一种用于治疗肝炎的药物组合物.pdf

1、(10)授权公告号 CN 1977887 B (45)授权公告日 2011.02.09 CN 1977887 B *CN1977887B* (21)申请号 200510045410.9 (22)申请日 2005.12.05 A61K 36/537(2006.01) A61K 31/357(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 31/12(2006.01) (73)专利权人 山东轩竹医药科技有限公司 地址 250101 山东省济南市高新开发区东辰 大街 2518 号 (72)发明人 黄振华 CN 1466984 A,2004.01.14, 权利要求 . (54) 发明

2、名称 一种用于治疗肝炎的药物组合物 (57) 摘要 本发明属于医药技术领域， 公开了一种药物 组合物及其制备方法， 该药物组合物主要由水飞 蓟宾或其衍生物或水飞蓟素、 苦参和丹参制成， 其重量配比为 ： 水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素 25 400 份、 苦参 4000 64000 份、 丹参 1000 90000 份。该组合物还可以由水飞蓟宾或其衍生 物或水飞蓟素、 苦参总碱和丹参总酚酸制成， 其重 量配比为 ： 水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素 25 400份、 苦参总碱1201920份、 丹参总酚酸30 1800 份。该药物组合物可以制成任何一种临床上 或药学上可接受的剂型。该药物组合物具有清

3、热 燥湿， 活血化瘀的功效， 可用于治疗急慢性肝炎。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 翟羽 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 17 页 CN 1977887 B1/1 页 2 1. 一种治疗肝炎的药物组合物， 其特征在于， 该组合物由下列原料药制成 ： 水飞蓟宾 葡甲胺、 苦参总碱和丹参总酚酸， 其重量配比为 ： 水飞蓟宾葡甲胺 25 400 份、 苦参总碱 120 1920 份、 丹参总酚酸 30 1800 份。 2. 如权利要求 1 所述的药物组合物， 其原料药的重量配比为 ： 水飞蓟宾葡甲胺 50 200 份、 苦参总碱

4、 240 960 份、 丹参总酚酸 100 900 份。 3. 如权利要求 2 所述的药物组合物， 其原料药的重量配比为 ： 水飞蓟宾葡甲胺 100 份、 苦参总碱 320 800 份、 丹参总酚酸 150 450 份。 4. 如权利要求 1-3 所述的任一药物组合物， 其特征在于， 所述的苦参总碱中苦参碱和 氧化苦参碱的总含量不低于 50 ； 丹参总酚酸的含量不低于 30， 其中丹酚酸 B 的含量不 低于 0.3。 5. 如权利要求 1-3 所述的任一药物组合物， 其特征在于该组合物可以与药学上可接受 的辅料混合制成任何一种临床上或药学上可接受的剂型。 权 利 要 求 书 CN 197788

5、7 B1/17 页 3 一种用于治疗肝炎的药物组合物 1、 技术领域 0001 本发明涉及一种由水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素、 苦参或其提取和丹参或其提 取物制成的用于治疗肝炎的药物组合物， 及其制备方法， 属于医药技术领域。 2、 背景技术 0002 急慢性肝炎是临床多发病、 常见病， 尤其是七十年代以来病毒性肝炎的发生率居 高不下， 使其患病人群愈来愈大， 如乙肝、 丙肝等常见的病毒性肝炎已成为临床难治病， 甚 至已成为肝硬化、 肝癌发病的主要诱因。由于本类疾病的病因较多， 病毒转阴困难， 病程较 长， 部分患者转归预后较差， 给患者造成了巨大的身心痛苦。迄今为止， 临床上用于治疗急 慢性

6、肝炎的药品较多， 西医主要从抗病毒、 调节免疫和保护肝功能等方面治疗， 中医则从辨 证施治入手治疗。从临床实际看， 在改善肝功能方面中西药皆有一定疗效， 但在缩短疗程， 促进病毒转阴， 预防肝硬化等方面， 迄今的治疗药物尚不尽如人意。为肝病临床提供有效， 高效， 长效， 安全可靠， 标本兼治的新药， 仍是迫切需要解决的问题。 0003 水飞蓟宾为菊科植物水飞蓟(Silybum marianum Gaertn)果实提取分离加工而得 到的。 水飞蓟宾葡甲胺为水飞蓟宾与葡甲胺的加成物， 属水飞蓟宾的水溶性衍生物， 已收载 入国家药品监督管理局国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第 10 册 52

7、 页 ( 国 家药典委员会编 )， 其中规定按干燥品计算， 含水飞蓟素葡甲胺不得少于 96.0 ； 含水飞 蓟宾葡甲胺 (C25H22O10C7H17NO5) 不得少于 75.0。水飞蓟素为菊科植物水飞蓟 (Silybum marianum(L)Gaertn) 的果实经提取精制所得的松散粉末， 已收载入国家药品监督管理局国 家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第 7 册 30 页 ( 国家药典委员会编 )， 其中规定 按干燥品计算， 含水飞蓟素以水飞蓟宾计算， 不得少于 68， 含水飞蓟宾和异水飞蓟宾不得 少于30。 水飞蓟宾葡甲胺具有保护及稳定肝细胞膜的作用， 并能促进肝细胞再生， 对药物

