一种脑炎病毒蛋白及其编码基因与应用 【技术领域】
本发明涉及一种脑炎病毒蛋白及其编码基因与应用。背景技术 脑炎是由病毒直接侵犯或由病毒或其他异种蛋白引发的超敏反应所致的大脑急 性炎症性疾病。脑炎可以是病毒性感染原发的临床表现， 或者是继发的临床表现， 引起原 发的脑炎的病毒有脊髓灰质炎病毒， 埃可病毒、 柯萨奇病毒等流行性病毒， 或散发性的通过 蚊子、 蜱等节肢动物传播的黄病毒属的森林脑炎和批膜病毒科甲病毒属的东方马脑炎病毒 等。
甲病毒为披膜病毒科 (Togaviridae) 甲病毒属 (Alphavirus) 成员， 以蚊蜱等吸血 昆虫为传播媒介， 可引起多种人畜共患传染病。 近年来， 国外已对多株甲病毒部分或全部序 列测序。国内对这类病毒的分子生物学研究亦取得一定的结果。已有的研究结果表明 ： 该 病毒属中和抗体决定簇主要集中在结构蛋白 E1 和 E2 等糖蛋白上， 其中 E2 蛋白上所占比例 更高。加之近年来腺病毒载体因具有安全性好、 宿主范围广、 感染效率高等多种优点， 被广 泛用于基因治疗和基因工程疫苗研究， 为此我们分析比较了多株甲病毒核苷酸序列， 人工 合成了同源性较高的 3kb 的核苷酸， 利用腺病毒载体构建重组基因工程疫苗， 为预防和治 疗疾病奠定了基础。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与脑炎病毒疫苗相关蛋白及其编码基因。
本发明提供的蛋白 QE， 人工合成， 是如下 1) 或 2) 的蛋白 ：
1) 由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白 ；
2) 将序列 2 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添 加且具有相同功能的由 1) 衍生的蛋白质。
序列表中的序列 2 由 982 个氨基酸残基组成， 所述一个或几个氨基酸残基的取代 和 / 或缺失和 / 或添加为不超过 10 个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加。
上述蛋白质 QE 的编码基因也是本发明保护的范围， 所述编码基因为如下 1)-4) 中 任一所示的基因 ：
1) 序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ；
2) 序列表中序列 1 自 5’ 末端第 1-2946 位核苷酸所示的 DNA 分子 ；
3) 在严格条件下与 1) 或 2) 限定的 DNA 分子杂交且具有相同功能的 DNA 分子 ；
4) 与 1) 或 2) 限定的 DNA 序列至少具有 90％同源性且具有相同功能的 DNA 分子。
含有上述编码基因的重组载体、 转基因细胞系、 重组菌、 表达盒或重组病毒也是本 发明保护的范围。
所述重组载体为 pAdeasy-1 和重组穿梭质粒经过同源重组得到的 ； 所述重组穿梭 质粒是在载体 pShuttle-CMV 的 KpnI 和 HindIII 酶切位点间插入所述编码基因得到的。所述重组病毒为重组腺病毒 ； 所述重组腺病毒为将上述蛋白的编码基因转染宿主 细胞获得的重组腺病毒。
所述宿主细胞为真核细胞， 优选为离体的哺乳动物细胞， 尤其优选为 HEK-293 细 胞。
本发明的另一个目的是提供一种疫苗。
本发明提供的疫苗， 其活性成分为如下任意一种 ：
1) 所述的蛋白 ； 2) 所述编码基因 ； 3) 所述重组腺病毒。
上述重组腺病毒在制备疫苗中的应用也是本发明保护的范围。
所述疫苗为脑炎病毒疫苗。
上述重组腺病毒在制备提高 IFN-γ 活性的增强剂中的应用也是本发明保护的范 围。
本发明的实验证明， 从脑炎病毒克隆出 QE 通过转染 HEK-293 细胞而组装成携带有 目标抗原基因的重组腺病毒 vAd-QE。重组腺病毒 vAd-QE 感染 293 细胞能有效表达目的蛋 白； 通过滴鼻途径接种 BalB/C 小鼠， 利用间接免疫荧光技术检测特异性抗体水平， 结果表 明， 所构建的重组腺病毒虽然产生特异性抗体的时间和维持的水平有所不同， 但均产生了 较好体液免疫反应， 为进一步开展免疫保护实验提供了重要的数据支持。由于病毒在机体 内极微量的蛋白表达即可激起免疫反应， 因此构建的携带有脑炎病毒结构基因的重组腺病 毒 vAd-QE， 有希望成为脑炎基因工程疫苗的候选疫苗株。 附图说明
图 1 为 pAdtrack-QE 酶切鉴定图 图 2 为重组质粒 Pac I 酶切和 PCR 鉴定具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
东部马脑炎病毒 (Eastern Equine Encephalomyelitis virus)(HE Jing ； CHANG GuoHui ； WU Jin Song ； LI ZhongDuo ； ZHU QingYu ： Cloning and expression of E2 gene of eastern equine encephalomyelitis virus.Bulletin of The Academy of Military Medical Sciences.2002.02. 公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究 所获得。)
HEK-293 细胞 (Invitrogen 公司产品， Cat.No.R750-07) ； 实验所需限制性内切 酶分别购自 TaKaRa 和 Biolabs 公司 ； 脂质体 Lipofectamin 2000 购自 Invitrogen 公司 ； Platinum pfx Taqase 购自 Invitrogen 公司。
实施例 1、 重组腺病毒 (vAd-QE) 的获得
1、 含有目的基因 pAdtrack-QE 的构建及鉴定
根据东部马脑炎病毒 (Eastern Equine Encephalomyelitis virus)(NC-001547) 的基因组序列， 突变序列中的多个位点， 设计出序列表中的序列 1， 人工合成出序列 1。
设计引物扩增编码 QE 蛋白的基因， 引物序列 ( 引物分别含有 KpnI 和 HindIII 酶切位点 ) 见下 ：
QE-F ： 5’ ACGGggtaccATGGCATCACTAGTGACCACCATGTGT-3’
QE-R ： 5’ ACCCaagcttTGCCAATTGCTGCTGTATTC-3’
以人工合成出序列 1 的 DNA 为模板， 利用 QE-F 和 QE-R 引物对进行 PCR 反应， 得到 的 PCR 产物经 1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定， 得到了预期大小一致的片段， 约为 3Kb。
