一种监测 DNA 合成期生物发光报告基因及其应用 【技术领域】
本发明涉及细胞分子生物学领域， 主要涉及一种监测 DNA 合成期的生物发光报 告基因， 本发明还涉及该基因在抗肿瘤药物筛选中的应用。背景技术
细胞从一次分裂结束开始， 经过物质积累， 直到下一次细胞分裂结束为止， 称为一 个细胞周期。一个细胞周期可以人为地分为 4 个时期， 即 DNA 合成前期 （G1 期） 、 DNA 合成期 （S 期） 、 DNA 合成后期 （G2 期） 和有丝分裂期 （M 期） 。正常细胞周期的运转由多种机制控制， 以确保细胞分裂的有序进行， 而当细胞周期调节失控时会导致肿瘤的发生。肿瘤细胞与一 般正常细胞的最大差别是在于它能够一直无限的增殖， 这是肿瘤细胞的细胞周期已不受正 常调控最明显的证据。如果能够利用药物去抑制肿瘤细胞的细胞周期， 使肿瘤细胞停止生 长， 甚至诱导肿瘤细胞发生程序性死亡， 那么就能够达到杀死肿瘤细胞治疗恶性肿瘤的目 的。S 期是细胞进行大量 DNA 复制的阶段， 组蛋白和非组蛋白也在此期大量合成， 最后完 成染色体的复制。 DNA 复制需要多种酶的参与， 包括 DNA 聚合酶、 DNA 连接酶、 胸腺嘧啶核 苷酸激酶、 核苷酸还原酶等。由于 S 期是细胞周期的关键时刻， 因此目前许多抗肿瘤药物 都是针对影响肿瘤细胞的 S 期所研发的。 在抗癌药物的研发过程中， 传统的动物实验方法需要肿瘤生长到一定程度后处死 动物切除肿瘤， 然后通过免疫组化等技术才能获得检测指标。 这种具有侵袭性的研究方法， 需要处死大量的动物， 不能在同一组动物身上重复试验， 很难直观、 活体、 动态地连续观察 肿瘤的生长转移情况， 特别是无法研究药物作用下影响细胞的增殖动态变化以及细胞死亡 的动力学变化等重要的时空信息。因此， 建立一种可以在活体小动物实时、 反复、 非侵袭性 地研究抗肿瘤药物模型不仅可以加速药物的研发， 快速优化新的治疗方案， 降低在研发药 物上所用动物的数量， 而且还可以对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估， 对于 抗肿瘤药物的筛选及其作用机制研究具有重要意义。
分子光学成像技术作为一种非侵入性动态成像技术， 以其高分辨率、 高灵敏度正 越来越多的应用于生命科学、 医学研究及药物开发等方面， 成为近年来动物模型研究最重 要的进展， 这一技术的完善和发展使非侵袭性研究抗肿瘤药物的分子机制成为可能。该技 术可以利用活体生物发光或荧光成像实时及连续动态监测活细胞在动物体内的各种生物 学过程， 因而能够在不处死实验动物的前提下， 实时监测体内疾病变化的整个过程， 可以对 同一动物体进行连续观察， 减少动物个体间差异的影响， 还可以减少实验动物的数量。 鉴于 上述情况， 本发明拟利用荧光素酶基因标记细胞周期蛋白 A2（cyclinA2） , 从而构建一种 具备高度敏感性， 可以实时、 反复地测定 S 期变化的光学影像报告系统， 用于探讨研究筛选 S 期敏感的抗肿瘤药物。
cyclinA2 由 432 个氨基酸组成， 其中 210~295 位氨基酸为“ cyclin box ”， 在 N 末端 47~55 位氨基酸序列称为“destruction box （D-Box） ” ， D-Box 决定泛素连接酶 cdc20 APC 是否特异性地与 cyclinA2 结合， 是泛素化介导的蛋白降解的重要信号。cyclinA2
与 CDK2 结合， 在 G l~S 转变过程中被活化， 从而调控 S 期进展。在整个细胞周期中， cyclinA2 的变化是受转录、 翻译及翻译后修饰来调节的。在 G1 晚期开始逐渐增加， S 期 积累到峰值， 早中期后通过依赖 APC/C 泛素化途径降解， CDC20 分子在此降解过程中发挥 重要作用。因此 cyclinA2 可以视为一种细胞周期 S 期的特异性蛋白， 反映 cyclinA2 蛋 白的转录与翻译后调控的报告基因可以报告细胞周期的 S 期。基于以上 cyclinA2 的调 控机制， 本发明通过基因工程技术将 cyclinA2 基因全长与荧光素酶基因融合作为 S 期的 报告基因， 在离体培养的细胞株中验证了其作为筛选 S 期特异性抗肿瘤药物的分子影像 报告系统的可行性， 并为在体筛选 S 期抗肿瘤药物及研究 S 期的调控机制奠定基础。 发明内容
本发明的目的是提供一个实时、 非侵袭性地监测 DNA 合成期 （S 期） 的生物发光报 告基因。
本发明的另一目的是提供该基因在以 S 期为靶点的抗肿瘤药物筛选领域中的应 用。
本发明的目的是这样实现的 ： 一种监测 DNA 合成期生物发光报告基因， 其特征在于 ： 将细胞周期蛋白 A2 与荧光素 酶基因融合， 从而形成一种可以用于监测细胞周期 S 期的生物发光报告基因， 其核苷酸序 列为 ： AAGCTTGCCACCATGTTGGGCAACTCTGCGCCGGGGCCTGCGACCCGCGAGGCGGGCTCGGCGCTGCTAGCA TTGCAGCAGACGGCGCTCCAAGAGGACCAGGAGAATATCAACCCGGAAAAGGCAGCGCCCGTCCAACAACCGCGGAC CCGGGCCGCGCTGGCGGTACTGAAGTCCGGGAACCCGCGGGGTCTAGCGCAGCAGCAGAGGCCGAAGACGAGACGGG TTGCACCCCTTAAGGATCTTCCTGTAAATGATGAGCATGTCACCGTTCCTCCTTGGAAAGCAAACAGTAAACAGCCT GCGTTCACCATTCATGTGGATGAAGCAGAAAAAGAAGCTCAGAAGAAGCCAGCTGAATCTCAAAAAATAGAGCGTGA AGATGCCCTGGCTTTTAATTCAGCCATTAGTTTACCTGGACCCAGAAAACCATTGGTCCCTCTTGATTATCCAATGG ATGGTAGTTTTGAGTCACCACATACTATGGACATGTCAATTGTATTAGAAGATGAAAAGCCAGTGAGTGTTAATGAA GTACCAGACTACCATGAGGATATTCACACATACCTTAGGGAAATGGAGGTTAAATGTAAACCTAAAGTGGGTTACAT GAAGAAACAGCCAGACATCACTAACAGTATGAGAGCTATCCTCGTGGACTGGTTAGTTGAAGTAGGAGAAGAATATA AACTACAGAATGAGACCCTGCATTTGGCTGTGAACTACATTGATAGGTTCCTGTCTTCCATGTCAGTGCTGAGAGGA AAACTTCAGCTTGTGGGCACTGCTGCTATGCTGTTAGCCTCAAAGTTTGAAGAAATATACCCCCCAGAAGTAGCAGA GTTTGTGTACATTACAGATGATACCTACACCAAGAAACAAGTTCTGAGAATGGAGCATCTAGTTTTGAAAGTCCTTA CTTTTGACTTAGCTGCTCCAACAGTAAATCAGTTTCTTACCCAATACTTTCTGCATCAGCAGCCTGCAAACTGCAAA