8、 性肝中毒、 各种急慢性肝炎、 初期肝硬化、 脂肪肝有良好的疗效。 0004 苦参为豆科植物苦参 SopHora flavescens Ait. 的干燥根， 又名枯骨、 草槐、 地槐 等， 具有清热燥湿、 杀虫、 止痒、 安神之功效。苦参具有抗肝损伤作用。苦参的主要有效成分 为生物碱类， 生物碱中含量最高的为苦参碱和氧化苦参碱。氧化苦参碱对大鼠贮脂细胞增 殖和胶原合成有抑制作用。苦参碱和氧化苦参碱对肝细胞有保护作用， 可使丙氨酸转氨酶 降低， 肝脏病理变化明显减轻。 苦参碱和氧化苦参碱的抗炎、 免疫抑制、 清除自由基、 利尿和 解毒等作用， 是治疗各种肝损害、 自身免疫性疾病及变态反应性疾病的

9、药理学基础。 0005 丹参为唇形科植物丹参 Salvia miltiorrhiza Bge. 的干燥根及根茎。有祛瘀止 痛、 活血通经、 清心除烦的功效。 现代药理学的研究表明， 丹参具有改善微循环、 抗血小板的 聚集和血栓形成、 降低血液粘度、 抗氧化、 保护脑组织缺血 / 再灌注损伤、 增强耐缺氧能力、 改善肾功能等药理作用。 丹参抗肝炎作用机制与丹 参具有抗自由基过氧化损伤、 促进损伤 肝细胞的修复、 抑制炎性因子释放、 改善肝脏微循环、 抑制胶原生成、 促进病理沉积胶原的 降解、 抑制肝星状细胞 (HSC) 活化的药理作用有关。丹参水溶性成分主要是以丹参素为基 本结构的酚酸类化合物，

10、 丹参总酚酸化合物具有很强的抗氧化作用， 可以清除超氧阴离子 说 明 书 CN 1977887 B2/17 页 4 和羟自由基， 抑制脂质过氧化反应， 进而减轻肝损伤。 0006 目前利用水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素、 苦参和丹参的相互作用， 配伍组方， 制 备用于治疗肝炎的药物， 尚未见报道。 3、 发明内容 0007 为了满足临床需要， 更好地治疗肝炎， 提高人民健康水平， 本发明提供了一种新的 药物组合物及其制备方法。 0008 本发明的药物组合物主要由水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素、 苦参和丹参制成， 三者的重量配比为 ： 水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素 25 400 份、 苦参 4000

11、 64000 份、 丹参 1000 90000 份， 优选为 ： 水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素 50 200 份、 苦参 8000 32000 份、 丹参 5000 45000 份， 最佳为 ： 水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素 100 份、 苦参 16000 份、 丹参 15000 份。 0009 本发明的药物组合物中的苦参和丹参可以用适宜的溶剂和方法制备得到提取物， 总提取物再与水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素和药学上可接受的辅料混合制成任一制剂， 总提取物中所含的主要有效成分为 ： 苦参总碱和丹参总酚酸。总提取物中的主要有效成分 的总含量不低于 30。 0010 本发明药物组合物中的水飞蓟宾的衍

12、生物优选为水飞蓟宾葡甲胺。 0011 苦参可以用适宜的溶剂经过提取加工得到苦参总碱， 其中的溶剂优选为酸水或乙 醇， 苦参总碱的提取方法可以为浸渍法、 渗漉法、 煎煮法、 回流提取法、 连续提取法、 树脂法 中的一种或几种， 也可参照文献方法制备。 0012 以苦参总碱为主要有效成分的苦参的优选制备工艺如下 ： 0013 取苦参药材， 粉碎成粗粉， 用 0.2盐酸渗漉至无生物碱反应为止， 收集渗漉液， 并 通过已处理好的强酸型阳离子树脂， 交换完毕后， 将树脂用水洗至中性， 干燥。用浓氨水碱 化树脂， 装入索氏提取器用氯仿连续回流提取至提取液无生物碱反应。氯仿提取液用无水 硫酸钠脱水， 减压回