经测序， 该 PCR 产物具有序列表中的序列 1 自 5’ 末端第 1-2967 位核苷酸， 将该 PCR 产物的基因命名 QE， 其 OFR 为序列 1 的自 5’ 末端第 1-2946 位核苷酸， 该基因编码的蛋 白命名为 QE， 该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 2， 序列 2 由 982 个氨基酸残基组成。
回收 PCR 产物， 对 PCR 产物进行加 “A” 处理， 处理后的 PCR 样品与 pMD-18T 载体 (TaKaRa 公司产品， Code ： D101A.Lot CK3201A) 相连， 转化 DH5a 感受态细胞， 挑取阳性菌落 提取质粒后测序验证， 结果为该质粒为将序列表中序列 1 的自 5’ 末端第 1-2967 位核苷酸 插入 pMD-18T 得到的， 命名为 pTQE。
用 KpnI 和 HindIII 双酶切重组质粒 pTQE 和质粒 pShuttle-CMV(Invitrogen 公 司产品， Catalog#240007)， 酶切产物分别用凝胶回收试剂盒切胶回收， 并在 T4 DNA 连接 酶作用下于 16 ℃连接过夜， 连接产物转化大肠杆菌 DH10B(Invitrogen 公司产品， Cat. No.18290-015) 后挑选阳性克隆， 提取质粒进行测序， 结果为该质粒为将序列表中序列 1 的 自 5’ 末端第 1-2967 位核苷酸插入 pShuttle-CMV 的 KpnI 和 HindIII 酶切位点间得到的载 体， 命名为 pAdtrack-QE。
将 pAdtrack-QE 进行酶切验证， 酶切产物经过 1％ DNA 凝胶电泳。
结 果 见 图 1 所 示， 其 中 1、 DL2000(Marker 条 带 分 别 为 2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp 和 100bp ； 2、 KpnI+HindIII 消 化 pAdtrack-QE ； 3、 EcoRII+EcoRV 消 化 pAdtrack-QE ； 4、 SalI+XbaI 消化 pShuttle-CMV ； 5、 DL15000(Marker 条带分别为 15000bp、 10000bp、 7500bp、 2500bp、 1000bp 和 250bp)， 从图中看出， 泳道 1 酶切后的产物显示两条电 泳带 ： 一条为质粒载体带， 大小 9Kb， 另一条为克隆的目的基因带， 大小约为 3Kb， 与相应的 PCR 扩增产物大小一致， 进一步表明已成功的将 QE 基因 ( 序列表中的序列 1 自 5’ 末端第 1-2967 位核苷酸 ) 克隆至质粒 pShuttle-CMV 得到 pAdtrack-QE。
2、 重组腺病毒载体的构建
菌 BJ5183 购自上海杰美基因医药科技有限公司， 货号为 ： GMS12223.2。
将腺病毒骨架质粒 pAdeasy-1(Invitrogen 公司产品， Catalog#240005， 含有 GFP 报告基因 ) 经过 PacI( 购自 Biolabs 公司， 货号为 ： R05647S) 酶切后， 转入宿主菌 BJ5183 中， 得到含有腺病毒骨架质粒 pAdeasy-1 的宿主菌 BJ5183。
将上述 pAdtrack-QE 和穿梭质粒 pShuttle-CMV 分别用 PmeI( 购自 Biolabs 公司， 货号为 ： R0560S) 经 37℃充分消化， 使用 Gel Extraction kit 试剂盒 ( 购自 OMGEA 公司， 货 号为 ： D2500-01) 回收线性化的 pAdtrack-QE 和 pShuttle-CMV。
将线性化的质粒 pAdtrack-QE 电转化到含有腺病毒骨架质粒 pAdeasy-1 的宿主菌 BJ5183 感受态细胞中， 由于大肠杆菌 BJ5183 具有 Sm 抗性， pAdeasy-1 具有 Amp 抗性， 而重 组质粒 pAdtrack-QE 和穿梭载体质粒 pShuttle-CMV 具有 Kan 抗性， 在重组过程中穿梭质粒 上的 Kan 抗性取代了 pAdeasy-1 上的 Amp 抗性， 因此根据 Kan 和 Sm 双重抗性来筛选阳性克 隆， 得到的阳性克隆。提取转入线性化的质粒 pAdtrack-QE 的阳性克隆的质粒进行 PacI 酶切鉴定， 1％ DNA 凝胶电泳结果见图 2A 所示， 其中 1 ： DL15000Marker 2 ： pAdTrack-QE 3 ： 阳性克隆质粒 4： pShuttle-CMV 5 ： pAdeasy-1。从图中可以看出， 泳道 3 酶切后产生两个片度， 小片度大 小为 4.5Kb 左右， 含有复制子和卡那霉素抗性基因， 大片度为含有目的基因 QE 的病毒骨架， 大小约 36Kb( 病毒骨架大小约 33.5Kb 而目的基因 QE 3Kb)， 将该重组质粒命名为重组质粒 pAd-QE ； 泳道 2 重组穿梭质粒 pAdTack-QE 经过 Pac Ⅰ酶切后， 产生 2 个片段， 其中一个含有 目的基因 QE 约 9Kb， 另一个片段含有穿梭质粒 pShuttle-CMV 上的复制子和卡那霉素抗性基 因大小约 3Kb。
提取转入线性化的质粒 pAdtrack-QE 的阳性克隆的质粒进行 PCR 鉴定， 引物为 QE-F、 QE-R( 请核实 )， 结果见图 2B ： 1： DL15000Marker 2 ： pShuttle-CMV 3 ： pAdTrack-QE4 ： pAd-QE 5 ： pAdeasy-1， 可以看出， 重组质粒 pAd-QE 可扩增出与预期的目的片度 3Kb， 进一步 说明已经成功构建携带有目的基因 QE 的重组腺病毒骨架质粒 pAd-QE。
3、 组装成重组腺病毒
将 HEK-293 细胞接种到 6 孔板中， 37 ℃培养， 细胞生长至 60 ％ -70 ％， 用脂质体 Lipofectamin 2000( 购自 Invitrogen 公司 ) 介导重组腺病毒骨架质粒 pAd-QE 转染入细胞 中， 转染完成 7-10 天后， 收集细胞， 经 3 轮反复冻融， 离心收集上清液， 即为含有目的基因的 重组腺病毒 vAd-QE。转染实验按照说明书进行， 培养 7-10 天， 定期在荧光显微镜下检测是 否产生荧光， 判断转染是否成功， 由于该重组病毒上含有绿色荧光蛋白 (GFP) 的报告基因， 因此可以说明一旦有荧光就表示转染成功。
4、 重组腺病毒 vAd-QE 的扩增及目的蛋白的表达
1) 重组腺病毒 vAd-QE 的扩增
将上述 3 获得的转染完成 7-10 天后， 收集细胞， 经 3 轮反复冻融， 离心收集上清 液， 即为重组腺病毒 vAd-QE， 进行下一代扩增， 连续扩增 3 代， 第二次收集上清液， 比第一次 数量增多。
2) 目的蛋白的表达
取 200ul 上述获得的第二次收集的上清液 ( 重组腺病毒 vAd-QE， 病毒的浓度为 6 LgTCID50/0.2ml ＝ 8.0) 感染 5x10 的 HEK-293 细胞， 4 天后， 收集细胞。细胞经处理后进行 SDS-PAGE 电泳。结果 ： 经 SDS 电泳， 得到大小为 110KD 的蛋白 (QE 蛋白 )， 与预期蛋白的大 小一致。说明重组腺病毒有效的介导 QE 在细胞中表达。
