1、技术领域
本发明涉及一种由水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素、苦参或其提取和丹参或其提取物制成的用于治疗肝炎的药物组合物，及其制备方法，属于医药技术领域。
2、背景技术
急慢性肝炎是临床多发病、常见病，尤其是七十年代以来病毒性肝炎的发生率居高不下，使其患病人群愈来愈大，如乙肝、丙肝等常见的病毒性肝炎已成为临床难治病，甚至已成为肝硬化、肝癌发病的主要诱因。由于本类疾病的病因较多，病毒转阴困难，病程较长，部分患者转归预后较差，给患者造成了巨大的身心痛苦。迄今为止，临床上用于治疗急慢性肝炎的药品较多，西医主要从抗病毒、调节免疫和保护肝功能等方面治疗，中医则从辨证施治入手治疗。从临床实际看，在改善肝功能方面中西药皆有一定疗效，但在缩短疗程，促进病毒转阴，预防肝硬化等方面，迄今的治疗药物尚不尽如人意。为肝病临床提供有效，高效，长效，安全可靠，标本兼治的新药，仍是迫切需要解决的问题。
水飞蓟宾为菊科植物水飞蓟(Silybum marianum Gaertn)果实提取分离加工而得到的。水飞蓟宾葡甲胺为水飞蓟宾与葡甲胺的加成物，属水飞蓟宾的水溶性衍生物，已收载入国家药品监督管理局国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第10册52页(国家药典委员会编)，其中规定按干燥品计算，含水飞蓟素葡甲胺不得少于96.0％；含水飞蓟宾葡甲胺(C25H22O10·C7H17NO5)不得少于75.0％。水飞蓟素为菊科植物水飞蓟(Silybum marianum(L)Gaertn)的果实经提取精制所得的松散粉末，已收载入国家药品监督管理局国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第7册30页(国家药典委员会编)，其中规定按干燥品计算，含水飞蓟素以水飞蓟宾计算，不得少于68％，含水飞蓟宾和异水飞蓟宾不得少于30％。水飞蓟宾葡甲胺具有保护及稳定肝细胞膜的作用，并能促进肝细胞再生，对药物性肝中毒、各种急慢性肝炎、初期肝硬化、脂肪肝有良好的疗效。
苦参为豆科植物苦参SopHora flavescens Ait.的干燥根，又名枯骨、草槐、地槐等，具有清热燥湿、杀虫、止痒、安神之功效。苦参具有抗肝损伤作用。苦参的主要有效成分为生物碱类，生物碱中含量最高的为苦参碱和氧化苦参碱。氧化苦参碱对大鼠贮脂细胞增殖和胶原合成有抑制作用。苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞有保护作用，可使丙氨酸转氨酶降低，肝脏病理变化明显减轻。苦参碱和氧化苦参碱的抗炎、免疫抑制、清除自由基、利尿和解毒等作用，是治疗各种肝损害、自身免疫性疾病及变态反应性疾病的药理学基础。
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效。现代药理学的研究表明，丹参具有改善微循环、抗血小板的聚集和血栓形成、降低血液粘度、抗氧化、保护脑组织缺血/再灌注损伤、增强耐缺氧能力、改善肾功能等药理作用。丹参抗肝炎作用机制与丹 参具有抗自由基过氧化损伤、促进损伤肝细胞的修复、抑制炎性因子释放、改善肝脏微循环、抑制胶原生成、促进病理沉积胶原的降解、抑制肝星状细胞(HSC)活化的药理作用有关。丹参水溶性成分主要是以丹参素为基本结构的酚酸类化合物，丹参总酚酸化合物具有很强的抗氧化作用，可以清除超氧阴离子和羟自由基，抑制脂质过氧化反应，进而减轻肝损伤。
目前利用水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素、苦参和丹参的相互作用，配伍组方，制备用于治疗肝炎的药物，尚未见报道。
3、发明内容
为了满足临床需要，更好地治疗肝炎，提高人民健康水平，本发明提供了一种新的药物组合物及其制备方法。
本发明的药物组合物主要由水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素、苦参和丹参制成，三者的重量配比为：水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素25～400份、苦参4000～64000份、丹参1000～90000份，优选为：水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素50～200份、苦参8000～32000份、丹参5000～45000份，最佳为：水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素100份、苦参16000份、丹参15000份。
本发明的药物组合物中的苦参和丹参可以用适宜的溶剂和方法制备得到提取物，总提取物再与水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素和药学上可接受的辅料混合制成任一制剂，总提取物中所含的主要有效成分为：苦参总碱和丹参总酚酸。总提取物中的主要有效成分的总含量不低于30％。
本发明药物组合物中的水飞蓟宾的衍生物优选为水飞蓟宾葡甲胺。
苦参可以用适宜的溶剂经过提取加工得到苦参总碱，其中的溶剂优选为酸水或乙醇，苦参总碱的提取方法可以为浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续提取法、树脂法中的一种或几种，也可参照文献方法制备。