13、收氯仿， 得稠膏状物。 0014 通过本工艺制备的苦参总碱得率为 2 5， 含苦参碱 (C15H24N2O) 和氧化苦参碱 (C15H24N2O2) 的总量不低于 70。 0015 苦参还可由如下工艺制备， 但不仅限于下述方法 ： 0016 工艺一 ： 取苦参药材， 粉碎成粗粉， 用 95乙醇浸泡 5 次， 过滤浸出液， 薄膜蒸发浓 缩至相对密度为 1.04 1.09， 减压蒸馏除尽乙醇， 加 2 倍体积的 2盐酸， 充分搅拌， 放置 过夜， 滤过， 弃去沉淀物。滤液用乙醚洗涤， 弃去乙醚液， 滤液用氢氧化钠碱化至 pH9 10， 加氯化钠饱和， 用氯仿萃取至无生物碱反应， 减压蒸馏得棕色稠膏

14、状物质。 通过本工艺制备 的苦参总碱得率不低于 0.8， 含苦参碱 (C15H24N2O) 和氧 化苦参碱 (C15H24N2O2) 的总量不低 于 50。 0017 工艺二 ： 取苦参药材， 粉碎成粗粉， 加2倍量浓氨水， 湿润1小时， 加氯仿浸泡4次， 滤过， 滤液减压回收氯仿， 加 2 倍体积的 2盐酸， 充分搅拌， 放置过夜， 滤过， 弃去沉淀物。 滤液用乙醚洗涤， 弃去乙醚液， 滤液用氢氧化钠碱化至 pH 9 10， 加氯化钠饱和， 用氯仿萃 取至无生物碱反应， 减压蒸馏得棕色稠膏状物质。通过本工艺制备的苦参总碱得率不低于 1.5， 含苦参碱 (C15H24N2O) 和氧化苦参碱 (

15、C15H24N2O2) 的总量不低于 65。 说 明 书 CN 1977887 B3/17 页 5 0018 丹参可以用适宜的溶剂经过提取加工得到丹参总酚酸， 提取溶剂优选水或乙醇， 丹参的提取方法可以为浸渍法、 渗漉法、 煎煮法、 回流提取法或连续提取法。如可通过水提 醇沉的方法制备得到丹参总酚酸， 还可以根据文献方法制备。 0019 以丹参总酚酸为主要有效成分的丹参的优选制备工艺如下 ： 0020 取丹参， 粉碎成粗粒， 加水煎煮三次， 第一次2小时， 加水12倍量， 第二、 三次各1.5 小时， 加水 10 倍量， 合并煎液， 滤过， 滤液减压浓缩至相对密度为 1.17 1.20(80

16、)。加 乙醇沉淀二次， 第一次使含醇量为 75， 第二次使含醇量为 85， 各静置 24h， 回收乙醇至 相对密度为 1.17 1.20(80测 )， 喷雾干燥， 即得。 0021 通过本工艺制备的丹参提取物得率为13， 丹参总酚酸的含量不低于50， 丹 酚酸 B 的含量不低于 1.5。 0022 丹参还可通过下述工艺制备 ： 0023 工艺一 ： 取丹参， 加水煎煮两次， 各 2 小时， 第一次加水 12 倍量， 第二次加水 10 倍 量， 合并煎液， 过滤， 滤液浓缩至相对密度为 1.17 1.20(80 )， 加乙醇沉淀使含醇量达 75， 静置 24h， 回收乙醇至相对密度为 1.23

17、1.28(80 )， 真空干燥 (50 )， 即得。通过 本工艺制备的丹参提取物得率 2 4， 丹参总酚酸的含量不低于 40， 丹酚酸 B 的含量不 低于 0.8。 0024 工艺二 ： 取丹参， 加85乙醇回流2小时， 滤过， 滤液减压回收乙醇至稠膏 ； 药渣加 水 (10 倍量 ) 煎煮 1 小时， 滤过， 滤液与上述稠膏合并， 减压浓缩至适量， 50真空干燥， 粉 碎， 过筛， 即得。通过本工艺制备的丹参提取物得率为 3 5， 丹参总酚酸的含量不低于 30， 丹酚酸 B 的含量不低于 0.3。 0025 丹参提取物可以通过上述工艺制备， 但不应将此理解为本发明药物组合物中丹参 提取物仅限

18、于上述工艺制备。 0026 上述药物组合物， 还可用苦参总碱代替苦参、 丹参总酚酸代替丹参投料制得， 按照 提取物相对于药材的得率计算， 其重量份数比为 ： 0027 水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素 25 400 份、 苦参总碱 120 1920 份、 丹参总酚 酸 30 1800 份 ； 优选为 ： 水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素 50 200 份、 苦参总碱 240 960 份、 丹参总酚酸 100 900 份 ； 最优为 ： 水飞蓟宾或其衍生物或水飞蓟素 100 份、 苦参总 碱 320 800 份、 丹参总酚酸 150 450 份。 0028 上述药物组合物中， 苦参总碱中苦参碱和氧化苦参

