在棉花培养中，将注射侵染后的棉花植株放入241、光照强度24000LUX、湿度51的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时，分别培养24、48、72、96小时，GUS基因表达。0105其他步骤与实施例1相同。实验结果见图3、图12、图13、图14。由图可见，共培养2496小时棉花子叶GUS染色显示转化效率较高，共培养48小时的棉花子叶GUS染色显示转化效率最高。说明书CN103276013A111/1页120001序列表CN103276013A121/3页13图1图2图3图4图5图6说明书附图CN103276013A132/3页14图7图8图9图10图11图12说明书附图CN103276013A143/3页15图13图14说明书附图CN103276013A15。