GTTGAAAGTTTAGCAATGTTTTTGGGAGAATTAAGTTTGATAGATGCTGACCCATACCTCAAGTATTTGCCATCAGT TATTGCTGGAGCTGCCTTTCATTTAGCACTCTACACAGTCACGGGACAAAGCTGGCCTGAATCATTAATACGAAAGA CTGGATATACCCTGGAAAGTCTTAAGCCTTGTCTCATGGACCTTCACCAGACCTACCTCAAAGCACCACAGCATGCA CAACAGTCAATAAGAGAAAAGTACAAAAATTCAAAGTATCATGGTGTTTCTCTCCTCAACCCACCAGAGACACTAAA TCTGCAAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGC CATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGA ACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGC AGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTC AACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAA AAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGT TCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATT GCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAG ATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCC ATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAA GAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTT CGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCGCTCCCCTCTCTA AGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACA TCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAA GGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTA TGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATA GCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGT GGCTCCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGCAGGTGTCGCAGGTCTTCCCGACG ATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGAT TACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCT TACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAA。
本发明技术方案包括 ： 构建 pGL3-CYCA-Luc 重组表达载体， 该载体含有上述核苷 酸序列。
本发明的技术方案包括 ： pGL3-CYCA-Luc 重组表达载体在以细胞周期 S 期为靶点 的抗肿瘤药物筛选中的应用。
本发明以包含人 cyclinA2 基因全长的 PBS 质粒为模板， 在 cyclinA2 基因两端 设计引物， 扩增 cyclinA2 cDNA 全长并克隆至 pGL3-control 载体 Luc 基因的 5’ 端， 形 成一种可表达融合蛋白的真核重组表达载体， 即“pGL3-CYCA-Luc”载体。 该载体转染至肿 瘤细胞后可表达融合蛋白 “CYCA-Luc” 。 体外实验证明该融合蛋白可通过泛素化依赖性途径 降解， 呈细胞周期依赖性变化并能用于监测 S 期特异性抗肿瘤药物作用效果。 本发明将在 筛选针对 S 期的抗肿瘤药物等领域中发挥重要作用。
下面对本发明内容作进一步的详述。
构建真核重组表达载体 pGL3-CYCA-Luc。 利用 Primer 软件设计引物， 以 PBS 质 粒为模板扩增 cyclinA2 cDNA 全长， 引物具体如下 ： Sense ： GCGCAAGCTTGCCACCATGTTGGGCAACTCTGCGC， 引物中加入 Kozak 序列以提高翻译 起始效率。
Anti-sense ： GCCAAGCTTGCAGATTTAGTGTCTCTGGTGGGTTG PCR 扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳， 在 1200 bp 位置可见明显条带。利用限制性 内切酶 Hind Ⅲ 分别酶切 PCR 产物和载体 pGL3-control 并回收产物。本实验中为防止载 体自连， 酶切后的载体进行去磷酸化处理。酶切产物回收后， 用 T4 DNA 连接酶在 4 ℃ 连 接过夜。转化大肠杆菌 DH5α， 在含抗生素 Amp 平板上筛选重组子， 通过酶切鉴定和测序确 定得到重组表达载体 pGL3-CYCA-Luc。本发明中重组表达载体具有以下基本结构 ： 启动子（SV40） 、 融合蛋白编码区 （cyclinA2-luciferase） 、 终止密码子 （TAA） 、 DNA 序列 （DNA 复制起 始点等） 顺序连接而成的双链环状 DNA 分子， 如图 1 所示。
将构建好的重组表达载体以脂质体法瞬时转染 U2OS 细胞， 通过 Western blot 鉴 定转染细胞株是否表达融合蛋白 CYCA-Luc。结果显示， 使用荧光素酶和 cyclinA2 的抗体 在 110 KD 位置均可发现特异性条带， 体外荧光素酶活性分析结果显示转染 pGL3-CYCA-Luc 质粒的细胞荧光素酶相对强度比转染 pcDNA3.1 质粒即对照组高 4000 倍左右， 表明 融合蛋白可在转染细胞株表达。随后利用 G418 筛选获得稳定转染株细胞， 命名为 “U2OS-CYCA-Luc” 。
在接下来得实验中， 通过细胞周期同步化方法进一步分析了融合蛋白 CYCA-Luc 是否随细胞周期变化。 本发明中 S 期同步化药物为 mimosine。 流式分析结果显示， mimosine 处理细胞 20 h 后， 随着释放时间的增加， S 期细胞比例逐渐增加。Westren bloot 和荧光素 酶活性分析结果显示， 随着 S 期细胞比例的增加 CYCA-Luc 表达和荧光素酶相对强度增加， 提示 CYCA-Luc 表达与 S 期细胞比例密切相关。