19、碱的总含量优选为不低于 50， 最好不低于 70； 丹参总酚酸的含量优选为不低于 30， 最好不低于 50， 其中丹酚 酸 B 的含量优选为不低于 0.3， 最好不低于 1.5。苦参总碱和丹参总酚酸可以通过上述 工艺制备。 0029 苦参总碱除可用上述方法自制外， 还可从市场购买或者购买后再精制。目前有多 个厂家生产苦参总碱， 如 ： 牡丹江莲花湖制药责任有限公司 ( 国药准字 H23023277)、 黑龙 江恒久制药厂 ( 国药准字 H23023278)、 宁夏紫荆花药业有限公司 ( 国药准字 H64020285)、 宁夏博尔泰力药业股份有限公司 ( 国药准字 H64020287)， 其标准

20、均符合国家药品标准 (WS-10001-(HD-1106)-2002)。 0030 以上组成是按重量份作为配比的， 在生产时可按照相应比例增大或减小， 如大规 模生产可以以千克为单位， 或以吨为单位， 小规模生产也可以以克为单位， 重量可以增大或 说 明 书 CN 1977887 B4/17 页 6 者减小， 但各组成之间重量配比的比例不变。 0031 以上重量配比的比例是经过科学筛选得到的， 对于特殊病人， 可以相应调整组成 的比例， 增加或者减少不超过 100。 0032 本发明药物组分的用量是经过发明人进行大量摸索总结得出的， 各组分用量在上 述重量份范围内都具有较好疗效。 0033 本

21、发明提供了一种具有清热燥湿， 活血化瘀功效的的新药， 可用于该新药治疗急 慢性肝炎， 证属肝胆湿热症者。 0034 本发明的药物组合物可以加一种或多种药学上可接受的载体， 以口服、 鼻吸入或 肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。 用于口服时， 可将其制成常规的固体制剂， 如片剂、 胶囊、 软胶囊、 分散片、 口服液、 颗粒、 咀嚼片、 口崩片、 滴丸、 缓释片、 缓释胶囊、 控释 片、 控释胶囊， 制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆等 ； 用于肠胃外给药 时， 可将其制成注射用的溶液、 水或油悬浮剂等， 如水针、 冻干粉针、 无菌粉针、 输液等。 本组 合物的优选的剂型是注射

22、剂或口服制剂。 0035 本发明的药物组合物可采用现有制药领域中的常规方法生产， 需要的时候可以添 加各种药学上可接受的载体。所述的载体包括药学领域常规的稀释剂、 赋形剂、 填充剂、 粘 合剂、 湿润剂、 崩解剂、 吸收促进剂、 表面活性剂、 吸附载体、 润滑剂等。 0036 本发明的药物组合物在制成注射剂时， 为了增加其溶解度， 可以加入聚山梨酯 -80 等增溶剂。输液中可以加入用于调节渗透压的等渗调节剂， 例如， 氯化钠、 氯化钾、 氯化镁、 氯化钙、 乳酸钠、 葡萄糖、 木糖醇、 山梨醇和右旋糖苷等， 优选氯化钠或葡萄糖。粉针中可加 入赋形剂， 例如， 甘露醇、 葡萄糖等。 0037 本

23、发明的组合物具有以下优点 ： 0038 (1) 本发明提供了一种新的用于治疗肝炎的药物组合物， 满足了临床需要。 0039 (2) 中医理论认为， 肝炎的发病机理十分复杂， 一般来说， 常由湿热邪蕴结不解， 日 久伤及脏腑和气血， 导致脾肾两虚等证， 因此湿热毒邪是肝炎始动之因， 肝经瘀滞是病变中 心， 针对这样的病因病机， 其治疗原则应当是清热燥湿， 活血化瘀。本发明药物组合物中， 水飞蓟宾葡甲胺功同水飞蓟， 可清热解毒， 舒肝利胆 ； 苦参清热燥湿， 丹参活血化瘀。 三药配 伍， 共奏清热燥湿、 舒肝利胆之功效。 0040 (3) 首次通过药效学实验研究证明 ： 本发明的药物组合物对醋氨酚

24、、 D- 氨基半乳 糖、 四氯化碳所致的小鼠急性肝损伤有显著的保护作用， 可以显著抑制鸭乙肝病毒的繁殖， 可显著对抗四氯化碳所致的大鼠肝纤维化。 三药具有协同增效作用， 疗效显著， 产生了意想 不到的效果。 0041 (4) 对本发明的药物组合物各配比进行了药效学研究， 得出了本发明组合物的最 优配比。 0042 (5) 本发明除水飞蓟宾葡甲胺外， 苦参和丹参可以以药材或提取物投料， 制备工艺 简单， 可以使不同批次药品间质量差异小， 药品质量更均匀稳定。 0043 (6) 通过特殊安全性试验和稳定性实验证实， 本发明的药物组合物注射剂安全稳 定。 0044 以下通过实验例来进一步阐述本发明所