采用同样的方法将上述线性化的 pShuttle-CMV 和 pAdeasy-1 共同转入宿主菌 BJ5183 感受态细胞中， 得到重组腺病毒载体， 记作 pAd-GFP ； 将 pAd-GFP 转染 HEK-293 细胞， 获得阴性对照腺病毒 vAd-GFP。对照腺病毒 vAd-GFP 中无 QE 蛋白表达 ；
实施例 2、 重组腺病毒 (vAd-QE) 的滴鼻接种中和抗体测定
6-7 周龄的 BALB/c 小鼠随机分为 3 组， 分别为 vAd-GFP 对照组、 vAd-QE 免疫组和 PBS 对照组， 每组 20 只小鼠。
vAd-GFP 对 照 组 ： 拭 鼻 方 式 感 染 20ul 由 实 施 例 1 获 得 对 照 腺 病 毒 8 vAd-GFP(10 pfu)。
vAd-QE 免 疫 组 ： 拭 鼻 方 式 感 染 20ul 由 实 施 例 1 获 得 的 重 组 腺 病 毒 (vAd-QE) 8 (10 pfu)。PBS 对照组 ： 拭鼻方式感染 20ulPBS 溶液 (0.01M/L pH7.2)
一、 血清和淋巴细胞检测
将 3 个小组在第一次免疫后的第 4 周加强免疫一次。在免疫后每间隔一周时间通 过尾静脉采集小鼠血液， 离心后分别收集血清和淋巴细胞沉淀。
1、 间接免疫荧光试验测定免疫小鼠血清中病毒的抗体反应
用东部马脑炎病毒 (Eastern Equine Encephalomyelitis virus) 感染的 HEK-293 制备抗原片， 制备的方法如下所述 ：
实验前准备 ： 把抗原片摆放在抗原架上， 每个架上排放 2 排， 1 排 4 个， 完毕后用罩 子盖上防止灰尘的进入。之后按照下面步骤进行 ：
1) 待 75cm2 方瓶的 HEK-293 细胞生长至 80％左右的时候， 用东部马脑炎病毒 2ml 感染细胞 1 小时后， 吸出吸附液， 补加新鲜的细胞维持液， 放入培养箱中培养 ；
2) 当细胞出现细胞病变的时候 ( 约 25％ -50％ )， 按照细胞传代的方法消化细胞， 用适量体积的培养液 ( 含有 10％胎牛血清的 DMEM 细胞生长液， 具体配方 ： 向 500mlDMEM 液 体中加入 50ml 胎牛血清、 100X Antibiotic-Antimycotic、 100X NEAA、 100ulHEPES， 之后用 实验室配制的经过 0.22um 滤膜过滤除菌的 7.5％ ( 质量百分含量 )NaHCO3 调节溶液的 pH 值至 7.0-7.2， 上述液体均为 GIBCO 公司产品 ) ； 3ml) 悬浮细胞， 每个抗原孔加入 40ul 细胞 悬液， 盖上盖子后放入培养箱中继续培养 8 小时 ； 3) 取一烧杯内盛 PBS 溶液 (0.01mol/L pH ＝ 7.2)， 将吸附后的抗原片缓缓放入溶 液中， 浸泡 1min 左右， 取出放在工作台内晾干， 约需 30min ；
4) 将抗原片放入盛有丙酮 ( 国药集团化学试剂有限公司分析纯浓度 99.5％ ) 的 烧杯中， -20℃ 30min 或者过夜 ；
5) 取出晾干后保存于低温 (-40℃以下 ) 冰箱中备用。
间接免疫荧光法 ： 采集小鼠全血后放置于 37℃培养箱孵育 30min， 经 800rpm 离心 15min 后吸取上清得到血清。 之后将血清按照实验要求进行稀释后进行间接免疫荧光实验， 具体实验步骤如下 ：
1) 从冰箱中取出抗原片， 肉眼观察上面的细胞是否脱落， 如果有脱落孔， 放弃不 用；
2) 在抗原片上用蜡笔在吸附有抗原的画圈周围划一圈， 防止所加样品溢流 ；
3) 根据实验的需要稀释所检测的血清后加样， 每孔 20-25ul， 一般需要做复孔， 故 需要 50ul， 根据需要做倍比稀释 ；
首浓度按照 1 ∶ 10， 故需要加入 10ul 血清 +90ul 抗体稀释液， 在漩涡混合器上充 分混匀后取出 50ul 1 ∶ 10 稀释液 +50ul 血清稀释液 (1 ∶ 20)， 依此稀释下去， 一般稀释至 1 ∶ 160 ；
4) 把已经加样的抗原片放入铺有塑料板的饭盒中， 放入 37℃、 5％ CO2 培养箱中孵 育 30min ；
5) 取出抗原片， 放入洗板槽内， 向里面加入洗涤液 (0.005M PBS+0.02％ ( 体积百 分含量 )Tween 20)， 在水平振荡器上洗涤 5min， 重复 3 次 ；
6) 待抗原片完全风干后， 加入 1 ∶ 50 稀释的荧光抗体 25ul/ 孔， 放入饭盒后在 37℃、 5％ CO2 培养箱中孵育 30min ；
荧光抗体的稀释 ： 取 出 针 对 所 加 入 血 清 来 源 的 适 量 荧 光 抗 体， 用 0.02 ％ ( 质 量 百 分 含 量 ) 伊 文 斯 兰 溶 液 按 照 1 ∶ 50 稀 释 抗 体， 该实验所使用的抗体为 FITC-conjugate-Goat Anti-Human IgG 购自 Sigma 公司。
7) 重复步骤 5) ；
8) 风干后， 滴加无菌水在荧光显微镜下观察荧光情况并记录结果。
利用间接免疫荧光试验测， 结果显示在首次免疫 1 周后小鼠血清抗体水平开始升 高， 血清效价为 1 ∶ 20， 在首免 2 周后血清效价达至 1 ∶ 80， 3 周后降至较低水平 ； 血清效 价为 1 ∶ 30。加强免疫后， 抗体水平再次迅速升高， 升高幅度比首次免疫整体要高， 血清效 价达到 1 ∶ 160。对照组 vAd-GFP 和 PBS 始终未检测出特异性抗体 ( 小于 1 ∶ 10)。
2、 流式分析淋巴细胞中 CD4+、 CD8+ 数
流式分析淋巴细胞中 CD4+、 CD8+ 数， 结果如下 ：
免疫小鼠中， vAd-QE 免疫 1 周后 CD4+ 淋巴细胞占总淋巴细胞的 10％， 2 周以后恢 + 复至正常水平约占 5％， 加强免疫后， vAd-QE 免疫组 CD4 淋巴细胞开始持续升高， 占总淋巴 + 细胞的 10％并在加免 4 周后达至 30％， 而 PBS 对照组 CD4 淋巴细胞一直占总淋巴细胞的 5％。 免疫组小鼠中， vAd-QE 免疫 1 周后达至高峰， CD8+ 淋巴细胞占总淋巴细胞的 16％， 随后恢复至正常水平约占 2％， 在首免后 3 周 CD8+ 淋巴细胞数量再次升高占总淋巴细胞的 3％ ； 加强免疫后， vAd-QE 免疫组 CD8+ 淋巴细胞开始持续升高， 在免疫 1 周后达至峰值约占 总淋巴细胞的 12％， 随后缓慢下降至正常水平 2％， 3 周后又缓慢升至较高水平约占 8％。 + vAd-GFP 对照组在首免后 CD8 淋巴细胞数量变化则不明显。PBS 对照组则无显著变化。
二、 利用酶联免疫斑点试验 (ELISPOT) 对细胞因子生成细胞进行定量