后期促进复合物 （anaphase-promoting complex/cyclosome， APC/C）在调控有丝 cdc20 分裂的过程中起到重要的作用。APC 在有丝分裂途径前中期被激活 , 通过泛素化依赖 性途径降解 cyclinA2。为确定融合蛋白是否呈泛素化依赖性降解， 本发明中使用 CDC20 小分子干扰 RNA 封闭 CDC20 表达， 以确定 CDC20 表达下调后是否可导致 CYCA-Luc 表 达的上调。将 CDC20 小分子干扰 RNA 以脂质体法转染 U2OS-CYCA-Luc 细胞后， 分别进 行荧光素酶活性分析和 Western blot 检测。结果表明， CDC20 小分子干扰 RNA 可使 U2OS-CYCA-Luc 细胞荧光素酶相对强度升高和 CYCA-Luc 表达上调， 而 NC（阴性对照） 则 无明显变化， 表明 CYCA-Luc 呈泛素化依赖性途径降解。
确定 CYCA-Luc 呈泛素依赖性途径降解后， 本发明随后验证了该融合蛋白是否可 以作为生物发光报告蛋白准确反映 S 期特异性抗肿瘤药物作用效果。使用目前临床常用的 S 期特异性药物如 5- 氟尿嘧啶 （5-FU） 和羟基喜树碱 （HCPT） 作用 U2OS-CYCA-Luc 细胞使其 发生 S 期阻滞， 通过荧光素酶活性分析和 western blot 检测确定是否可以引起细胞的荧光 素酶相对强度升高和 CYCA-Luc 表达上调。结果显示 5-FU 和 HCPT 可使 U2OS-CYCA-Luc 细胞 CYCA-Luc 表达上调和荧光素酶相对强度升高， 提示该蛋白可以用于监测 S 期特异 性抗肿瘤药物活性。
与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 通过基因工程技术将 S 期特异性蛋 白 cyclinA2 克隆于荧光素酶基因上游， 形成重组表达载体 pGL3-CYCA-Luc。 通过上述研究 工作， 将融合蛋白 CYCA-Luc 作为监测 S 期的生物发光报告蛋白。该报告蛋白可受泛素化 依赖性的蛋白体系调控， 可在培养的细胞株中通过光学信号变化准确反映 S 期特异性抗肿 瘤药物作用效果。 该发明应用活体小动物后， 利用活体成像系统可实现在体条件下实时、 反 复、 非侵袭性地研究 S 期特异性抗肿瘤药物， 从而避免传统方法中需要处死实验动物等诸 多局限。因此， 该发明不仅可以加速药物的研发速度， 快速优化新的治疗方案， 降低在研发 药物上所用动物的数量， 而且还可以对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估， 对 于 S 期特异性抗肿瘤药物的筛选及其作用机制研究具有重要意义。 附图说明图1： pGL3-CYCA-Luc 构建及酶切鉴定。其中 A: pGL3-CYCA-Luc 构建示意图 ； B: pGL3-CYCA-Luc 酶切结果。
图2： pGL3-CYCA-Luc 在 U2OS 细胞中表达。其中 A ： western blot 结果 ； B： 荧光素 酶活性分析结果。
图3： 细胞周期同步化分析。其中 A ： 流式分析结果 ； B： western blot 结果 ； C： 荧 光素酶活性分析结果。
图4： CDC20 小分子干扰实验结果。其中 A ： western blot 结果 ； B： 荧光素酶活性 分析结果。
图5： S 期特异性抗肿瘤药物作用实验。其中 A ： western blot 结果 ； B： 荧光素酶 活性分析。 具体实施方式
（一） 构建真核重组表达载体 pGL3-CYCA-Luc 1. 引物设计 利用 primer 软件设计一对引物。在上游引物 5’端加入保护碱基、 HindIII 酶切位点及 Kozak 序列， 下游引物 5’ 端加入保护碱基和 HindIII 酶切位点。整理 好的引物序列送宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司合成。 2.PCR 扩 增 目 的 片 段 反 应 体 系 50 µL， Premix ExTaq 25 µL ；模 板 （PBS-cyclinA2） 5 µL ； 引物 1 20 µm， 1.5 µL ； 引物 2 20 µm， 1.5 µL ； 灭菌水 17 µL。充分 混匀后， 在 PCR 仪上完成下列操作 ： 94℃ 5 min， 98℃ 10 s， 56℃ 30 s， 72℃ 1 min， 30 cycles。
3. 质粒及 PCR 产物的酶切与回收 总体系 20 µL， Hind Ⅲ 1 µL， 10 × Mbuffer 2 µL， PCR 产物或质粒 DNA<1 µg， 灭菌水补齐至 20 µL。
4. 线性质粒的去磷酸化反应 总体系 50 µL， DNA Fragments in TE Buffer 5 pmol， 10 × ALKaline， Phosphatase Buffer 2 µL， dH2O up to 50 µL， 37℃ 反应 30 min， DNA 回收试剂盒回收反应产物， 20 µL TE Buffer 溶解沉淀。
5.PCR 产 物 与 目 的 片 段 的 连 接 总 体 系 25 µL， T4 DNA 连 接 酶 1 µL， 10 × Mbuffer 2 µL， PCR 产物 0.3 pmol， pGL3-control 0.03 pmol， 灭菌水补齐至 25 µL， 4℃过 夜连接。
6. 转化至感受态细胞 将 -80 ℃ 下保存的 100 µL 感受态细胞置于冰上， 完全 解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮 ； 加入 1 µLpGL3-control 质粒， DNA 浓度为 0.5 µg/µL， 轻 轻混匀 ； 冰上放置 30 min ； 42 ℃ 水浴热激 90 s ； 冰上放置 5 min ； 加 1mL 无 Amp 的 LB 培养液， 37 ℃ 培养 60 min， 使细菌恢复正常生长状态 ； 室温下 4000 rpm 离心 5 min， 用 枪头吸掉 1 mL 上清液， 用剩余的培养液将细胞悬浮 ； 将细菌涂布在 Amp/LB 琼脂平板上， Amp 工作浓度 100 µg/mL ； 37 ℃ 正向放置 1 h， 待接种的液体吸收进琼脂后， 将平皿倒置 培养过夜。
7. 质粒的小量提取、 酶切鉴定及测序 详细步骤见 TaKaRa 公司 MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0 产品说明书。酶切步骤如下 ： 第一组 ： 总体系 20 μL， DNA 3 μL， 10 × Buffer 2 μL， 无菌水 15 μL ； 第二组 ： 总 体系 20 μL， DNA 3 μL， 10 × Buffer 2 μL， NheI1 μL， 14 μL 无菌水 ； 第三组 ： 总体系
20 μL， DNA 3 μL， 10 × Buffer 2 μL， NcoI1 μL， 14 μL 无菌水 ； 第四组 ： 总体系 20 μL， DNA 3 μL， 10 × Buffer 2 μL， NcoI1 μL， NheI1 μL， 13 μL 无菌水。轻轻混匀， 37 ℃ 酶切 2 h， 结果见图 1。