以苦参总碱为主要有效成分的苦参的优选制备工艺如下：
取苦参药材，粉碎成粗粉，用0.2％盐酸渗漉至无生物碱反应为止，收集渗漉液，并通过已处理好的强酸型阳离子树脂，交换完毕后，将树脂用水洗至中性，干燥。用浓氨水碱化树脂，装入索氏提取器用氯仿连续回流提取至提取液无生物碱反应。氯仿提取液用无水硫酸钠脱水，减压回收氯仿，得稠膏状物。
通过本工艺制备的苦参总碱得率为2～5％，含苦参碱(C15H24N2O)和氧化苦参碱(C15H24N2O2)的总量不低于70％。
苦参还可由如下工艺制备，但不仅限于下述方法：
工艺一：取苦参药材，粉碎成粗粉，用95％乙醇浸泡5次，过滤浸出液，薄膜蒸发浓缩至相对密度为1.04～1.09，减压蒸馏除尽乙醇，加2倍体积的2％盐酸，充分搅拌，放置过夜，滤过，弃去沉淀物。滤液用乙醚洗涤，弃去乙醚液，滤液用氢氧化钠碱化至pH9～10，加氯化钠饱和，用氯仿萃取至无生物碱反应，减压蒸馏得棕色稠膏状物质。通过本工艺制备的苦参总碱得率不低于0.8％，含苦参碱(C15H24N2O)和氧 化苦参碱(C15H24N2O2)的总量不低于50％。
工艺二：取苦参药材，粉碎成粗粉，加2倍量浓氨水，湿润1小时，加氯仿浸泡4次，滤过，滤液减压回收氯仿，加2倍体积的2％盐酸，充分搅拌，放置过夜，滤过，弃去沉淀物。滤液用乙醚洗涤，弃去乙醚液，滤液用氢氧化钠碱化至pH 9～10，加氯化钠饱和，用氯仿萃取至无生物碱反应，减压蒸馏得棕色稠膏状物质。通过本工艺制备的苦参总碱得率不低于1.5％，含苦参碱(C15H24N2O)和氧化苦参碱(C15H24N2O2)的总量不低于65％。
丹参可以用适宜的溶剂经过提取加工得到丹参总酚酸，提取溶剂优选水或乙醇，丹参的提取方法可以为浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法或连续提取法。如可通过水提醇沉的方法制备得到丹参总酚酸，还可以根据文献方法制备。
以丹参总酚酸为主要有效成分的丹参的优选制备工艺如下：
取丹参，粉碎成粗粒，加水煎煮三次，第一次2小时，加水12倍量，第二、三次各1.5小时，加水10倍量，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.17～1.20(80℃)。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量为75％，第二次使含醇量为85％，各静置24h，回收乙醇至相对密度为1.17～1.20(80℃测)，喷雾干燥，即得。
通过本工艺制备的丹参提取物得率为1～3％，丹参总酚酸的含量不低于50％，丹酚酸B的含量不低于1.5％。
丹参还可通过下述工艺制备：
工艺一：取丹参，加水煎煮两次，各2小时，第一次加水12倍量，第二次加水10倍量，合并煎液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.17～1.20(80℃)，加乙醇沉淀使含醇量达75％，静置24h，回收乙醇至相对密度为1.23～1.28(80℃)，真空干燥(50℃)，即得。通过本工艺制备的丹参提取物得率2～4％，丹参总酚酸的含量不低于40％，丹酚酸B的含量不低于0.8％。
工艺二：取丹参，加85％乙醇回流2小时，滤过，滤液减压回收乙醇至稠膏；药渣加水(10倍量)煎煮1小时，滤过，滤液与上述稠膏合并，减压浓缩至适量，50℃真空干燥，粉碎，过筛，即得。通过本工艺制备的丹参提取物得率为3～5％，丹参总酚酸的含量不低于30％，丹酚酸B的含量不低于0.3％。
丹参提取物可以通过上述工艺制备，但不应将此理解为本发明药物组合物中丹参提取物仅限于上述工艺制备。
上述药物组合物，还可用苦参总碱代替苦参、丹参总酚酸代替丹参投料制得，按照提取物相对于药材的得率计算，其重量份数比为：
水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素25～400份、苦参总碱120～1920份、丹参总酚酸30～1800份；优选为：水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素50～200份、苦参总碱240～960份、丹参总酚酸100～900份；最优为：水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素100份、苦参总碱320～800份、丹参总酚酸150～450份。
上述药物组合物中，苦参总碱中苦参碱和氧化苦参碱的总含量优选为不低于50％，最好不低于70％；丹参总酚酸的含量优选为不低于30％，最好不低于50％，其中丹酚酸B的含量优选为不低于0.3％，最好不低于1.5％。苦参总碱和丹参总酚酸可以通过上述工艺制备。
苦参总碱除可用上述方法自制外，还可从市场购买或者购买后再精制。目前有多个厂家生产苦参总碱，如：牡丹江莲花湖制药责任有限公司(国药准字H23023277)、黑龙江恒久制药厂(国药准字H23023278)、宁夏紫荆花药业有限公司(国药准字H64020285)、宁夏博尔泰力药业股份有限公司(国药准字H64020287)，其标准均符合国家药品标准(WS-10001-(HD-1106)-2002)。