25、述药物的有益效果。水飞蓟宾葡甲胺、 苦 参和丹参的组合物以下简称SKD组合物。 实验例中所用苦参总碱取自实施例1， 丹参总酚酸 说 明 书 CN 1977887 B5/17 页 7 取自实施例 2。 0045 实验例 1 SKD 组合物合并用药药效研究 0046 供试品 0.9生理盐水， 自制 ； 0047 水飞蓟宾葡甲胺注射液， 自制， 2ml ： 100mg ； 0048 苦参注射液， 自制， 5ml 含苦参总碱 481.6mg( 相当于苦参 16g) ； 0049 丹参注射液， 自制 ； 5ml 含丹参总酚酸 301.5mg( 相当于丹参 15g) ； 0050 SKD 组合物注射液 (

26、 水飞蓟宾葡甲胺 + 苦参 + 丹参 ) 不同配比， 自制， 制备方法参 照实施例 3。 0051 实验动物 ICR 小鼠， 体重 18 25g， 雌雄各半。 0052 实验方法取小鼠 140 只， 随机分成 14 组， 每组 10 只， 组别见下表。空白对照组和 模型组每日尾静脉注射生理盐水 20ml/kg 鼠重， 每日 1 次， 连续 10d ； 给药组尾静脉注射给 药， 每日 1 次， 剂量见下表， 连续 10d。空白对照组在最后一次尾静脉注射 6h 后腹腔注射生 理盐水。模型组和给药组在最后一次尾静脉注射 6h 后腹腔注射醋氨酚 300mg/kg 鼠重， 各 组在腹腔注射生理盐水及醋氨

27、酚16h后断头， 取血液、 肝脏， 进行生化指标血清ALT(谷丙转 氨酶 ) 和肝组织 LPO( 过氧化脂质 ) 的测试， 结果见表 1。 0053 结论 与空白对照组相比， 模型组 ALT 和 LPO 的活性显著升高， 差异极显著 (P 0.01)， 说明造模可靠。与模型组相比， 水飞蓟宾葡甲胺组、 苦参组、 丹参组和 SKD 组合物 各配比组 ALT 和 LPO 的活性明显降低 (P 0.05， P 0.01)， 说明各药均对醋氨酚所致小 鼠肝损伤有保护作用。其中 SKD 组合物各配比组疗效更好 (P 0.01)， 均优于单用水飞蓟 宾葡甲胺、 苦参和丹参， 说明水飞蓟宾葡甲胺、 苦参和丹

28、参三药合用， 有协同增效作用。SKD 组合物各配比组中， 以水飞蓟宾葡甲胺 + 苦参 + 丹参 (100mg+16g+15g) 组疗效最为显著。 0054 表 1 SKD 组合物对醋氨酚损伤小鼠肝组织 ALT 和 LPO 的影响 0055 0056 与空白对照组比较， P 0.01 ； 与模型组比较，*P 0.05，*P 0.01 ； 与水飞蓟 宾葡甲胺组比较， #P 0.05，#P 0.01 ； 0057 与苦参组比较， P0.05，P0.01 ； 与丹参组比较，P0.05，P0.01。 说 明 书 CN 1977887 B6/17 页 8 0058 实验例 2 SKD 组合物对 D- 氨基

29、半乳糖致小鼠急性肝损伤的保护作用 0059 供试品 ： 0.9生理盐水， 自制 ； 0060 水飞蓟宾葡甲胺注射液， 自制， 2ml ： 100mg ； 0061 SKD 组合物注射液 ( 水飞蓟宾葡甲胺 + 苦参 + 丹参 100mg+16g+15g)， 自制， 制备方 法参照实施例 3。 0062 实验动物 ： ICR 小鼠， 体重 20 25g， 雌雄各半。 0063 实验方法 ： 取小鼠60只， 随机分为6组， 分别为空白对照组、 模型组、 水飞蓟宾葡甲 胺组、 SKD 组合物注射液低、 中、 高剂量组， 每组 10 只。空白对照组和模型组每日尾静脉注 射生理盐水 20ml/kg 鼠重

30、， 每日 1 次， 连续 10d ； 给药组尾静脉注射给药， 每日 1 次， 剂量见 下表， 连续10d。 空白对照组在最后一次尾静脉注射1h后腹腔注射生理盐水， 其余各组动物 均腹腔注射 100g/L 的 D- 氨基半乳糖 500g/kg。24h 后处死动物取血， 离心， 取血清， 全自动 生化分析仪检测， 检测指标为谷草转氨酶 (AST)、 血清白蛋白 (ALB)。处死前动物断尾取血 玻片法测定动物凝血时间 (CT)。结果见表 2。 0064 结论 ： 与空白对照组相比， 模型组谷草转氨酶 (AST) 的活性极显著升高 (P 0.001)， 血清白蛋白 (ALB) 数量极显著减少 (P 0