加 强 免 疫 4 周 后， 每 组 随 机 挑 选 4 只 小 鼠， 处 死 后 立 即 无 菌 采 取 脾 脏， 加入 10ml 含有 10 ％胎牛血清的 1640 培养液 ( 含有 10 ％胎牛血清的 1640 培养液 ： 向 500ml RPMIMEDIUM1640 液体中加入 50ml 胎牛血清、 100X Antibiotic-Antimycotic、 100X NEAA、 100ulHEPES， 之后用实验室配置的经过过滤除菌的 7.5％ NaHCO3( 质量百分比 ) 调节溶液的 pH 值为 7.0-7.2 ； 上述 RPMI MEDIUM1640、 胎牛血清、 100X Antibiotic-Antimycotic、 100X NEAA、 HEPES 均为 GIBCO 公司产品 ； RPMI MEDIUM1640 GIBCO 公司产品， LOT ： 8109086)， 将脾 组织通过 200 目铜网制成细胞悬液， 收集到无菌的离心管中， 15000rpm/min 离心 5min， 弃 7 上清液后用 1640 培养基离心洗涤细胞两次， 最后将脾细胞稀释成 2×10 个 /ml， 制成细胞 7 悬液备用。以细胞培养的东部马脑炎病毒作为特异刺激因子 ( 将 2×10 个 /ml 个脾细胞 108pfu 的东部马脑炎病毒混合， 共同孵育 48 小时， 按照 ELISPOT 实验的操作， 脾细胞与特异 的刺激因子要分别加入到孔中， 之后在孔内反应， 不能在孔外混合后加入其内 )， 利用酶联 免疫斑点试验 (ELISPOT) 对细胞因子生成细胞进行定量。
具体的实验步骤 ：
1.Coating antibody( 包被抗体 ) ： 无菌条件下进行
用 Coating buffer(1×PBS pH7.2) 稀释 capture 抗体 (200 倍 )， 终浓度 5ug/ml 包被板子， 每孔加 100ul 稀释的 capture 抗体 4℃过夜。
2.Blocking( 封闭 ) ： 无菌条件下进行
吸干孔中包被液， 洗板子， 每孔加入 200ul Blocking 溶液， 洗孔一次。( 在灭菌吸
水纸上扣干 )
3.Cell Activation( 刺激细胞 ) ： 无菌条件下进行
3.1 弃 Blocking 溶液， 准备刺激用的抗原， 用组织完全培养基稀释适宜浓度 50ug/ ml， 每孔加入 100ul ； ( 不要拍板子 )
3.2 准备 1×106 个脾细胞悬液， 每孔加入 100ul ； (注： 避免震动 )
3.3 盖上盖子， 板子放置 37℃， 5％ CO2， 99％湿度的培养箱根据细胞情况培养 48 小 时。
(注： 时刻避免碰撞 )
4.Detection antibody( 检测抗体 ) ：
4.1 在无菌条件下吸去细胞悬液， 用去离子水 ( 冰冷的去离子水， 低渗法裂解细 胞 ) 洗 2 遍， 每遍浸泡 3-5min， 以下实验操作可以拿到超净工作台外进行 ；
4.2 每孔用 200ul wash buffer Ⅰ洗 3 遍， 弃 wash buffer Ⅰ ( 最后一遍后拍干 )
4.3 稀释 Detection 抗体， 用稀释 buffer(1×PBS+10 ％ FBS)250 倍稀释， 终浓度 2ug/ml。每孔加入 100ul ；
4.4 盖上盖子， 室温培养 2 小时。
5. 加入酶连抗体 ：
5.1 弃 Detection 抗体溶液， 每孔用 200ul wash buffer Ⅰ洗 3 遍。( 最后一遍拍 干)；
5.2 用稀释 buffer 稀释 Streptavidin-HRP( 用稀释 buffer(1×PBS+10％ FBS) 稀 释 100 倍。现用现配， 用完多余的弃之 ) 每孔加 100ul ；
5.3 盖上盖子， 室温培养 1 小时。
6. 结果检测 ：
6.1 弃 Streptavidin-HRP 溶液， 每孔用 200ul wash buffer Ⅰ洗 4 遍 ；
6.2 每孔用 200ul wash buffer Ⅱ洗 2 遍 ( 最后一遍拍干 ) ；
6.3 加入底物 AEC， 每孔加 100ul( 注意避光 )。控制斑点形成约需要 15min ；
6.4 用去离子水 ( 洗 2 遍 ) 终止底物反应 ；
6.5 室温避光空气吹干板子 2 小时 - 过夜， 至板子全干， 避光保存板子待检测。 注： 不要将板子放到烤箱中， 防止膜发脆、 破裂。)
结果 ： ELISPOT 的结果是通过最后的板子出斑的数目来确定， 通过分析可以看到 vAd-QE 免疫组出斑数目明显增加， 说明经东部马脑炎病毒的刺激后， vAd-QE 免疫组小鼠脾 细胞分泌 IFN-γ 活性明显增高， 抗原刺激后 vAd-QE 免疫组小鼠脾细胞分泌 IFN-γ 活性是 对照 vAd-GFP 组的 5 倍， 是 PBS 对照组的 19 倍 ( 根据出斑数目来统计倍数 )。
三、 攻毒实验
1、 发病和存活状况
加强免疫 4 周后， vAd-GFP 对照组、 vAd-QE 免疫组和 PBS 对照组的每组处死后剩余 的小鼠在 BSL-3 实验室进行攻毒实验， 再将 8 只小鼠为一组， 分为两组 ：
vAd-GFP 对照组 A ： 腹腔注射 215 个 LD50( 半数致死剂量 ) 东部马脑炎病毒
vAd-GFP 对照组 B ： 腹腔注射 21 个 LD50 东部马脑炎病毒
vAd-QE 免疫组 A ： 腹腔注射 215 个 LD50( 半数致死剂量 ) 东部马脑炎病毒vAd-QE 免疫组 B ： 腹腔注射 21 个 LD50 东部马脑炎病毒
PBS 对照组 A ： 腹腔注射 215 个 LD50( 半数致死剂量 ) 东部马脑炎病毒
PBS 对照组 B ： 腹腔注射 21 个 LD50 东部马脑炎病毒
持续 4 周观察小鼠发病和存活状况。
结果为加强免疫 4 周后， 215 个 LD50 的东部马脑炎病毒攻击后， vAd-QE 免疫组 A 的保护效率为 87.5％ (8 只小鼠死亡 1 只小鼠 ) ； 21 个 LD50 东部马脑炎病毒攻击后， vAd-QE 免疫组 B 的保护率为 100％ ( 无小鼠死亡 ) ； 对照组 (vAd-GFP 对照组 A、 vAd-GFP 对照组 B、 PBS 对照组 A、 PBS 对照组 B) 均无保护作用 (8 只小鼠都死亡 )。保护率是最后存活小鼠的 数量与其攻毒前小鼠的数量比值。
2、 利用 BHK 细胞单层测定小鼠血清中和抗体
收集上述攻毒后的各组小鼠的血清， 利用 BHK 细胞 (Invitrogen 公司产品， Cat. No.R760-07) 单层测定小鼠血清中和抗体。先将免疫小鼠血清适当稀释后， 置 56℃水浴中 处理 30min， 破坏其中的补体和其他不耐热的非特异性毒性因子， 然后以维持液 ( 含有 2％ ( 体积百分比 ) 胎牛血清的细胞维持液的配置方法 ： 向 500ml DMEM 液体中加入 10ml 胎牛血 清、 100X Antibiotic-Antimycotic、 100X NEAA、 100ul HEPES， 之后用实验室配置的经过过 滤除菌的 7.5％ NaHCO3( 质量百分比 ) 调节溶液的 pH 值为 7.0-7.2 ； 上述 DMEM、 胎牛血清、 100X Antibiotic-Antimycotic、 100X NEAA、 HEPES 均为 GIBCO 公司产品 ) 在无菌离心管中 进行 2 倍连续稀释。取 100 个 TCID50 东部马脑炎病毒病毒液和等体积不同稀释度的血清， 充分混匀后置 37℃孵育 1h， 中间上下颠倒离心管混匀液体 1-2 次， 1 小时后取出 96 孔板， 其 内的 BHK 细胞已铺满单层， 吸去细胞单层上的培养基， 加入作用过的病毒 - 抗体混合液 ( 即 上述孵育过的混匀液体 )， 培养板上同时设阳性和阴性对照孔 ( 阳性对照为用细胞维持液 稀释为 100 个 TCID50 的东部马脑炎病毒病毒液， 阴性对照为用细胞维持液稀释的不同浓度 的血清， 空白对照为细胞维持液 )。放入含有 5％ CO2 的 37℃培养箱中培养， 每天观察和记 录细胞病变的情况。