以上组成是按重量份作为配比的，在生产时可按照相应比例增大或减小，如大规模生产可以以千克为单位，或以吨为单位，小规模生产也可以以克为单位，重量可以增大或者减小，但各组成之间重量配比的比例不变。
以上重量配比的比例是经过科学筛选得到的，对于特殊病人，可以相应调整组成的比例，增加或者减少不超过100％。
本发明药物组分的用量是经过发明人进行大量摸索总结得出的，各组分用量在上述重量份范围内都具有较好疗效。
本发明提供了一种具有清热燥湿，活血化瘀功效的的新药，可用于该新药治疗急慢性肝炎，证属肝胆湿热症者。
本发明的药物组合物可以加一种或多种药学上可接受的载体，以口服、鼻吸入或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂，如片剂、胶囊、软胶囊、分散片、口服液、颗粒、咀嚼片、口崩片、滴丸、缓释片、缓释胶囊、控释片、控释胶囊，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油悬浮剂等，如水针、冻干粉针、无菌粉针、输液等。本组合物的优选的剂型是注射剂或口服制剂。
本发明的药物组合物可采用现有制药领域中的常规方法生产，需要的时候可以添加各种药学上可接受的载体。所述的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
本发明的药物组合物在制成注射剂时，为了增加其溶解度，可以加入聚山梨酯-80等增溶剂。输液中可以加入用于调节渗透压的等渗调节剂，例如，氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、乳酸钠、葡萄糖、木糖醇、山梨醇和右旋糖苷等，优选氯化钠或葡萄糖。粉针中可加入赋形剂，例如，甘露醇、葡萄糖等。
本发明的组合物具有以下优点：
(1)本发明提供了一种新的用于治疗肝炎的药物组合物，满足了临床需要。
(2)中医理论认为，肝炎的发病机理十分复杂，一般来说，常由湿热邪蕴结不解，日久伤及脏腑和气血，导致脾肾两虚等证，因此湿热毒邪是肝炎始动之因，肝经瘀滞是病变中心，针对这样的病因病机， 其治疗原则应当是清热燥湿，活血化瘀。本发明药物组合物中，水飞蓟宾葡甲胺功同水飞蓟，可清热解毒，舒肝利胆；苦参清热燥湿，丹参活血化瘀。三药配伍，共奏清热燥湿、舒肝利胆之功效。
(3)首次通过药效学实验研究证明：本发明的药物组合物对醋氨酚、D-氨基半乳糖、四氯化碳所致的小鼠急性肝损伤有显著的保护作用，可以显著抑制鸭乙肝病毒的繁殖，可显著对抗四氯化碳所致的大鼠肝纤维化。三药具有协同增效作用，疗效显著，产生了意想不到的效果。
(4)对本发明的药物组合物各配比进行了药效学研究，得出了本发明组合物的最优配比。
(5)本发明除水飞蓟宾葡甲胺外，苦参和丹参可以以药材或提取物投料，制备工艺简单，可以使不同批次药品间质量差异小，药品质量更均匀稳定。
(6)通过特殊安全性试验和稳定性实验证实，本发明的药物组合物注射剂安全稳定。
以下通过实验例来进一步阐述本发明所述药物的有益效果。水飞蓟宾葡甲胺、苦参和丹参的组合物以下简称SKD组合物。实验例中所用苦参总碱取自实施例1，丹参总酚酸取自实施例2。
实验例1 SKD组合物合并用药药效研究
供试品 0.9％生理盐水，自制；
水飞蓟宾葡甲胺注射液，自制，2ml：100mg；
苦参注射液，自制，5ml含苦参总碱481.6mg(相当于苦参16g)；
丹参注射液，自制；5ml含丹参总酚酸301.5mg(相当于丹参15g)；
SKD组合物注射液(水飞蓟宾葡甲胺+苦参+丹参)不同配比，自制，制备方法参照实施例3。
实验动物ICR小鼠，体重18～25g，雌雄各半。
实验方法取小鼠140只，随机分成14组，每组10只，组别见下表。空白对照组和模型组每日尾静脉注射生理盐水20ml/kg鼠重，每日1次，连续10d；给药组尾静脉注射给药，每日1次，剂量见下表，连续10d。空白对照组在最后一次尾静脉注射6h后腹腔注射生理盐水。模型组和给药组在最后一次尾静脉注射6h后腹腔注射醋氨酚300mg/kg鼠重，各组在腹腔注射生理盐水及醋氨酚16h后断头，取血液、肝脏，进行生化指标血清ALT(谷丙转氨酶)和肝组织LPO(过氧化脂质)的测试，结果见表1。
结论 与空白对照组相比，模型组ALT和LPO的活性显著升高，差异极显著(P＜0.01)，说明造模可靠。与模型组相比，水飞蓟宾葡甲胺组、苦参组、丹参组和SKD组合物各配比组ALT和LPO的活性明显降低(P＜0.05，P＜0.01)，说明各药均对醋氨酚所致小鼠肝损伤有保护作用。其中SKD组合物各配比组疗效更好(P＜0.01)，均优于单用水飞蓟宾葡甲胺、苦参和丹参，说明水飞蓟宾葡甲胺、苦参和丹参三药合用，有协同增效作用。SKD组合物各配比组中，以水飞蓟宾葡甲胺+苦参+丹参(100mg+16g+15g)组疗效最为显著。
表1 SKD组合物对醋氨酚损伤小鼠肝组织ALT和LPO的影响
与空白对照组比较，◇◇P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与水飞蓟宾葡甲胺组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；
与苦参组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与丹参组比较，
P＜0.05，P＜0.01。
实验例2 SKD组合物对D-氨基半乳糖致小鼠急性肝损伤的保护作用