提取质粒送至公司测序， 测序结果显示 DNA 序列及插入方向正确， 表明成功构建 重组表达载体 pGL3-CYCA-Luc。
（二） 建立 U2OS-CYCA-Luc 稳定转染株细胞 将构建好的 pGL3-CYCA-Luc 质粒以脂质体法瞬时转染 U2OS 细胞， 具体方法为 ： 将 U2OS 细胞培养于六孔培养板至汇合 70% 左右 ； 根据 Lipofectamine 2000 的说明书加 8.0 μg pGL3-CYCA-Luc 质粒及 20 μL 的 Lipofectamine 2000 进行转染。转染 48 h 后消化细胞， RLB 裂解， 制备蛋白样品， 通过 Western blot 鉴定融合蛋白表达。结果显示， 使用荧光素酶和 cyclinA2 的抗体在 110 KD 位置均可发现特异性条带， 而未转染细胞则 未见条带， 表明融合蛋白已在稳定转染株细胞表达。体外荧光素酶活性分析结果显示稳定 转染株细胞荧光素酶表达活性比对照细胞高 4000 倍左右， 如图 2 所示。这些结果表明， 我 们构建的真核重组表达载体可在哺乳动物细胞中表达融合蛋白。
为获得稳定表达融合蛋白的细胞， 本发明中使用 1000 µg/mL 浓度的 G418 对 转染细胞进行了筛选。由于 pGL3-CYCA-Luc 质粒无 G418 抗性基因 Neo， 因此在转染 pGL3-CYCA-Luc 质粒同时需共转染 pcDNA3.1 质粒， 该质粒含 Neo 基因。 具体转染的方法 为： 首先， 在 EP 管中加入 500 µL 无血清培养基， 然后加入 15 µL Lipo 2000 （Invitrogen 公司） 转染试剂， 轻轻混匀后， 室温下静置 5 min。取 12 µg 质粒， 其中含有 pcDNA3.1 和 pGL3-CYCA-Luc 两种质粒， 二者比例为 1 ： 10， 加入以上的混合物中， 轻轻混匀。 室温下静置 20 min 后， 取以上混合物加入培养皿中， 置于 5％ CO2、 湿度 95％ 和 37℃ 条件下培养。 24 h 后， 把培养皿中的培养液换为含有 G418 的常规 DMEM 培养液进行筛选。 待对照细胞 即未转染质粒的细胞被全部被杀死后， 将细胞置于药物浓度为 800 µg/mL 的 DMEM 培养 液中继续培养。在上述条件下， 细胞能够持续生长， 表明稳定转染细胞株已被成功建立。建 立的细胞株用于进一步分析使用。
（三） 在培养细胞株研究融合蛋白 CYCA-Luc 是否报告 S 期。
1. 细胞周期同步化 在 60mm 的培养皿中加适量的 U2OS-CYCA-Luc 细胞， 将细胞 培养至指数生长期的早期， 密度约为 50% 左右 ； 弃掉培养基， 加入含 0.2 mmol mimosine （sigma 公司） 的培养基继续培养 20 h ； 弃掉含 mimosine 的培养基， 用 PBS 液洗 2 次， 换 普通培养基继续培养 ； 在更换培养基后的 0、 3、 6、 9、 12 h 各时间点收获细胞样品用于流式 分析细胞周期。
2. 流式分析细胞周期 将上述收获的细胞用 PBS 洗二遍 ； 用 70% 的冰浴酒精过 夜固定 ； 离心去乙醇， PBS 清洗一次 ； 每管细胞样品中加入 0.5 mL 碘化丙啶染色液 （碧云 天） ， 缓慢并充分重悬细胞沉淀， 37℃避光温浴 30 min。流式检测和分析。实验结果表明， 随着释放时间的延长， S 期细胞所占比例逐渐增加， 如图 3 所示。
3. 荧光素酶活性分析和 Western blot 检测 将上述收获的细胞用 PBS 洗二次后 转至 1mL EP 管中 ； 每个样品中加入 100 µL RLB 裂解液， 制备蛋白样品 ； BCA 法测定蛋白 浓度， 将蛋白浓度调至相等， 利用荧光发光仪 （lumat LB 9507， BERTHOCD 公司） 检测荧光素 酶相对活性及 Western blot 检测融合蛋白表达， 以确定该报告蛋白是否在 S 期积聚。结果显示， mimosine 处理细胞 20 h 后， 随着释放时间的延长荧光素酶相对强度和 CYCA-Luc 表达量均逐渐增加， 说明报告蛋白的表达的变化与 S 期细胞数量的变化相一致， 如图 3 所 示。
4. 确定 CYCA-Luc 是否受泛素化依赖性降解调控。
本发明涉及细胞分子生物学领域， 主要涉及一种监测 DNA 合成期的生物发光报 告基因， 本发明还涉及该基因在抗肿瘤药物筛选中的应用。背景技术
细胞从一次分裂结束开始， 经过物质积累， 直到下一次细胞分裂结束为止， 称为一 个细胞周期。一个细胞周期可以人为地分为 4 个时期， 即 DNA 合成前期 （G1 期） 、 DNA 合成期 （S 期） 、 DNA 合成后期 （G2 期） 和有丝分裂期 （M 期） 。正常细胞周期的运转由多种机制控制， 以确保细胞分裂的有序进行， 而当细胞周期调节失控时会导致肿瘤的发生。肿瘤细胞与一 般正常细胞的最大差别是在于它能够一直无限的增殖， 这是肿瘤细胞的细胞周期已不受正 常调控最明显的证据。如果能够利用药物去抑制肿瘤细胞的细胞周期， 使肿瘤细胞停止生 长， 甚至诱导肿瘤细胞发生程序性死亡， 那么就能够达到杀死肿瘤细胞治疗恶性肿瘤的目 的。S 期是细胞进行大量 DNA 复制的阶段， 组蛋白和非组蛋白也在此期大量合成， 最后完 成染色体的复制。 DNA 复制需要多种酶的参与， 包括 DNA 聚合酶、 DNA 连接酶、 胸腺嘧啶核 苷酸激酶、 核苷酸还原酶等。由于 S 期是细胞周期的关键时刻， 因此目前许多抗肿瘤药物 都是针对影响肿瘤细胞的 S 期所研发的。 在抗癌药物的研发过程中， 传统的动物实验方法需要肿瘤生长到一定程度后处死 动物切除肿瘤， 然后通过免疫组化等技术才能获得检测指标。 这种具有侵袭性的研究方法， 需要处死大量的动物， 不能在同一组动物身上重复试验， 很难直观、 活体、 动态地连续观察 肿瘤的生长转移情况， 特别是无法研究药物作用下影响细胞的增殖动态变化以及细胞死亡 的动力学变化等重要的时空信息。因此， 建立一种可以在活体小动物实时、 反复、 非侵袭性 地研究抗肿瘤药物模型不仅可以加速药物的研发， 快速优化新的治疗方案， 降低在研发药 物上所用动物的数量， 而且还可以对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估， 对于 抗肿瘤药物的筛选及其作用机制研究具有重要意义。
分子光学成像技术作为一种非侵入性动态成像技术， 以其高分辨率、 高灵敏度正 越来越多的应用于生命科学、 医学研究及药物开发等方面， 成为近年来动物模型研究最重 要的进展， 这一技术的完善和发展使非侵袭性研究抗肿瘤药物的分子机制成为可能。该技 术可以利用活体生物发光或荧光成像实时及连续动态监测活细胞在动物体内的各种生物 学过程， 因而能够在不处死实验动物的前提下， 实时监测体内疾病变化的整个过程， 可以对 同一动物体进行连续观察， 减少动物个体间差异的影响， 还可以减少实验动物的数量。 鉴于 上述情况， 本发明拟利用荧光素酶基因标记细胞周期蛋白 A2（cyclinA2） , 从而构建一种 具备高度敏感性， 可以实时、 反复地测定 S 期变化的光学影像报告系统， 用于探讨研究筛选 S 期敏感的抗肿瘤药物。