中和实验检测血清效价， 具体方法如下 ： 通过显微镜观察细胞的病变情况 ( 病变 时细胞膨大变圆聚集 )， 当孔内细胞病变达到 90％以上记为 ++++， 细胞病变达到 75％以上 记为 +++， 细胞病变达到 50 ％以上记为 ++， 细胞病变达到 25 ％以上记为 +， 无细胞病变记 为 -， 最后用 Reed-Muench 法计算血清的中和指数。
结果 ： 接种病毒前 vAd-QE 免疫组 A 和 vAd-QE 免疫组 B 小鼠血清效价均为 1 ∶ 120， 攻毒 4 周后， 接种 21 个 LD50 的东部马脑炎病毒攻击后的 vAd-QE 免疫组 B 存活小鼠的血清 效价为 1 ∶ 360， 215 个 LD50 东部马脑炎病毒攻击后的 vAd-QE 免疫组 A 的存活小鼠血清效 价则为 1 ∶ 600。而对照组 (vAd-GFP 对照组 A、 vAd-GFP 对照组 B、 PBS 对照组 A、 PBS 对照 组 B) 均无特异性抗体的产生。
本发明涉及一种脑炎病毒蛋白及其编码基因与应用。背景技术 脑炎是由病毒直接侵犯或由病毒或其他异种蛋白引发的超敏反应所致的大脑急 性炎症性疾病。脑炎可以是病毒性感染原发的临床表现， 或者是继发的临床表现， 引起原 发的脑炎的病毒有脊髓灰质炎病毒， 埃可病毒、 柯萨奇病毒等流行性病毒， 或散发性的通过 蚊子、 蜱等节肢动物传播的黄病毒属的森林脑炎和批膜病毒科甲病毒属的东方马脑炎病毒 等。
甲病毒为披膜病毒科 (Togaviridae) 甲病毒属 (Alphavirus) 成员， 以蚊蜱等吸血 昆虫为传播媒介， 可引起多种人畜共患传染病。 近年来， 国外已对多株甲病毒部分或全部序 列测序。国内对这类病毒的分子生物学研究亦取得一定的结果。已有的研究结果表明 ： 该 病毒属中和抗体决定簇主要集中在结构蛋白 E1 和 E2 等糖蛋白上， 其中 E2 蛋白上所占比例 更高。加之近年来腺病毒载体因具有安全性好、 宿主范围广、 感染效率高等多种优点， 被广 泛用于基因治疗和基因工程疫苗研究， 为此我们分析比较了多株甲病毒核苷酸序列， 人工 合成了同源性较高的 3kb 的核苷酸， 利用腺病毒载体构建重组基因工程疫苗， 为预防和治 疗疾病奠定了基础。
甲病毒为披膜病毒科 (Togaviridae) 甲病毒属 (Alphavirus) 成员， 以蚊蜱等吸血 昆虫为传播媒介， 可引起多种人畜共患传染病。 近年来， 国外已对多株甲病毒部分或全部序 列测序。国内对这类病毒的分子生物学研究亦取得一定的结果。已有的研究结果表明 ： 该 病毒属中和抗体决定簇主要集中在结构蛋白 E1 和 E2 等糖蛋白上， 其中 E2 蛋白上所占比例 更高。加之近年来腺病毒载体因具有安全性好、 宿主范围广、 感染效率高等多种优点， 被广 泛用于基因治疗和基因工程疫苗研究， 为此我们分析比较了多株甲病毒核苷酸序列， 人工 合成了同源性较高的 3kb 的核苷酸， 利用腺病毒载体构建重组基因工程疫苗， 为预防和治 疗疾病奠定了基础。
【发明内容】
本发明的一个目的是提供一种与脑炎病毒疫苗相关蛋白及其编码基因。
本发明提供的蛋白 QE， 人工合成， 是如下 1) 或 2) 的蛋白 ：
1) 由序列表中序列 2 所示的氨基酸序列组成的蛋白 ；
2) 将序列 2 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添 加且具有相同功能的由 1) 衍生的蛋白质。
序列表中的序列 2 由 982 个氨基酸残基组成， 所述一个或几个氨基酸残基的取代 和 / 或缺失和 / 或添加为不超过 10 个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加。
上述蛋白质 QE 的编码基因也是本发明保护的范围， 所述编码基因为如下 1)-4) 中 任一所示的基因 ：
1) 序列表中序列 1 所示的 DNA 分子 ；
2) 序列表中序列 1 自 5’ 末端第 1-2946 位核苷酸所示的 DNA 分子 ；
3) 在严格条件下与 1) 或 2) 限定的 DNA 分子杂交且具有相同功能的 DNA 分子 ；
4) 与 1) 或 2) 限定的 DNA 序列至少具有 90％同源性且具有相同功能的 DNA 分子。
含有上述编码基因的重组载体、 转基因细胞系、 重组菌、 表达盒或重组病毒也是本 发明保护的范围。
所述重组载体为 pAdeasy-1 和重组穿梭质粒经过同源重组得到的 ； 所述重组穿梭 质粒是在载体 pShuttle-CMV 的 KpnI 和 HindIII 酶切位点间插入所述编码基因得到的。所述重组病毒为重组腺病毒 ； 所述重组腺病毒为将上述蛋白的编码基因转染宿主 细胞获得的重组腺病毒。
所述宿主细胞为真核细胞， 优选为离体的哺乳动物细胞， 尤其优选为 HEK-293 细 胞。
本发明的另一个目的是提供一种疫苗。
本发明提供的疫苗， 其活性成分为如下任意一种 ：
1) 所述的蛋白 ； 2) 所述编码基因 ； 3) 所述重组腺病毒。
上述重组腺病毒在制备疫苗中的应用也是本发明保护的范围。
所述疫苗为脑炎病毒疫苗。
上述重组腺病毒在制备提高 IFN-γ 活性的增强剂中的应用也是本发明保护的范 围。
本发明的实验证明， 从脑炎病毒克隆出 QE 通过转染 HEK-293 细胞而组装成携带有 目标抗原基因的重组腺病毒 vAd-QE。重组腺病毒 vAd-QE 感染 293 细胞能有效表达目的蛋 白； 通过滴鼻途径接种 BalB/C 小鼠， 利用间接免疫荧光技术检测特异性抗体水平， 结果表 明， 所构建的重组腺病毒虽然产生特异性抗体的时间和维持的水平有所不同， 但均产生了 较好体液免疫反应， 为进一步开展免疫保护实验提供了重要的数据支持。由于病毒在机体 内极微量的蛋白表达即可激起免疫反应， 因此构建的携带有脑炎病毒结构基因的重组腺病 毒 vAd-QE， 有希望成为脑炎基因工程疫苗的候选疫苗株。 附图说明
图 1 为 pAdtrack-QE 酶切鉴定图 图 2 为重组质粒 Pac I 酶切和 PCR 鉴定具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。