供试品：0.9％生理盐水，自制；
水飞蓟宾葡甲胺注射液，自制，2ml：100mg；
SKD组合物注射液(水飞蓟宾葡甲胺+苦参+丹参100mg+16g+15g)，自制，制备方法参照实施例3。
实验动物：ICR小鼠，体重20～25g，雌雄各半。
实验方法：取小鼠60只，随机分为6组，分别为空白对照组、模型组、水飞蓟宾葡甲胺组、SKD组合物注射液低、中、高剂量组，每组10只。空白对照组和模型组每日尾静脉注射生理盐水20ml/kg鼠重，每日1次，连续10d；给药组尾静脉注射给药，每日1次，剂量见下表，连续10d。空白对照组在最后一次尾静脉注射1h后腹腔注射生理盐水，其余各组动物均腹腔注射100g/L的D-氨基半乳糖500g/kg。24h后处死动物取血，离心，取血清，全自动生化分析仪检测，检测指标为谷草转氨酶(AST)、血清白蛋白(ALB)。处死前动物断尾取血玻片法测定动物凝血时间(CT)。结果见表2。
结论：与空白对照组相比，模型组谷草转氨酶(AST)的活性极显著升高(P＜0.001)，血清白蛋白(ALB)数量极显著减少(P＜0.01)，凝血时间(CT)极显著延长(P＜0.001)，说明造模可靠。与模型组相比，水飞蓟宾葡甲胺组、SKD组合物各剂量组谷草转氨酶(AST)的活性明显降低(P＜0.05，P＜0.01)，血清白蛋白(ALB)数量极显著增加(P＜0.01)，凝血时间(CT)极显著缩短(P＜0.001)，说明各药均有保肝作用，对D-氨基半乳糖所致小鼠肝损伤有保护作用。SKD组合物各剂量组疗效均优于单用水飞蓟宾葡甲胺，说明水飞蓟宾葡甲胺、苦参和丹参三药合用，有协同增效作用。其中SKD组合物中、高剂量组保护作用更明显(P＜0.01)。
表2 SKD组合物对D-氨基半乳糖致急性肝损伤小鼠血清AST、ALB含量和凝血时间(CT)的影响
与空白对照组比较◇◇P＜0.01，◇◇◇P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与水飞蓟宾葡甲胺组比较，#P＜0.05，##P＜0.01
实验例3 SKD组合物对四氯化碳(CCl4)致小鼠急性肝损伤的保护作用
供试品：0.9％生理盐水，自制；
水飞蓟宾葡甲胺注射液，自制，2ml：100mg；
SKD组合物注射液(水飞蓟宾葡甲胺+苦参+丹参100mg+16g+15g)，自制，制备方法参照实施例3。
实验动物：ICR小鼠，体重22～26g，雌雄各半。
实验方法：取小鼠60只，随机分为6组，分别为空白对照组、模型组、水飞蓟宾葡甲胺组、SKD组合物注射液低、中、高剂量组，每组10只。空白对照组和模型组每日尾静脉注射生理盐水20ml/kg鼠重，每日1次，连续7d；给药组尾静脉注射给药，每日1次，剂量见下表，连续7d。空白对照组在最后一次尾静脉注射2h后腹腔注射花生油10ml/kg，其余各组动物均腹腔注射0.12％CCl4花生油溶液10ml/kg。16h后断头处死动物，取血清测试ALT、AST的值。断头取血后，立即剖腹取出肝脏、脾脏，吸去血液，剪去脂肪、系膜，精确称重肝脏、脾脏的重量，计算肝指数和脾指数。结果见表3。
表3 SKD组合物对CCl4所致急性肝损伤小鼠肝、脾指数和血清ALT、AST含量的影响
与空白对照组比较◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与水飞蓟宾葡甲胺组比较，#P＜0.05，##P＜0.01
结论：CCl4模型组小鼠肝指数、脾指数较正常对照组小鼠数值增高(P＜0.05)，CCl4模型组小鼠血清ALT、AST值较正常对照组小鼠数值极显著增高(P＜0.01)，说明小鼠注射CCl4花生油溶液后肝脏损伤，造模成功，模型稳定可靠。与模型组相比，SKD组合物中、高剂量组小鼠肝指数、脾指数降低(P＜0.05)，肝、脾肿大减轻，SKD组合物各剂量组血清ALT、AST值明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，说明本发明组合物对CCl4所 致急性肝损伤有保护作用。SKD组合物各剂量组疗效均优于单用水飞蓟宾葡甲胺，说明水飞蓟宾葡甲胺、苦参和丹参三药合用，有协同增效作用。其中中、高剂量组疗效更好(P＜0.05或P＜0.01)。
实验例4 SKD组合物抗鸭乙肝病毒作用
供试品：0.9％生理盐水，自制；
注射用阿昔洛韦，石药集团中诺药业(石家庄)有限公司；
水飞蓟宾葡甲胺注射液，自制，2ml：100mg；
SKD组合物注射液(水飞蓟宾葡甲胺+苦参+丹参100mg+16g+15g)，自制，制备方法参照实施例3。
实验动物：市售1日龄北京鸭；
DHBV(鸭乙型肝炎病毒)阳性血清，复旦大学医学院微生物学教研室。
实验方法：
动物模型 北京鸭经足静脉注射0.2mlDHBV阳性血清，7d后取血，分离血清，-20℃保存待检。
药物治疗 筛选出感染成功的阳性鸭36只，随机分为6组，每组6只，分别为空白对照组、水飞蓟宾葡甲胺组、阳性对照组、SKD组合物注射液低、中、高剂量组，每组6只。空白对照组每日灌胃生理盐水20ml/kg，每日2次，连续14d；给药组灌胃给药，每日2次，剂量见下表，连续14d。阳性药物作为治疗对照组，以阿昔洛韦(ACV)按100mg/kg灌胃，2次/d，给药2周。分别用于药前(1d)、用药第7天(T7)，用药第14天(T14)和停药后第7天(P7)。自鸭腿胫静脉取血，分离血清，-20℃保存待检。采用DHBV-DNADot Blot法，以杂交斑点吸光度值(A)作为标本DHBV-DNA水平值。结果见表4。