cyclinA2 由 432 个氨基酸组成， 其中 210~295 位氨基酸为“ cyclin box ”， 在 N 末端 47~55 位氨基酸序列称为“destruction box （D-Box） ” ， D-Box 决定泛素连接酶 cdc20 APC 是否特异性地与 cyclinA2 结合， 是泛素化介导的蛋白降解的重要信号。cyclinA2
与 CDK2 结合， 在 G l~S 转变过程中被活化， 从而调控 S 期进展。在整个细胞周期中， cyclinA2 的变化是受转录、 翻译及翻译后修饰来调节的。在 G1 晚期开始逐渐增加， S 期 积累到峰值， 早中期后通过依赖 APC/C 泛素化途径降解， CDC20 分子在此降解过程中发挥 重要作用。因此 cyclinA2 可以视为一种细胞周期 S 期的特异性蛋白， 反映 cyclinA2 蛋 白的转录与翻译后调控的报告基因可以报告细胞周期的 S 期。基于以上 cyclinA2 的调 控机制， 本发明通过基因工程技术将 cyclinA2 基因全长与荧光素酶基因融合作为 S 期的 报告基因， 在离体培养的细胞株中验证了其作为筛选 S 期特异性抗肿瘤药物的分子影像 报告系统的可行性， 并为在体筛选 S 期抗肿瘤药物及研究 S 期的调控机制奠定基础。 发明内容
本发明的目的是提供一个实时、 非侵袭性地监测 DNA 合成期 （S 期） 的生物发光报 告基因。
本发明的另一目的是提供该基因在以 S 期为靶点的抗肿瘤药物筛选领域中的应 用。
本发明的目的是这样实现的 ： 一种监测 DNA 合成期生物发光报告基因， 其特征在于 ： 将细胞周期蛋白 A2 与荧光素 酶基因融合， 从而形成一种可以用于监测细胞周期 S 期的生物发光报告基因， 其核苷酸序 列为 ： AAGCTTGCCACCATGTTGGGCAACTCTGCGCCGGGGCCTGCGACCCGCGAGGCGGGCTCGGCGCTGCTAGCA TTGCAGCAGACGGCGCTCCAAGAGGACCAGGAGAATATCAACCCGGAAAAGGCAGCGCCCGTCCAACAACCGCGGAC CCGGGCCGCGCTGGCGGTACTGAAGTCCGGGAACCCGCGGGGTCTAGCGCAGCAGCAGAGGCCGAAGACGAGACGGG TTGCACCCCTTAAGGATCTTCCTGTAAATGATGAGCATGTCACCGTTCCTCCTTGGAAAGCAAACAGTAAACAGCCT GCGTTCACCATTCATGTGGATGAAGCAGAAAAAGAAGCTCAGAAGAAGCCAGCTGAATCTCAAAAAATAGAGCGTGA AGATGCCCTGGCTTTTAATTCAGCCATTAGTTTACCTGGACCCAGAAAACCATTGGTCCCTCTTGATTATCCAATGG ATGGTAGTTTTGAGTCACCACATACTATGGACATGTCAATTGTATTAGAAGATGAAAAGCCAGTGAGTGTTAATGAA GTACCAGACTACCATGAGGATATTCACACATACCTTAGGGAAATGGAGGTTAAATGTAAACCTAAAGTGGGTTACAT GAAGAAACAGCCAGACATCACTAACAGTATGAGAGCTATCCTCGTGGACTGGTTAGTTGAAGTAGGAGAAGAATATA AACTACAGAATGAGACCCTGCATTTGGCTGTGAACTACATTGATAGGTTCCTGTCTTCCATGTCAGTGCTGAGAGGA AAACTTCAGCTTGTGGGCACTGCTGCTATGCTGTTAGCCTCAAAGTTTGAAGAAATATACCCCCCAGAAGTAGCAGA GTTTGTGTACATTACAGATGATACCTACACCAAGAAACAAGTTCTGAGAATGGAGCATCTAGTTTTGAAAGTCCTTA CTTTTGACTTAGCTGCTCCAACAGTAAATCAGTTTCTTACCCAATACTTTCTGCATCAGCAGCCTGCAAACTGCAAA GTTGAAAGTTTAGCAATGTTTTTGGGAGAATTAAGTTTGATAGATGCTGACCCATACCTCAAGTATTTGCCATCAGT TATTGCTGGAGCTGCCTTTCATTTAGCACTCTACACAGTCACGGGACAAAGCTGGCCTGAATCATTAATACGAAAGA CTGGATATACCCTGGAAAGTCTTAAGCCTTGTCTCATGGACCTTCACCAGACCTACCTCAAAGCACCACAGCATGCA CAACAGTCAATAAGAGAAAAGTACAAAAATTCAAAGTATCATGGTGTTTCTCTCCTCAACCCACCAGAGACACTAAA TCTGCAAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGC CATTCTATCCGCTGGAAGATGGAACCGCTGGAGAGCAACTGCATAAGGCTATGAAGAGATACGCCCTGGTTCCTGGA ACAATTGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGGACATCACTTACGCTGAGTACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGC AGAAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAGAATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTTATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAGTTGCGCCCGCGAACGACATTTATAATGAACGTGAATTGCTC AACAGTATGGGCATTTCGCAGCCTACCGTGGTGTTCGTTTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATTTTGAACGTGCAAAA AAAGCTCCCAATCATCCAAAAAATTATTATCATGGATTCTAAAACGGATTACCAGGGATTTCAGTCGATGTACACGT TCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTTTTAATGAATACGATTTTGTGCCAGAGTCCTTCGATAGGGACAAGACAATT GCACTGATCATGAACTCCTCTGGATCTACTGGTCTGCCTAAAGGTGTCGCTCTGCCTCATAGAACTGCCTGCGTGAG ATTCTCGCATGCCAGAGATCCTATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATTTTAAGTGTTGTTCCATTCC ATCACGGTTTTGGAATGTTTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGTCGTCTTAATGTATAGATTTGAA GAAGAGCTGTTTCTGAGGAGCCTTCAGGATTACAAGATTCAAAGTGCGCTGCTGGTGCCAACCCTATTCTCCTTCTT CGCCAAAAGCACTCTGATTGACAAATACGATTTATCTAATTTACACGAAATTGCTTCTGGTGGCGCTCCCCTCTCTA AGGAAGTCGGGGAAGCGGTTGCCAAGAGGTTCCATCTGCCAGGTATCAGGCAAGGATATGGGCTCACTGAGACTACA TCAGCTATTCTGATTACACCCGAGGGGGATGATAAACCGGGCGCGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAA GGTTGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAATCAAAGAGGCGAACTGTGTGTGAGAGGTCCTATGATTA TGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGCCTTGATTGACAAGGATGGATGGCTACATTCTGGAGACATA GCTTACTGGGACGAAGACGAACACTTCTTCATCGTTGACCGCCTGAAGTCTCTGATTAAGTACAAAGGCTATCAGGT GGCTCCCGCTGAATTGGAATCCATCTTGCTCCAACACCCCAACATCTTCGACGCAGGTGTCGCAGGTCTTCCCGACG ATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGTTGTTGTTTTGGAGCACGGAAAGACGATGACGGAAAAAGAGATCGTGGAT TACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCGCGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGAAGTACCGAAAGGTCT TACCGGAAAACTCGACGCAAGAAAAATCAGAGAGATCCTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAA。
本发明技术方案包括 ： 构建 pGL3-CYCA-Luc 重组表达载体， 该载体含有上述核苷 酸序列。
本发明的技术方案包括 ： pGL3-CYCA-Luc 重组表达载体在以细胞周期 S 期为靶点 的抗肿瘤药物筛选中的应用。
本发明以包含人 cyclinA2 基因全长的 PBS 质粒为模板， 在 cyclinA2 基因两端 设计引物， 扩增 cyclinA2 cDNA 全长并克隆至 pGL3-control 载体 Luc 基因的 5’ 端， 形 成一种可表达融合蛋白的真核重组表达载体， 即“pGL3-CYCA-Luc”载体。 该载体转染至肿 瘤细胞后可表达融合蛋白 “CYCA-Luc” 。 体外实验证明该融合蛋白可通过泛素化依赖性途径 降解， 呈细胞周期依赖性变化并能用于监测 S 期特异性抗肿瘤药物作用效果。 本发明将在 筛选针对 S 期的抗肿瘤药物等领域中发挥重要作用。
下面对本发明内容作进一步的详述。
构建真核重组表达载体 pGL3-CYCA-Luc。 利用 Primer 软件设计引物， 以 PBS 质 粒为模板扩增 cyclinA2 cDNA 全长， 引物具体如下 ： Sense ： GCGCAAGCTTGCCACCATGTTGGGCAACTCTGCGC， 引物中加入 Kozak 序列以提高翻译 起始效率。
Anti-sense ： GCCAAGCTTGCAGATTTAGTGTCTCTGGTGGGTTG PCR 扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳， 在 1200 bp 位置可见明显条带。利用限制性 内切酶 Hind Ⅲ 分别酶切 PCR 产物和载体 pGL3-control 并回收产物。本实验中为防止载 体自连， 酶切后的载体进行去磷酸化处理。酶切产物回收后， 用 T4 DNA 连接酶在 4 ℃ 连 接过夜。转化大肠杆菌 DH5α， 在含抗生素 Amp 平板上筛选重组子， 通过酶切鉴定和测序确 定得到重组表达载体 pGL3-CYCA-Luc。本发明中重组表达载体具有以下基本结构 ： 启动子（SV40） 、 融合蛋白编码区 （cyclinA2-luciferase） 、 终止密码子 （TAA） 、 DNA 序列 （DNA 复制起 始点等） 顺序连接而成的双链环状 DNA 分子， 如图 1 所示。
将构建好的重组表达载体以脂质体法瞬时转染 U2OS 细胞， 通过 Western blot 鉴 定转染细胞株是否表达融合蛋白 CYCA-Luc。结果显示， 使用荧光素酶和 cyclinA2 的抗体 在 110 KD 位置均可发现特异性条带， 体外荧光素酶活性分析结果显示转染 pGL3-CYCA-Luc 质粒的细胞荧光素酶相对强度比转染 pcDNA3.1 质粒即对照组高 4000 倍左右， 表明 融合蛋白可在转染细胞株表达。随后利用 G418 筛选获得稳定转染株细胞， 命名为 “U2OS-CYCA-Luc” 。
在接下来得实验中， 通过细胞周期同步化方法进一步分析了融合蛋白 CYCA-Luc 是否随细胞周期变化。 本发明中 S 期同步化药物为 mimosine。 流式分析结果显示， mimosine 处理细胞 20 h 后， 随着释放时间的增加， S 期细胞比例逐渐增加。Westren bloot 和荧光素 酶活性分析结果显示， 随着 S 期细胞比例的增加 CYCA-Luc 表达和荧光素酶相对强度增加， 提示 CYCA-Luc 表达与 S 期细胞比例密切相关。
后期促进复合物 （anaphase-promoting complex/cyclosome， APC/C）在调控有丝 cdc20 分裂的过程中起到重要的作用。APC 在有丝分裂途径前中期被激活 , 通过泛素化依赖 性途径降解 cyclinA2。为确定融合蛋白是否呈泛素化依赖性降解， 本发明中使用 CDC20 小分子干扰 RNA 封闭 CDC20 表达， 以确定 CDC20 表达下调后是否可导致 CYCA-Luc 表 达的上调。将 CDC20 小分子干扰 RNA 以脂质体法转染 U2OS-CYCA-Luc 细胞后， 分别进 行荧光素酶活性分析和 Western blot 检测。结果表明， CDC20 小分子干扰 RNA 可使 U2OS-CYCA-Luc 细胞荧光素酶相对强度升高和 CYCA-Luc 表达上调， 而 NC（阴性对照） 则 无明显变化， 表明 CYCA-Luc 呈泛素化依赖性途径降解。