31、.01)， 凝血时间 (CT) 极显著延长 (P 0.001)， 说明造模可靠。与模型组相比， 水飞蓟宾葡甲胺组、 SKD 组合物各剂量组谷草转 氨酶 (AST) 的活性明显降低 (P 0.05， P 0.01)， 血清白蛋白 (ALB) 数量极显著增加 (P 0.01)， 凝血时间 (CT) 极显著缩短 (P 0.001)， 说明各药均有保肝作用， 对 D- 氨基半乳 糖所致小鼠肝损伤有保护作用。 SKD组合物各剂量组疗效均优于单用水飞蓟宾葡甲胺， 说明 水飞蓟宾葡甲胺、 苦参和丹参三药合用， 有协同增效作用。其中 SKD 组合物中、 高剂量组保 护作用更明显 (P 0.01)。 0065

32、表 2 SKD 组合物对 D- 氨基半乳糖致急性肝损伤小鼠血清 AST、 ALB 含量和凝血时 间 (CT) 的影响 0066 0067 与空白对照组比较P 0.01， P 0.001 ； 与模型组比较，*P 0.05，*P 0.01 ； 与水飞蓟宾葡甲胺组比较， #P 0.05，#P 0.01 0068 实验例 3 SKD 组合物对四氯化碳 (CCl4) 致小鼠急性肝损伤的保护作用 0069 供试品 ： 0.9生理盐水， 自制 ； 0070 水飞蓟宾葡甲胺注射液， 自制， 2ml ： 100mg ； 0071 SKD 组合物注射液 ( 水飞蓟宾葡甲胺 + 苦参 + 丹参 100mg+16g+

33、15g)， 自制， 制备方 法参照实施例 3。 0072 实验动物 ： ICR 小鼠， 体重 22 26g， 雌雄各半。 说 明 书 CN 1977887 B7/17 页 9 0073 实验方法 ： 取小鼠60只， 随机分为6组， 分别为空白对照组、 模型组、 水飞蓟宾葡甲 胺组、 SKD 组合物注射液低、 中、 高剂量组， 每组 10 只。空白对照组和模型组每日尾静脉注 射生理盐水 20ml/kg 鼠重， 每日 1 次， 连续 7d ； 给药组尾静脉注射给药， 每日 1 次， 剂量见下 表， 连续 7d。空白对照组在最后一次尾静脉注射 2h 后腹腔注射花生油 10ml/kg， 其余各组 动物

34、均腹腔注射 0.12 CCl4花生油溶液 10ml/kg。16h 后断头处死动物， 取血清测试 ALT、 AST的值。 断头取血后， 立即剖腹取出肝脏、 脾脏， 吸去血液， 剪去脂肪、 系膜， 精确称重肝脏、 脾脏的重量， 计算肝指数和脾指数。结果见表 3。 0074 表 3 SKD 组合物对 CCl4 所致急性肝损伤小鼠肝、 脾指数和血清 ALT、 AST 含量的影 响 0075 0076 与空白对照组比较P0.05， P0.01 ； 与模型组比较，*P0.05，*P0.01 ； 与水飞蓟宾葡甲胺组比较， #P 0.05，#P 0.01 0077 结论 ： CCl4模型组小鼠肝指数、 脾指数

35、较正常对照组小鼠数值增高 (P 0.05)， CCl4模型组小鼠血清 ALT、 AST 值较正常对照组小鼠数值极显著增高 (P 0.01)， 说明小 鼠注射 CCl4花生油溶液后肝脏损伤， 造模成功， 模型稳定可靠。与模型组相比， SKD 组合物 中、 高剂量组小鼠肝指数、 脾指数降低 (P 0.05)， 肝、 脾肿大减轻， SKD 组合物各剂量组血 清 ALT、 AST 值明显降低 (P 0.05 或 P 0.01)， 说明本发明组合物对 CCl4所 致急性肝 损伤有保护作用。SKD 组合物各剂量组疗效均优于单用水飞蓟宾葡甲胺， 说明水飞蓟宾葡 甲胺、 苦参和丹参三药合用， 有协同增效作用。

36、其中中、 高剂量组疗效更好 (P 0.05 或 P 0.01)。 0078 实验例 4 SKD 组合物抗鸭乙肝病毒作用 0079 供试品 ： 0.9生理盐水， 自制 ； 0080 注射用阿昔洛韦， 石药集团中诺药业 ( 石家庄 ) 有限公司 ； 0081 水飞蓟宾葡甲胺注射液， 自制， 2ml ： 100mg ； 0082 SKD 组合物注射液 ( 水飞蓟宾葡甲胺 + 苦参 + 丹参 100mg+16g+15g)， 自制， 制备方 法参照实施例 3。 0083 实验动物 ： 市售 1 日龄北京鸭 ； 0084 DHBV( 鸭乙型肝炎病毒 ) 阳性血清， 复旦大学医学院微生物学教研室。 0085