表4SKD组合物对DHBV-DNA的抑制作用
注：与空白对照组比较◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；与给药前相比@P＜0.05，@@P＜0.01。
结论：阳性对照(阿昔洛韦)组在给药后第7天和第14天，与给药前及与空白对照组比较，差异有极显著性(P＜0.01)，但停药后又显著升高，与给药前比较差异无显著性(P＞0.05)。不同剂量SKD组合物均对DHBV有抑制作用，且停药后无反跳，其中中、高剂量组抑制作用更为明显。SKD组合物各给药组疗效均优于单用水飞蓟宾葡甲胺，说明水飞蓟宾葡甲胺、苦参和丹参三药合用，有协同增效作用。
实验例5 SKD组合物抗大鼠肝纤维化作用
供试品：0.9％生理盐水，自制；
水飞蓟宾葡甲胺注射液，自制，2ml：100mg；
SKD组合物注射液(水飞蓟宾葡甲胺+苦参+丹参100mg+16g+15g)，自制，制备方法参照实施例3。
实验动物：Wistar大鼠，体重180～230g，雄性。
实验方法：取健康大鼠10只，皮下注射花生油3ml/kg，每日1次，共10周，作为对照组。肝纤维化模型组应用40％CCl4花生油溶液按3ml/kg皮下注射，每周2次，共8周，诱导肝纤维化模型。取肝纤维化模型大鼠60只，随机分为6组，分别为模型组、水飞蓟宾葡甲胺组、SKD组合物注射液低、中、高剂量组，每组10只。除对照组外，其余各组继续以40％CCl4花生油溶液3ml/kg皮下注射，每日1次。水飞蓟宾葡甲胺组、SKD组合物注射液低、中、高剂量组同时灌胃给药相应药物，剂量见下表。继续给药2周。10周后宰杀大鼠，无菌操作取血2ml，分离血清，-20℃保存，用放射免疫法检测肝纤维化指标：透明质酸(HA)和层粘蛋白(LN)；用生化法检测谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，采用全自动生化分析仪进行检测。结果见表5。
表5SKD组合物对CCl4所致肝纤维化大鼠的血清学指标的影响
与空白对照组比较◇◇◇P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与水飞蓟宾葡甲胺组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
结论：与空白对照组比较，模型组大鼠血清ALT、AST、HA、LN含量有极显著性差异(P＜0.001)，说明模型稳定可靠。水飞蓟宾葡甲胺、SKD组合物治疗后肝纤维化大鼠血清ALT和AST均低于模型组，差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，提示水飞蓟宾葡甲胺、SKD组合物有降酶和保护肝功能的作用；水飞蓟宾葡甲胺、SKD组合物治疗后血清HA和LN水平均显著低于模型组，差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)，提示水飞蓟宾葡甲胺、SKD组合物均可改善肝纤维化血清学指标，具有抗肝纤维化的作用。其中，SKD组合物组疗效优于水飞蓟宾葡甲胺组，提示水飞蓟宾葡甲胺、苦参和丹参三药合用，有协同增效作用。
实验例6 小鼠注射给药急性毒性实验
(1)实验方法
供试品：SKD组合物注射液，剂型：水针，规格：10ml，来源于实施例3；
受试动物：小鼠，每组雌雄各5只，雄性体重25～28g，雌性体重21～24g。
给药途径：静脉注射、腹腔注射。
观察项目：死亡数、一般状态、体重、剖检、半数致死剂量。
(2)实验结果
按照急性毒性实验要求进行预试，腹腔注射及静脉注射两给药途径皆无法测出药物的半数致死量，也未见明显的毒性反应，故进行一日内最大给药量实验。给药剂量：尾静脉注射SKD组合物注射液0.2ml/10g，腹腔注射SKD组合物注射液0.2ml/10g，一日2次。
死亡数：未出现死亡。
一般状态：未见异常变化。
体重：于给药前1天，给药日，给药后1、3、7、14天测量；未见异常变化。
剖检：心、肝、肺、肾等组织未见异常变化。
(3)结论
本实验中未出现死亡，推测SKD组合物注射液对雌雄小鼠静脉和腹腔注射给药的最大耐受量均为0.4ml/10g，相当于50kg体重人日最大用量20ml的100倍。表明本品低毒，安全性高。
实验例7 SKD组合物注射液稳定性实验
供试品：SKD组合物注射液，剂型：水针，规格：10ml，来源于实施例3；
考察项目：性状、pH值、澄明度。
长期稳定性实验方法及结果：将本品组合物置温度25℃±2℃、相对湿度60％±10％的条件下放置6个月、12个月，各项指标均无明显变化，实验结果表明本组合物注射液长期放置基本稳定。
4、具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。以下实施例中各剂型的辅料可以用药学上可接受的辅料替换，或者减少、增加。实施例3～12所用的苦参总碱取自实施例1，丹参总酚酸取自实施例2。
实施例1 苦参总碱的制备
取苦参药材，粉碎成粗粉，用0.2％盐酸渗漉至无生物碱反应为止，过滤渗漉液，并通过阳离子树脂，交换完毕后，将树脂洗至中性，干燥。用浓氨水碱化树脂，装入索氏提取器用氯仿连续回流提取至提取液无生物碱反应。氯仿提取液用无水硫酸钠脱水，减压回收氯仿，得稠膏状物。
鉴别