确定 CYCA-Luc 呈泛素依赖性途径降解后， 本发明随后验证了该融合蛋白是否可 以作为生物发光报告蛋白准确反映 S 期特异性抗肿瘤药物作用效果。使用目前临床常用的 S 期特异性药物如 5- 氟尿嘧啶 （5-FU） 和羟基喜树碱 （HCPT） 作用 U2OS-CYCA-Luc 细胞使其 发生 S 期阻滞， 通过荧光素酶活性分析和 western blot 检测确定是否可以引起细胞的荧光 素酶相对强度升高和 CYCA-Luc 表达上调。结果显示 5-FU 和 HCPT 可使 U2OS-CYCA-Luc 细胞 CYCA-Luc 表达上调和荧光素酶相对强度升高， 提示该蛋白可以用于监测 S 期特异 性抗肿瘤药物活性。
与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果 ： 通过基因工程技术将 S 期特异性蛋 白 cyclinA2 克隆于荧光素酶基因上游， 形成重组表达载体 pGL3-CYCA-Luc。 通过上述研究 工作， 将融合蛋白 CYCA-Luc 作为监测 S 期的生物发光报告蛋白。该报告蛋白可受泛素化 依赖性的蛋白体系调控， 可在培养的细胞株中通过光学信号变化准确反映 S 期特异性抗肿 瘤药物作用效果。 该发明应用活体小动物后， 利用活体成像系统可实现在体条件下实时、 反 复、 非侵袭性地研究 S 期特异性抗肿瘤药物， 从而避免传统方法中需要处死实验动物等诸 多局限。因此， 该发明不仅可以加速药物的研发速度， 快速优化新的治疗方案， 降低在研发 药物上所用动物的数量， 而且还可以对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估， 对 于 S 期特异性抗肿瘤药物的筛选及其作用机制研究具有重要意义。 附图说明图1： pGL3-CYCA-Luc 构建及酶切鉴定。其中 A: pGL3-CYCA-Luc 构建示意图 ； B: pGL3-CYCA-Luc 酶切结果。
图2： pGL3-CYCA-Luc 在 U2OS 细胞中表达。其中 A ： western blot 结果 ； B： 荧光素 酶活性分析结果。
图3： 细胞周期同步化分析。其中 A ： 流式分析结果 ； B： western blot 结果 ； C： 荧 光素酶活性分析结果。
图4： CDC20 小分子干扰实验结果。其中 A ： western blot 结果 ； B： 荧光素酶活性 分析结果。
图5： S 期特异性抗肿瘤药物作用实验。其中 A ： western blot 结果 ； B： 荧光素酶 活性分析。 具体实施方式
（一） 构建真核重组表达载体 pGL3-CYCA-Luc 1. 引物设计 利用 primer 软件设计一对引物。在上游引物 5’端加入保护碱基、 HindIII 酶切位点及 Kozak 序列， 下游引物 5’ 端加入保护碱基和 HindIII 酶切位点。整理 好的引物序列送宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司合成。 2.PCR 扩 增 目 的 片 段 反 应 体 系 50 µL， Premix ExTaq 25 µL ；模 板 （PBS-cyclinA2） 5 µL ； 引物 1 20 µm， 1.5 µL ； 引物 2 20 µm， 1.5 µL ； 灭菌水 17 µL。充分 混匀后， 在 PCR 仪上完成下列操作 ： 94℃ 5 min， 98℃ 10 s， 56℃ 30 s， 72℃ 1 min， 30 cycles。
3. 质粒及 PCR 产物的酶切与回收 总体系 20 µL， Hind Ⅲ 1 µL， 10 × Mbuffer 2 µL， PCR 产物或质粒 DNA<1 µg， 灭菌水补齐至 20 µL。
4. 线性质粒的去磷酸化反应 总体系 50 µL， DNA Fragments in TE Buffer 5 pmol， 10 × ALKaline， Phosphatase Buffer 2 µL， dH2O up to 50 µL， 37℃ 反应 30 min， DNA 回收试剂盒回收反应产物， 20 µL TE Buffer 溶解沉淀。
5.PCR 产 物 与 目 的 片 段 的 连 接 总 体 系 25 µL， T4 DNA 连 接 酶 1 µL， 10 × Mbuffer 2 µL， PCR 产物 0.3 pmol， pGL3-control 0.03 pmol， 灭菌水补齐至 25 µL， 4℃过 夜连接。
6. 转化至感受态细胞 将 -80 ℃ 下保存的 100 µL 感受态细胞置于冰上， 完全 解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮 ； 加入 1 µLpGL3-control 质粒， DNA 浓度为 0.5 µg/µL， 轻 轻混匀 ； 冰上放置 30 min ； 42 ℃ 水浴热激 90 s ； 冰上放置 5 min ； 加 1mL 无 Amp 的 LB 培养液， 37 ℃ 培养 60 min， 使细菌恢复正常生长状态 ； 室温下 4000 rpm 离心 5 min， 用 枪头吸掉 1 mL 上清液， 用剩余的培养液将细胞悬浮 ； 将细菌涂布在 Amp/LB 琼脂平板上， Amp 工作浓度 100 µg/mL ； 37 ℃ 正向放置 1 h， 待接种的液体吸收进琼脂后， 将平皿倒置 培养过夜。
7. 质粒的小量提取、 酶切鉴定及测序 详细步骤见 TaKaRa 公司 MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0 产品说明书。酶切步骤如下 ： 第一组 ： 总体系 20 μL， DNA 3 μL， 10 × Buffer 2 μL， 无菌水 15 μL ； 第二组 ： 总 体系 20 μL， DNA 3 μL， 10 × Buffer 2 μL， NheI1 μL， 14 μL 无菌水 ； 第三组 ： 总体系
20 μL， DNA 3 μL， 10 × Buffer 2 μL， NcoI1 μL， 14 μL 无菌水 ； 第四组 ： 总体系 20 μL， DNA 3 μL， 10 × Buffer 2 μL， NcoI1 μL， NheI1 μL， 13 μL 无菌水。轻轻混匀， 37 ℃ 酶切 2 h， 结果见图 1。
提取质粒送至公司测序， 测序结果显示 DNA 序列及插入方向正确， 表明成功构建 重组表达载体 pGL3-CYCA-Luc。
（二） 建立 U2OS-CYCA-Luc 稳定转染株细胞 将构建好的 pGL3-CYCA-Luc 质粒以脂质体法瞬时转染 U2OS 细胞， 具体方法为 ： 将 U2OS 细胞培养于六孔培养板至汇合 70% 左右 ； 根据 Lipofectamine 2000 的说明书加 8.0 μg pGL3-CYCA-Luc 质粒及 20 μL 的 Lipofectamine 2000 进行转染。转染 48 h 后消化细胞， RLB 裂解， 制备蛋白样品， 通过 Western blot 鉴定融合蛋白表达。结果显示， 使用荧光素酶和 cyclinA2 的抗体在 110 KD 位置均可发现特异性条带， 而未转染细胞则 未见条带， 表明融合蛋白已在稳定转染株细胞表达。体外荧光素酶活性分析结果显示稳定 转染株细胞荧光素酶表达活性比对照细胞高 4000 倍左右， 如图 2 所示。这些结果表明， 我 们构建的真核重组表达载体可在哺乳动物细胞中表达融合蛋白。