东部马脑炎病毒 (Eastern Equine Encephalomyelitis virus)(HE Jing ； CHANG GuoHui ； WU Jin Song ； LI ZhongDuo ； ZHU QingYu ： Cloning and expression of E2 gene of eastern equine encephalomyelitis virus.Bulletin of The Academy of Military Medical Sciences.2002.02. 公众可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究 所获得。)
HEK-293 细胞 (Invitrogen 公司产品， Cat.No.R750-07) ； 实验所需限制性内切 酶分别购自 TaKaRa 和 Biolabs 公司 ； 脂质体 Lipofectamin 2000 购自 Invitrogen 公司 ； Platinum pfx Taqase 购自 Invitrogen 公司。
实施例 1、 重组腺病毒 (vAd-QE) 的获得
1、 含有目的基因 pAdtrack-QE 的构建及鉴定
根据东部马脑炎病毒 (Eastern Equine Encephalomyelitis virus)(NC-001547) 的基因组序列， 突变序列中的多个位点， 设计出序列表中的序列 1， 人工合成出序列 1。
设计引物扩增编码 QE 蛋白的基因， 引物序列 ( 引物分别含有 KpnI 和 HindIII 酶切位点 ) 见下 ：
QE-F ： 5’ ACGGggtaccATGGCATCACTAGTGACCACCATGTGT-3’
QE-R ： 5’ ACCCaagcttTGCCAATTGCTGCTGTATTC-3’
以人工合成出序列 1 的 DNA 为模板， 利用 QE-F 和 QE-R 引物对进行 PCR 反应， 得到 的 PCR 产物经 1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定， 得到了预期大小一致的片段， 约为 3Kb。
经测序， 该 PCR 产物具有序列表中的序列 1 自 5’ 末端第 1-2967 位核苷酸， 将该 PCR 产物的基因命名 QE， 其 OFR 为序列 1 的自 5’ 末端第 1-2946 位核苷酸， 该基因编码的蛋 白命名为 QE， 该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 2， 序列 2 由 982 个氨基酸残基组成。
回收 PCR 产物， 对 PCR 产物进行加 “A” 处理， 处理后的 PCR 样品与 pMD-18T 载体 (TaKaRa 公司产品， Code ： D101A.Lot CK3201A) 相连， 转化 DH5a 感受态细胞， 挑取阳性菌落 提取质粒后测序验证， 结果为该质粒为将序列表中序列 1 的自 5’ 末端第 1-2967 位核苷酸 插入 pMD-18T 得到的， 命名为 pTQE。
用 KpnI 和 HindIII 双酶切重组质粒 pTQE 和质粒 pShuttle-CMV(Invitrogen 公 司产品， Catalog#240007)， 酶切产物分别用凝胶回收试剂盒切胶回收， 并在 T4 DNA 连接 酶作用下于 16 ℃连接过夜， 连接产物转化大肠杆菌 DH10B(Invitrogen 公司产品， Cat. No.18290-015) 后挑选阳性克隆， 提取质粒进行测序， 结果为该质粒为将序列表中序列 1 的 自 5’ 末端第 1-2967 位核苷酸插入 pShuttle-CMV 的 KpnI 和 HindIII 酶切位点间得到的载 体， 命名为 pAdtrack-QE。
将 pAdtrack-QE 进行酶切验证， 酶切产物经过 1％ DNA 凝胶电泳。
结 果 见 图 1 所 示， 其 中 1、 DL2000(Marker 条 带 分 别 为 2000bp、 1000bp、 750bp、 500bp、 250bp 和 100bp ； 2、 KpnI+HindIII 消 化 pAdtrack-QE ； 3、 EcoRII+EcoRV 消 化 pAdtrack-QE ； 4、 SalI+XbaI 消化 pShuttle-CMV ； 5、 DL15000(Marker 条带分别为 15000bp、 10000bp、 7500bp、 2500bp、 1000bp 和 250bp)， 从图中看出， 泳道 1 酶切后的产物显示两条电 泳带 ： 一条为质粒载体带， 大小 9Kb， 另一条为克隆的目的基因带， 大小约为 3Kb， 与相应的 PCR 扩增产物大小一致， 进一步表明已成功的将 QE 基因 ( 序列表中的序列 1 自 5’ 末端第 1-2967 位核苷酸 ) 克隆至质粒 pShuttle-CMV 得到 pAdtrack-QE。
2、 重组腺病毒载体的构建
菌 BJ5183 购自上海杰美基因医药科技有限公司， 货号为 ： GMS12223.2。
将腺病毒骨架质粒 pAdeasy-1(Invitrogen 公司产品， Catalog#240005， 含有 GFP 报告基因 ) 经过 PacI( 购自 Biolabs 公司， 货号为 ： R05647S) 酶切后， 转入宿主菌 BJ5183 中， 得到含有腺病毒骨架质粒 pAdeasy-1 的宿主菌 BJ5183。
将上述 pAdtrack-QE 和穿梭质粒 pShuttle-CMV 分别用 PmeI( 购自 Biolabs 公司， 货号为 ： R0560S) 经 37℃充分消化， 使用 Gel Extraction kit 试剂盒 ( 购自 OMGEA 公司， 货 号为 ： D2500-01) 回收线性化的 pAdtrack-QE 和 pShuttle-CMV。
将线性化的质粒 pAdtrack-QE 电转化到含有腺病毒骨架质粒 pAdeasy-1 的宿主菌 BJ5183 感受态细胞中， 由于大肠杆菌 BJ5183 具有 Sm 抗性， pAdeasy-1 具有 Amp 抗性， 而重 组质粒 pAdtrack-QE 和穿梭载体质粒 pShuttle-CMV 具有 Kan 抗性， 在重组过程中穿梭质粒 上的 Kan 抗性取代了 pAdeasy-1 上的 Amp 抗性， 因此根据 Kan 和 Sm 双重抗性来筛选阳性克 隆， 得到的阳性克隆。提取转入线性化的质粒 pAdtrack-QE 的阳性克隆的质粒进行 PacI 酶切鉴定， 1％ DNA 凝胶电泳结果见图 2A 所示， 其中 1 ： DL15000Marker 2 ： pAdTrack-QE 3 ： 阳性克隆质粒 4： pShuttle-CMV 5 ： pAdeasy-1。从图中可以看出， 泳道 3 酶切后产生两个片度， 小片度大 小为 4.5Kb 左右， 含有复制子和卡那霉素抗性基因， 大片度为含有目的基因 QE 的病毒骨架， 大小约 36Kb( 病毒骨架大小约 33.5Kb 而目的基因 QE 3Kb)， 将该重组质粒命名为重组质粒 pAd-QE ； 泳道 2 重组穿梭质粒 pAdTack-QE 经过 Pac Ⅰ酶切后， 产生 2 个片段， 其中一个含有 目的基因 QE 约 9Kb， 另一个片段含有穿梭质粒 pShuttle-CMV 上的复制子和卡那霉素抗性基 因大小约 3Kb。