37、 实验方法 ： 0086 动物模型 北京鸭经足静脉注射 0.2mlDHBV 阳性血清， 7d 后取血， 分离血 清， -20保存待检。 说 明 书 CN 1977887 B8/17 页 10 0087 药物治疗 筛选出感染成功的阳性鸭 36 只， 随机分为 6 组， 每组 6 只， 分别为空白 对照组、 水飞蓟宾葡甲胺组、 阳性对照组、 SKD 组合物注射液低、 中、 高剂量组， 每组 6 只。空 白对照组每日灌胃生理盐水20ml/kg， 每日2次， 连续14d ； 给药组灌胃给药， 每日2次， 剂量 见下表， 连续 14d。阳性药物作为治疗对照组， 以阿昔洛韦 (ACV) 按 100mg/k

38、g 灌胃， 2 次 /d， 给药 2 周。分别用于药前 (1d)、 用药第 7 天 (T7)， 用药第 14 天 (T14) 和停药后第 7 天 (P7)。 自鸭腿胫静脉取血， 分离血清， -20保存待检。采用 DHBV-DNADot Blot 法， 以杂交斑点吸 光度值 (A) 作为标本 DHBV-DNA 水平值。结果见表 4。 0088 表 4SKD 组合物对 DHBV-DNA 的抑制作用 0089 0090 注 ： 与空白对照组比较P 0.05， P 0.01 ； 与给药前相比 P 0.05，P 0.01。 0091 结论 ： 阳性对照 ( 阿昔洛韦 ) 组在给药后第 7 天和第 14

39、天， 与给药前及与空白对 照组比较， 差异有极显著性 (P 0.01)， 但停药后又显著升高， 与给药前比较差异无显著性 (P 0.05)。不同剂量 SKD 组合物均对 DHBV 有抑制作用， 且停药后无反跳， 其中中、 高剂量 组抑制作用更为明显。 SKD组合物各给药组疗效均优于单用水飞蓟宾葡甲胺， 说明水飞蓟宾 葡甲胺、 苦参和丹参三药合用， 有协同增效作用。 0092 实验例 5 SKD 组合物抗大鼠肝纤维化作用 0093 供试品 ： 0.9生理盐水， 自制 ； 0094 水飞蓟宾葡甲胺注射液， 自制， 2ml ： 100mg ； 0095 SKD 组合物注射液 ( 水飞蓟宾葡甲胺 +

40、苦参 + 丹参 100mg+16g+15g)， 自制， 制备方 法参照实施例 3。 0096 实验动物 ： Wistar 大鼠， 体重 180 230g， 雄性。 0097 实验方法 ： 取健康大鼠 10 只， 皮下注射花生油 3ml/kg， 每日 1 次， 共 10 周， 作为对 照组。肝纤维化模型组应用 40 CCl4花生油溶液按 3ml/kg 皮下注射， 每周 2 次， 共 8 周， 诱导肝纤维化模型。取肝纤维化模型大鼠 60 只， 随机分为 6 组， 分别为模型组、 水飞蓟宾葡 甲胺组、 SKD 组合物注射液低、 中、 高剂量组， 每组 10 只。除对照组外， 其余各组继续以 40 C

41、Cl4花生油溶液3ml/kg皮下注射， 每日1次。 水飞蓟宾葡甲胺组、 SKD组合物注射液低、 中、 高剂量组同时灌胃给药相应药物， 剂量见下表。继续给药 2 周。10 周后宰杀大鼠， 无菌操作 取血 2ml， 分离血清， -20保存， 用放射免疫法检测肝纤维化指标 ： 透明质酸 (HA) 和层粘蛋 白(LN) ； 用生化法检测谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)， 采用全自动生化分析仪进行 检测。结果见表 5。 0098 表 5SKD 组合物对 CCl4所致肝纤维化大鼠的血清学指标的影响 说 明 书 CN 1977887 B9/17 页 11 0099 0100 与空白对照组比较P 0

42、.001 ； 与模型组比较， *P 0.05，*P 0.01 ； 与水飞 蓟宾葡甲胺组比较， #P 0.05，#P 0.01。 0101 结论 ： 与空白对照组比较， 模型组大鼠血清 ALT、 AST、 HA、 LN 含量有极显著性差异 (P 0.001)， 说明模型稳定可靠。水飞蓟宾葡甲胺、 SKD 组合物治疗后肝纤维化大鼠血清 ALT 和 AST 均低于模型组， 差异具有显著性 (P 0.05 或 P 0.01)， 提示水飞蓟宾葡甲胺、 SKD 组合物有降酶和保护肝功能的作用 ； 水飞蓟宾葡甲胺、 SKD 组合物治疗后血清 HA 和 LN 水平均显著低于模型组， 差异具有显著性 (P 0.