(1)取本品约10mg，加1％盐酸溶液10ml使溶解，滤过，滤液分置三支试管中，一管中加碘化铋钾实验生成红棕色沉淀；一管中加碘化汞钾试液，生成黄白色沉淀；另一管中加碘化钾碘实验，生成棕褐色沉淀。
(2)取本品适量，加乙醇制成每1ml含4mg的溶液，作为供试品溶液。另取苦参药材粉末0.5g，加氯仿25ml，浓氨试液0.3ml，放置过夜，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇0.5ml使溶解，作为对照药材溶液。 再取苦参碱和氧化苦参碱对照品适量，分别加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述四种溶液各2ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇-浓氨试夜(50∶6∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个斑点。
含量测定照高效液相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验用氨基键合硅胶为填充剂；以乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液(75∶10∶15)为流动相；检测波长为220nm。理论板数按氧化苦参碱峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备精密称取苦参碱对照品、氧化苦参碱对照品适量，分别加乙腈-无水乙醇(80∶20)溶解，制成每1ml含苦参碱0.05mg，氧化苦参碱0.15mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液0.5ml，精密加入三氯甲烷20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)30分钟，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5ml，通过中性氧化铝柱(100～200目，5g，内径1cm)，依次以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇(7∶3)各20ml洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣
加无水乙醇适量使溶解，并转移至10ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法分别精密吸取上述对照品溶液各5μl与供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
根据上述工艺制得三批苦参总碱，提取物得率和含量见下表。由结果可知，苦参总碱得率为2～5％，含量不低于70％。
表6苦参总碱的得率和含量
实施例2 丹参总酚酸的制备
取丹参，粉碎成粗粒，加水煎煮三次，第一次2小时，加水12倍量，第二、三次各1.5小时，加水10倍量，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.17～1.20(80℃)。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量为75％，第二次使含醇量为85％，各静置24h，回收乙醇至相对密度为1.17～1.20(80℃测)，喷雾干燥，即得。
鉴别
取本品0.2g，研细，加70％甲醇25ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加70％甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹酚酸B对照品，加70％甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱法测定，吸取上述两种溶液各5ul，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以甲苯-三氯甲烷-乙 酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。
供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
含量测定
总酚酸含量测定 比色法
对照品溶液的制备 精密称取于105℃干燥至恒重的原儿茶醛对照品1mg，加水溶解，定容至100ml。供试品溶液的制备精密称取样品50mg，置50ml容量瓶中，加水稀释至刻度精密量取0.1ml置25ml容量瓶中加乙醇5ml，加入0.3％十二烷基硫酸钠2ml，0.6％铁氰化钾-0.9％三氧化铁(临用前等量混合)1ml，如此暗处放置5min，加入0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，暗处放置20min后，置lena比色池中，72Onm处测定。
丹酚酸B的含量测定 高效液相色谱法
色谱条件与系统适用性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)为流动相；检测波长为286nm。理论塔板数按丹参素峰计算应不低于1500。