提取转入线性化的质粒 pAdtrack-QE 的阳性克隆的质粒进行 PCR 鉴定， 引物为 QE-F、 QE-R( 请核实 )， 结果见图 2B ： 1： DL15000Marker 2 ： pShuttle-CMV 3 ： pAdTrack-QE4 ： pAd-QE 5 ： pAdeasy-1， 可以看出， 重组质粒 pAd-QE 可扩增出与预期的目的片度 3Kb， 进一步 说明已经成功构建携带有目的基因 QE 的重组腺病毒骨架质粒 pAd-QE。
3、 组装成重组腺病毒
将 HEK-293 细胞接种到 6 孔板中， 37 ℃培养， 细胞生长至 60 ％ -70 ％， 用脂质体 Lipofectamin 2000( 购自 Invitrogen 公司 ) 介导重组腺病毒骨架质粒 pAd-QE 转染入细胞 中， 转染完成 7-10 天后， 收集细胞， 经 3 轮反复冻融， 离心收集上清液， 即为含有目的基因的 重组腺病毒 vAd-QE。转染实验按照说明书进行， 培养 7-10 天， 定期在荧光显微镜下检测是 否产生荧光， 判断转染是否成功， 由于该重组病毒上含有绿色荧光蛋白 (GFP) 的报告基因， 因此可以说明一旦有荧光就表示转染成功。
4、 重组腺病毒 vAd-QE 的扩增及目的蛋白的表达
1) 重组腺病毒 vAd-QE 的扩增
将上述 3 获得的转染完成 7-10 天后， 收集细胞， 经 3 轮反复冻融， 离心收集上清 液， 即为重组腺病毒 vAd-QE， 进行下一代扩增， 连续扩增 3 代， 第二次收集上清液， 比第一次 数量增多。
2) 目的蛋白的表达
取 200ul 上述获得的第二次收集的上清液 ( 重组腺病毒 vAd-QE， 病毒的浓度为 6 LgTCID50/0.2ml ＝ 8.0) 感染 5x10 的 HEK-293 细胞， 4 天后， 收集细胞。细胞经处理后进行 SDS-PAGE 电泳。结果 ： 经 SDS 电泳， 得到大小为 110KD 的蛋白 (QE 蛋白 )， 与预期蛋白的大 小一致。说明重组腺病毒有效的介导 QE 在细胞中表达。
采用同样的方法将上述线性化的 pShuttle-CMV 和 pAdeasy-1 共同转入宿主菌 BJ5183 感受态细胞中， 得到重组腺病毒载体， 记作 pAd-GFP ； 将 pAd-GFP 转染 HEK-293 细胞， 获得阴性对照腺病毒 vAd-GFP。对照腺病毒 vAd-GFP 中无 QE 蛋白表达 ；
实施例 2、 重组腺病毒 (vAd-QE) 的滴鼻接种中和抗体测定
6-7 周龄的 BALB/c 小鼠随机分为 3 组， 分别为 vAd-GFP 对照组、 vAd-QE 免疫组和 PBS 对照组， 每组 20 只小鼠。
vAd-GFP 对 照 组 ： 拭 鼻 方 式 感 染 20ul 由 实 施 例 1 获 得 对 照 腺 病 毒 8 vAd-GFP(10 pfu)。
vAd-QE 免 疫 组 ： 拭 鼻 方 式 感 染 20ul 由 实 施 例 1 获 得 的 重 组 腺 病 毒 (vAd-QE) 8 (10 pfu)。PBS 对照组 ： 拭鼻方式感染 20ulPBS 溶液 (0.01M/L pH7.2)
一、 血清和淋巴细胞检测
将 3 个小组在第一次免疫后的第 4 周加强免疫一次。在免疫后每间隔一周时间通 过尾静脉采集小鼠血液， 离心后分别收集血清和淋巴细胞沉淀。
1、 间接免疫荧光试验测定免疫小鼠血清中病毒的抗体反应
用东部马脑炎病毒 (Eastern Equine Encephalomyelitis virus) 感染的 HEK-293 制备抗原片， 制备的方法如下所述 ：
实验前准备 ： 把抗原片摆放在抗原架上， 每个架上排放 2 排， 1 排 4 个， 完毕后用罩 子盖上防止灰尘的进入。之后按照下面步骤进行 ：
1) 待 75cm2 方瓶的 HEK-293 细胞生长至 80％左右的时候， 用东部马脑炎病毒 2ml 感染细胞 1 小时后， 吸出吸附液， 补加新鲜的细胞维持液， 放入培养箱中培养 ；
2) 当细胞出现细胞病变的时候 ( 约 25％ -50％ )， 按照细胞传代的方法消化细胞， 用适量体积的培养液 ( 含有 10％胎牛血清的 DMEM 细胞生长液， 具体配方 ： 向 500mlDMEM 液 体中加入 50ml 胎牛血清、 100X Antibiotic-Antimycotic、 100X NEAA、 100ulHEPES， 之后用 实验室配制的经过 0.22um 滤膜过滤除菌的 7.5％ ( 质量百分含量 )NaHCO3 调节溶液的 pH 值至 7.0-7.2， 上述液体均为 GIBCO 公司产品 ) ； 3ml) 悬浮细胞， 每个抗原孔加入 40ul 细胞 悬液， 盖上盖子后放入培养箱中继续培养 8 小时 ； 3) 取一烧杯内盛 PBS 溶液 (0.01mol/L pH ＝ 7.2)， 将吸附后的抗原片缓缓放入溶 液中， 浸泡 1min 左右， 取出放在工作台内晾干， 约需 30min ；
4) 将抗原片放入盛有丙酮 ( 国药集团化学试剂有限公司分析纯浓度 99.5％ ) 的 烧杯中， -20℃ 30min 或者过夜 ；
5) 取出晾干后保存于低温 (-40℃以下 ) 冰箱中备用。
间接免疫荧光法 ： 采集小鼠全血后放置于 37℃培养箱孵育 30min， 经 800rpm 离心 15min 后吸取上清得到血清。 之后将血清按照实验要求进行稀释后进行间接免疫荧光实验， 具体实验步骤如下 ：
1) 从冰箱中取出抗原片， 肉眼观察上面的细胞是否脱落， 如果有脱落孔， 放弃不 用；
2) 在抗原片上用蜡笔在吸附有抗原的画圈周围划一圈， 防止所加样品溢流 ；
3) 根据实验的需要稀释所检测的血清后加样， 每孔 20-25ul， 一般需要做复孔， 故 需要 50ul， 根据需要做倍比稀释 ；
首浓度按照 1 ∶ 10， 故需要加入 10ul 血清 +90ul 抗体稀释液， 在漩涡混合器上充 分混匀后取出 50ul 1 ∶ 10 稀释液 +50ul 血清稀释液 (1 ∶ 20)， 依此稀释下去， 一般稀释至 1 ∶ 160 ；
4) 把已经加样的抗原片放入铺有塑料板的饭盒中， 放入 37℃、 5％ CO2 培养箱中孵 育 30min ；
5) 取出抗原片， 放入洗板槽内， 向里面加入洗涤液 (0.005M PBS+0.02％ ( 体积百 分含量 )Tween 20)， 在水平振荡器上洗涤 5min， 重复 3 次 ；
6) 待抗原片完全风干后， 加入 1 ∶ 50 稀释的荧光抗体 25ul/ 孔， 放入饭盒后在 37℃、 5％ CO2 培养箱中孵育 30min ；