43、05 或 P 0.01)， 提示水飞蓟宾葡甲胺、 SKD 组合物均可改善肝纤维化血清学指标， 具有抗肝纤维化的作用。其中， SKD 组合物组疗 效优于水飞蓟宾葡甲胺组， 提示水飞蓟宾葡甲胺、 苦参和丹参三药合用， 有协同增效作用。 0102 实验例 6 小鼠注射给药急性毒性实验 0103 (1) 实验方法 0104 供试品 ： SKD 组合物注射液， 剂型 ： 水针， 规格 ： 10ml， 来源于实施例 3 ； 0105 受试动物 ： 小鼠， 每组雌雄各 5 只， 雄性体重 25 28g， 雌性体重 21 24g。 0106 给药途径 ： 静脉注射、 腹腔注射。 0107 观察项目 ： 死亡数

44、、 一般状态、 体重、 剖检、 半数致死剂量。 0108 (2) 实验结果 0109 按照急性毒性实验要求进行预试， 腹腔注射及静脉注射两给药途径皆无法测出药 物的半数致死量， 也未见明显的毒性反应， 故进行一日内最大给药量实验。给药剂量 ： 尾静 脉注射 SKD 组合物注射液 0.2ml/10g， 腹腔注射 SKD 组合物注射液 0.2ml/10g， 一日 2 次。 0110 死亡数 ： 未出现死亡。 0111 一般状态 ： 未见异常变化。 0112 体重 ： 于给药前 1 天， 给药日， 给药后 1、 3、 7、 14 天测量 ； 未见异常变化。 0113 剖检 ： 心、 肝、 肺、 肾等

45、组织未见异常变化。 0114 (3) 结论 0115 本实验中未出现死亡， 推测 SKD 组合物注射液对雌雄小鼠静脉和腹腔注射给药的 最大耐受量均为 0.4ml/10g， 相当于 50kg 体重人日最大用量 20ml 的 100 倍。表明本品低 毒， 安全性高。 0116 实验例 7 SKD 组合物注射液稳定性实验 0117 供试品 ： SKD 组合物注射液， 剂型 ： 水针， 规格 ： 10ml， 来源于实施例 3 ； 0118 考察项目 ： 性状、 pH 值、 澄明度。 说 明 书 CN 1977887 B10/17 页 12 0119 长期稳定性实验方法及结果 ： 将本品组合物置温度 2

46、5 2、 相对湿度 60 10的条件下放置 6 个月、 12 个月， 各项指标均无明显变化， 实验结果表明本组合物注射 液长期放置基本稳定。 4、 具体实施方式 0120 以下通过实施例形式的具体实施方式， 对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内 容所实现的技术均属于本发明的范围。 以下实施例中各剂型的辅料可以用药学上可接受的 辅料替换， 或者减少、 增加。实施例 3 12 所用的苦参总碱取自实施例 1， 丹参总酚酸取自 实施例 2。 0121 实施例 1 苦参总碱的制备 0122 取苦参药材， 粉碎成粗粉， 用 0.

47、2盐酸渗漉至无生物碱反应为止， 过滤渗漉液， 并 通过阳离子树脂， 交换完毕后， 将树脂洗至中性， 干燥。 用浓氨水碱化树脂， 装入索氏提取器 用氯仿连续回流提取至提取液无生物碱反应。氯仿提取液用无水硫酸钠脱水， 减压回收氯 仿， 得稠膏状物。 0123 鉴别 0124 (1)取本品约10mg， 加1盐酸溶液10ml使溶解， 滤过， 滤液分置三支试管中， 一管 中加碘化铋钾实验生成红棕色沉淀 ； 一管中加碘化汞钾试液， 生成黄白色沉淀 ； 另一管中 加碘化钾碘实验， 生成棕褐色沉淀。 0125 (2) 取本品适量， 加乙醇制成每 1ml 含 4mg 的溶液， 作为供试品溶液。另取苦参药 材粉末

48、0.5g， 加氯仿25ml， 浓氨试液0.3ml， 放置过夜， 滤过， 滤液蒸干， 残渣加乙醇0.5ml使 溶解， 作为对照药材溶液。 再取苦参碱和氧化苦参碱对照品适量， 分别加乙醇制成每 1ml 含2mg的溶液， 作为对照品溶液。 吸取上述四种溶液各2ul， 分别点于同一硅胶G薄层板上， 以氯仿-甲醇-浓氨试夜(5063)为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以碘化铋钾试液。 供 试品色谱中， 在与对照药材相应的位置上， 显相同颜色的斑点 ； 在与对照品色谱相应的位置 上， 显相同颜色的两个斑点。 0126 含量测定照高效液相色谱法 (中国药典 2000 年版一部附录 VID) 测定。 0127 色谱条件与系统适用性试验用氨基键合硅胶为填充剂 ； 以