对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品适量，加75％甲醇制成每1ml含0.14mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备 取本品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，称定重量，加热回流1h，取出，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
表7丹参总酚酸的得率及丹参总酚酸和丹酚酸B的含量
根据上述工艺，制得丹参提取物三批样品，其含量和得率见上表。由结果可以看出，通过本工艺制备的丹参提取物得率为1～3％，丹参总酚酸的含量不低于50％，丹酚酸B的含量不低于1.5％。
实施例3 SKD组合物水针剂的制备
处方：
水飞蓟宾葡甲胺 100.0g
苦参总碱 481.6g(相当于苦参16kg)
丹参总酚酸 301.5g(相当于丹参15kg)
聚山梨酯80 50g
注射用水 加至10000ml
共制备 1000支
注：中药总提取物中主要有效成分的总含量为71.7％。
制备工艺：
1)提前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗。
2)将苦参总碱加入配液量30％的注射用水中加热搅拌溶解完全。将丹参总酚酸和水飞蓟宾葡甲胺加入少量注射用水，加入处方量的聚山梨酯80加热搅拌溶解。
3)合并上述溶液，补加注射用水至全量。
4)加入配液量0.1％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。
5)经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的pH值。
6)经0.45um的微孔滤膜精滤。
7)检查溶液的澄明度，半成品化验。
8)将溶液熔封于玻璃安瓿中。
9)100℃流通蒸汽灭菌30分钟。
10)趁热将样品放入0.01％的亚甲蓝溶液中检漏。
11)灯检，成品全检，包装入库。
实施例4 SKD组合物粉针剂的制备
处方：
水飞蓟宾葡甲胺 100.0g
苦参总碱 481.6g(相当于苦参16kg)
丹参总酚酸 301.5g(相当于丹参15kg)
聚山梨酯80 20g
甘露醇 400g
无菌注射用水 加至8000ml
共制备 1000支
注：中药总提取物中主要有效成分的总含量为71.7％。
制备工艺：
1)首先将配液用的容器具及抗生素玻璃瓶，胶塞等进行无菌处理。
2)按照处方量称取原辅料。
3)将苦参总碱加入配液量30％的注射用水中加热搅拌溶解完全。将丹参总酚酸和水飞蓟宾葡甲胺加入少量注射用水，加入处方量的聚山梨酯80加热搅拌溶解。合并上述溶液，补加无菌注射用水至全量。
4)加入配液量0.1％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。
5)经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的pH值。
6)经0.22um的微孔滤膜精滤。
7)检查溶液的澄明度，半成品化验。
8)分装于抗生素玻璃瓶中，半压塞。将样品放入冻干机中冷冻干燥。预冻-45℃5小时，低温真空干 燥-45℃～0℃20小时，然后升温至25℃真空干燥3小时。
9)冻干结束，压塞，轧盖。
10)成品全检，包装入库。
实施例5 SKD组合物氯化钠输液的制备
处方：
水飞蓟宾葡甲胺 100.0g
苦参总碱 481.6g(相当于苦参16kg)
丹参总酚酸 301.5g(相当于丹参15kg)
聚山梨酯80 20g
氯化钠 900g
注射用水 加至100000ml
共制备 1000瓶
注：中药总提取物中主要有效成分的总含量为71.7％。
制备工艺：
1)前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗。
2)将苦参总碱加入配液量30％的注射用水中加热搅拌溶解完全。将丹参总酚酸和水飞蓟宾葡甲胺加入少量注射用水，加入处方量的聚山梨酯80加热搅拌溶解。将氯化钠用适量注射用水溶解完全，合并上述溶液，补加注射用水至全量。
3)加入配液量0.1％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。
4)经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的pH值。
5)经0.45um的微孔滤膜精滤。
6)检查溶液的澄明度，半成品化验。
7)灌装于100ml的输液瓶中。
8)115℃热压灭菌30分钟。
9)灯检，成品全检，包装入库。
实施例6 SKD组合物葡萄糖输液的制备
处方：
水飞蓟宾葡甲胺 100.0g
苦参总碱 481.6g(相当于苦参16kg)
丹参总酚酸 301.5g(相当于丹参15kg)
聚山梨酯80 20g
葡萄糖 5000g
注射用水 加至100000ml
共制备 1000瓶
注：中药总提取物中主要有效成分的总含量为71.7％。
制备工艺：
1)提前一天处理配液用的管道及容器等，临用前再用新鲜的注射用水冲洗。