为获得稳定表达融合蛋白的细胞， 本发明中使用 1000 µg/mL 浓度的 G418 对 转染细胞进行了筛选。由于 pGL3-CYCA-Luc 质粒无 G418 抗性基因 Neo， 因此在转染 pGL3-CYCA-Luc 质粒同时需共转染 pcDNA3.1 质粒， 该质粒含 Neo 基因。 具体转染的方法 为： 首先， 在 EP 管中加入 500 µL 无血清培养基， 然后加入 15 µL Lipo 2000 （Invitrogen 公司） 转染试剂， 轻轻混匀后， 室温下静置 5 min。取 12 µg 质粒， 其中含有 pcDNA3.1 和 pGL3-CYCA-Luc 两种质粒， 二者比例为 1 ： 10， 加入以上的混合物中， 轻轻混匀。 室温下静置 20 min 后， 取以上混合物加入培养皿中， 置于 5％ CO2、 湿度 95％ 和 37℃ 条件下培养。 24 h 后， 把培养皿中的培养液换为含有 G418 的常规 DMEM 培养液进行筛选。 待对照细胞 即未转染质粒的细胞被全部被杀死后， 将细胞置于药物浓度为 800 µg/mL 的 DMEM 培养 液中继续培养。在上述条件下， 细胞能够持续生长， 表明稳定转染细胞株已被成功建立。建 立的细胞株用于进一步分析使用。
（三） 在培养细胞株研究融合蛋白 CYCA-Luc 是否报告 S 期。
1. 细胞周期同步化 在 60mm 的培养皿中加适量的 U2OS-CYCA-Luc 细胞， 将细胞 培养至指数生长期的早期， 密度约为 50% 左右 ； 弃掉培养基， 加入含 0.2 mmol mimosine （sigma 公司） 的培养基继续培养 20 h ； 弃掉含 mimosine 的培养基， 用 PBS 液洗 2 次， 换 普通培养基继续培养 ； 在更换培养基后的 0、 3、 6、 9、 12 h 各时间点收获细胞样品用于流式 分析细胞周期。
2. 流式分析细胞周期 将上述收获的细胞用 PBS 洗二遍 ； 用 70% 的冰浴酒精过 夜固定 ； 离心去乙醇， PBS 清洗一次 ； 每管细胞样品中加入 0.5 mL 碘化丙啶染色液 （碧云 天） ， 缓慢并充分重悬细胞沉淀， 37℃避光温浴 30 min。流式检测和分析。实验结果表明， 随着释放时间的延长， S 期细胞所占比例逐渐增加， 如图 3 所示。
3. 荧光素酶活性分析和 Western blot 检测 将上述收获的细胞用 PBS 洗二次后 转至 1mL EP 管中 ； 每个样品中加入 100 µL RLB 裂解液， 制备蛋白样品 ； BCA 法测定蛋白 浓度， 将蛋白浓度调至相等， 利用荧光发光仪 （lumat LB 9507， BERTHOCD 公司） 检测荧光素 酶相对活性及 Western blot 检测融合蛋白表达， 以确定该报告蛋白是否在 S 期积聚。结果显示， mimosine 处理细胞 20 h 后， 随着释放时间的延长荧光素酶相对强度和 CYCA-Luc 表达量均逐渐增加， 说明报告蛋白的表达的变化与 S 期细胞数量的变化相一致， 如图 3 所 示。
4. 确定 CYCA-Luc 是否受泛素化依赖性降解调控。
细胞周期进入有丝分裂期后， cyclinA2 被 APCcdc20， 即 E3 连接酶复合物降解， 所以这一降解的过程属泛素化依赖性。这一内容中主要探讨 CDC20 基因沉默后， 能否引 起 CYCA-Luc 重新积聚以确定本发明的融合蛋白 CYCA-Luc 降解途径是否依赖 APCcdc20 活 性。首先用 DEPC 水处理相关实验用品， 在 60 mm 培养皿中加入适量的 U2OS-CYCA-Luc 细胞 ； 根据 Lipofectamine2000（Invitrogen 公司） 的说明书加入 200 pmol siRNA 及 10 μL 的 Lipofectamine 2000 进行转染 ； 48 h 后用 RLB 裂解液裂解细胞 ； 利用 BCA 法测 蛋白浓度， 蛋白样品分两部分， 一部分用做荧光素酶活性检测， 一部分用做 western blot 分析。 结果显示， 利用 siRNA 干扰 CDC20 后， CYCA-Luc 的表达上调、 荧光素酶相对强度增 强， 表明 CYCA-Luc 通过 CDC20 介导的泛素化依赖性途径降解， 如图 4 所示。CDC20 siRNA 序列如下 ： Scramble siRNA: Sense 5’ -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’ Anti-Sense 5’ -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’ CDC20 siRNA: Sense 5’ -GGGAAUAUAUAUCCUCUGUTT-3’ Anti-Sense 5’ -ACAGAGGAUAUAUAUUCCCTT-3’ （四） 验证 S 期靶向药物是否诱导融合蛋白 CYCA-Luc 表达上调 为进一步确定本发明的融合蛋白 CYCA-Luc 是否可以作为生物发光报告蛋白用于筛 选细胞周期 S 期特异性药物， 本发明利用目前临床上使用的 S 期特异性药物， 如 5-FU 和 HCPT 处理 U2OS-CYCA-Luc 细胞， 并进行荧光素酶活性分析和 Western blot 检测， 以确定 S 期靶向药物对 CYCA-Luc 蛋白表达的影响。 M 期特异性药物紫杉醇 （PTX） 在这一实验中作 为阴性对照药物。 首先用 1 μg/mL 的 5-FU、 HCPT 或 50 nM 的 PTX 处理 U2OS-CYCA-Luc 细胞， 18 h 后收集细胞样品， 流式分析细胞周期， 检测两种药物对细胞周期分布的影响。 收 集的另一部分细胞利用 RLB 裂解液进行裂解， BCA 法测定蛋白浓度后进行荧光素酶活性 和 Western blot 检测。流式分析结果显示， 5-FU 和 HCPT 处理细胞 18 h 后， S 期细胞数 量明显增加， 而 PTX 则使 S 期细胞数量明显降低。 荧光素酶活性分析和 Western blot 检测 结果显示， 5-FU 和 HCPT 处理细胞 18 h 后可使荧光素酶相对强度增加和 CYCA-Luc 表达 上调， 而 PTX 则使荧光素酶相对强度降低和 CYCA-Luc 表达下调， 如图 5 所示。 上述结果 提示， 细胞周期 S 期特异性抗肿瘤药物作用 U2O-CYCA-Luc 细胞后可使融合蛋白 CYCA-Luc 表达上调和荧光素酶相对强度增加， 表明该融合蛋白可作为生物发光报告蛋白用于指示细 胞周期 S 期并用于细胞周期 S 期特异性抗肿瘤药物筛选。10102358905 A CN 102358921
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