2)将苦参总碱加入配液量30％的注射用水中加热搅拌溶解完全。将丹参总酚酸和水飞蓟宾葡甲胺加入少量注射用水，加入处方量的聚山梨酯80加热搅拌溶解。合并上述溶液，补加注射用水至全量。将葡萄糖用配液量40％的注射用水溶解完全，加热煮沸15分钟。
3)合并上述溶液，补加注射用水至全量。
4)加入配液量0.1％的针用活性炭，加热搅拌15分钟。
5)经砂滤棒过滤脱炭。测定并调节溶液的pH值。
6)经0.45um的微孔滤膜精滤。
7)检查溶液的澄明度，半成品化验。
8)灌装于100ml的输液瓶中。
9)115℃热压灭菌30分钟。
10)灯检，成品全检，包装入库。
实施例7 SKD组合物片剂的制备
处方：
水飞蓟宾葡甲胺 100.0g
苦参总碱 481.6g(相当于苦参16kg)
丹参总酚酸 301.5g(相当于丹参15kg)
淀粉 50.0g
微晶纤维素 50.0g
2％HPMC水溶液 适量
硬脂酸镁 5.0g
羧甲淀粉钠 10.0g
共制备 2000片
注：中药总提取物中主要有效成分的总含量为71.7％。
制备工艺：
1)将苦参总碱、水飞蓟宾葡甲胺和丹参总酚酸分别粉碎过100目筛备用。
2)按照处方量称取原辅料。
3)将羟丙甲纤维素溶于水中制成2％的水溶液备用。
4)将水飞蓟宾葡甲胺、丹参总酚酸、苦参总碱、淀粉、微晶纤维素混合均匀，加入2％HPMC水溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材。
5)过20目筛制颗粒。
6)颗粒在60℃的条件下烘干。
7)干燥好的颗粒加入硬脂酸镁和羧甲淀粉钠，过18目筛整粒，混合均匀。
8)取样，半成品化验。
9)按照化验确定的片重压片。
10)成品全检，包装入库。
实施例8 SKD组合物胶囊剂的制备
处方：
水飞蓟宾葡甲胺 100.0g
苦参总碱 481.6g(相当于苦参16kg)
丹参总酚酸 301.5g(相当于丹参15kg)
淀粉 20.0g
微晶纤维素 60.0g
2％HPMC水溶液 适量
硬脂酸镁 5.0g
共制备 2000粒
注：中药总提取物中主要有效成分的总含量为71.7％。
制备工艺：
1)将苦参总碱、水飞蓟宾葡甲胺和丹参总酚酸分别粉碎过100目筛备用。
2)按照处方量称取原辅料。
3)将羟丙甲纤维素溶于水中制成2％的水溶液备用。
4)将水飞蓟宾葡甲胺、丹参总酚酸、苦参总碱、淀粉、微晶纤维素混合均匀，加入2％HPMC水溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材。
5)过20目筛制颗粒。
6)颗粒在60℃的条件下烘干。
7)干燥好的颗粒加入硬脂酸镁，过18目筛整粒，混合均匀。
8)取样，半成品化验。
9)按照化验确定的装量装入胶囊。
10)成品全检，包装入库。
实施例9 SKD组合物颗粒剂的制备
处方：
水飞蓟宾葡甲胺 100.0g
苦参总碱 481.6g(相当于苦参16kg)
丹参总酚酸 301.5g(相当于丹参15kg)
糖粉 600.0g
2％HPMC50％乙醇溶液 适量
共制备 1000包
注：中药总提取物中主要有效成分的总含量为71.7％。
制备工艺：
1)将蔗糖粉碎过100目筛备用。将苦参总碱、水飞蓟宾葡甲胺和丹参总酚酸分别粉碎过100目筛备用。
2)按照处方量称取原辅料。
3)将苦参总碱、水飞蓟宾葡甲胺、丹参总酚酸与糖粉以等量递加的方法混合均匀，加入2％HPMC50％乙醇溶液适量，搅拌均匀，制成适宜软材，
4)过20目筛制颗粒。
5)颗粒在60℃的条件下烘干。
6)干颗粒过18目筛整粒。
7)取样，半成品化验颗粒中主药的含量，确定装量。
8)包装，成品全检，包装入库。
实施例10 SKD组合物滴丸剂的制备
处方：
水飞蓟宾葡甲胺 100.0g
苦参总碱 481.6g(相当于苦参16kg)
丹参总酚酸 301.5g(相当于丹参15kg)
聚乙二醇6000 1000g
注：中药总提取物中主要有效成分的总含量为71.7％。
制备工艺：
将苦参总碱、水飞蓟宾葡甲胺和丹参总酚酸粉碎过100目筛后备用。将聚乙二醇6000在水浴中加热熔融，待全部熔融后加入苦参总碱、水飞蓟宾葡甲胺和丹参总酚酸，搅拌溶解，60目筛过滤，保持60℃滴入冷至10℃以下的液体石蜡中制成丸。
实施例11 SKD组合物软胶囊剂的制备
处方：
水飞蓟宾葡甲胺 100.0g
苦参总碱 481.6g(相当于苦参16kg)
丹参总酚酸 301.5g(相当于丹参15kg)
大豆油 300.0g
大豆磷脂 40g
蜂蜡 40g
共制备 2000粒
注：中药总提取物中主要有效成分的总含量为71.7％。
制备工艺：
将处方量的大豆油和大豆磷脂、蜂蜡加热熔融，混匀，放冷，加入水飞蓟宾葡甲胺、丹参总酚酸、苦 参总碱研匀，压制成软胶囊即可。
实施例12 SKD组合物软口服液体剂的制备
处方：
水飞蓟宾葡甲胺 100.0g
苦参总碱 481.6g(相当于苦参16kg)
丹参总酚酸 301.5g(相当于丹参15kg)
聚山梨酯80 20g
苯甲酸钠 15g
甜菊甙 20g
纯化水 加至10000ml
共制备 1000支
注：中药总提取物中主要有效成分的总含量为71.7％。
制备工艺
1)将苦参总碱加入配液量30％的水中加热搅拌溶解完全。将丹参总酚酸和水飞蓟宾葡甲胺加入少量水，加入处方量的聚山梨酯80加热搅拌溶解。合并上述溶液，补加纯化水至全量。
2)将苯甲酸钠和甜菊甙用配液量20％的水溶解完全。
3)合并上述两个溶液，补加水至全量。
4)过0.8um的微孔滤膜过滤。
5)半成品化验。
6)灌装。成品全检，包装入库。