荧光抗体的稀释 ： 取 出 针 对 所 加 入 血 清 来 源 的 适 量 荧 光 抗 体， 用 0.02 ％ ( 质 量 百 分 含 量 ) 伊 文 斯 兰 溶 液 按 照 1 ∶ 50 稀 释 抗 体， 该实验所使用的抗体为 FITC-conjugate-Goat Anti-Human IgG 购自 Sigma 公司。
7) 重复步骤 5) ；
8) 风干后， 滴加无菌水在荧光显微镜下观察荧光情况并记录结果。
利用间接免疫荧光试验测， 结果显示在首次免疫 1 周后小鼠血清抗体水平开始升 高， 血清效价为 1 ∶ 20， 在首免 2 周后血清效价达至 1 ∶ 80， 3 周后降至较低水平 ； 血清效 价为 1 ∶ 30。加强免疫后， 抗体水平再次迅速升高， 升高幅度比首次免疫整体要高， 血清效 价达到 1 ∶ 160。对照组 vAd-GFP 和 PBS 始终未检测出特异性抗体 ( 小于 1 ∶ 10)。
2、 流式分析淋巴细胞中 CD4+、 CD8+ 数
流式分析淋巴细胞中 CD4+、 CD8+ 数， 结果如下 ：
免疫小鼠中， vAd-QE 免疫 1 周后 CD4+ 淋巴细胞占总淋巴细胞的 10％， 2 周以后恢 + 复至正常水平约占 5％， 加强免疫后， vAd-QE 免疫组 CD4 淋巴细胞开始持续升高， 占总淋巴 + 细胞的 10％并在加免 4 周后达至 30％， 而 PBS 对照组 CD4 淋巴细胞一直占总淋巴细胞的 5％。 免疫组小鼠中， vAd-QE 免疫 1 周后达至高峰， CD8+ 淋巴细胞占总淋巴细胞的 16％， 随后恢复至正常水平约占 2％， 在首免后 3 周 CD8+ 淋巴细胞数量再次升高占总淋巴细胞的 3％ ； 加强免疫后， vAd-QE 免疫组 CD8+ 淋巴细胞开始持续升高， 在免疫 1 周后达至峰值约占 总淋巴细胞的 12％， 随后缓慢下降至正常水平 2％， 3 周后又缓慢升至较高水平约占 8％。 + vAd-GFP 对照组在首免后 CD8 淋巴细胞数量变化则不明显。PBS 对照组则无显著变化。
二、 利用酶联免疫斑点试验 (ELISPOT) 对细胞因子生成细胞进行定量
加 强 免 疫 4 周 后， 每 组 随 机 挑 选 4 只 小 鼠， 处 死 后 立 即 无 菌 采 取 脾 脏， 加入 10ml 含有 10 ％胎牛血清的 1640 培养液 ( 含有 10 ％胎牛血清的 1640 培养液 ： 向 500ml RPMIMEDIUM1640 液体中加入 50ml 胎牛血清、 100X Antibiotic-Antimycotic、 100X NEAA、 100ulHEPES， 之后用实验室配置的经过过滤除菌的 7.5％ NaHCO3( 质量百分比 ) 调节溶液的 pH 值为 7.0-7.2 ； 上述 RPMI MEDIUM1640、 胎牛血清、 100X Antibiotic-Antimycotic、 100X NEAA、 HEPES 均为 GIBCO 公司产品 ； RPMI MEDIUM1640 GIBCO 公司产品， LOT ： 8109086)， 将脾 组织通过 200 目铜网制成细胞悬液， 收集到无菌的离心管中， 15000rpm/min 离心 5min， 弃 7 上清液后用 1640 培养基离心洗涤细胞两次， 最后将脾细胞稀释成 2×10 个 /ml， 制成细胞 7 悬液备用。以细胞培养的东部马脑炎病毒作为特异刺激因子 ( 将 2×10 个 /ml 个脾细胞 108pfu 的东部马脑炎病毒混合， 共同孵育 48 小时， 按照 ELISPOT 实验的操作， 脾细胞与特异 的刺激因子要分别加入到孔中， 之后在孔内反应， 不能在孔外混合后加入其内 )， 利用酶联 免疫斑点试验 (ELISPOT) 对细胞因子生成细胞进行定量。
具体的实验步骤 ：
1.Coating antibody( 包被抗体 ) ： 无菌条件下进行
用 Coating buffer(1×PBS pH7.2) 稀释 capture 抗体 (200 倍 )， 终浓度 5ug/ml 包被板子， 每孔加 100ul 稀释的 capture 抗体 4℃过夜。
2.Blocking( 封闭 ) ： 无菌条件下进行
吸干孔中包被液， 洗板子， 每孔加入 200ul Blocking 溶液， 洗孔一次。( 在灭菌吸
水纸上扣干 )
3.Cell Activation( 刺激细胞 ) ： 无菌条件下进行
3.1 弃 Blocking 溶液， 准备刺激用的抗原， 用组织完全培养基稀释适宜浓度 50ug/ ml， 每孔加入 100ul ； ( 不要拍板子 )
3.2 准备 1×106 个脾细胞悬液， 每孔加入 100ul ； (注： 避免震动 )
3.3 盖上盖子， 板子放置 37℃， 5％ CO2， 99％湿度的培养箱根据细胞情况培养 48 小 时。
(注： 时刻避免碰撞 )
4.Detection antibody( 检测抗体 ) ：
4.1 在无菌条件下吸去细胞悬液， 用去离子水 ( 冰冷的去离子水， 低渗法裂解细 胞 ) 洗 2 遍， 每遍浸泡 3-5min， 以下实验操作可以拿到超净工作台外进行 ；
4.2 每孔用 200ul wash buffer Ⅰ洗 3 遍， 弃 wash buffer Ⅰ ( 最后一遍后拍干 )
4.3 稀释 Detection 抗体， 用稀释 buffer(1×PBS+10 ％ FBS)250 倍稀释， 终浓度 2ug/ml。每孔加入 100ul ；
4.4 盖上盖子， 室温培养 2 小时。
5. 加入酶连抗体 ：
5.1 弃 Detection 抗体溶液， 每孔用 200ul wash buffer Ⅰ洗 3 遍。( 最后一遍拍 干)；
5.2 用稀释 buffer 稀释 Streptavidin-HRP( 用稀释 buffer(1×PBS+10％ FBS) 稀 释 100 倍。现用现配， 用完多余的弃之 ) 每孔加 100ul ；
5.3 盖上盖子， 室温培养 1 小时。
6. 结果检测 ：
6.1 弃 Streptavidin-HRP 溶液， 每孔用 200ul wash buffer Ⅰ洗 4 遍 ；
6.2 每孔用 200ul wash buffer Ⅱ洗 2 遍 ( 最后一遍拍干 ) ；
6.3 加入底物 AEC， 每孔加 100ul( 注意避光 )。控制斑点形成约需要 15min ；
6.4 用去离子水 ( 洗 2 遍 ) 终止底物反应 ；
6.5 室温避光空气吹干板子 2 小时 - 过夜， 至板子全干， 避光保存板子待检测。 注： 不要将板子放到烤箱中， 防止膜发脆、 破裂。)
结果 ： ELISPOT 的结果是通过最后的板子出斑的数目来确定， 通过分析可以看到 vAd-QE 免疫组出斑数目明显增加， 说明经东部马脑炎病毒的刺激后， vAd-QE 免疫组小鼠脾 细胞分泌 IFN-γ 活性明显增高， 抗原刺激后 vAd-QE 免疫组小鼠脾细胞分泌 IFN-γ 活性是 对照 vAd-GFP 组的 5 倍， 是 PBS 对照组的 19 倍 ( 根据出斑数目来统计倍数 )。
三、 攻毒实验
1、 发病和存活状况
加强免疫 4 周后， vAd-GFP 对照组、 vAd-QE 免疫组和 PBS 对照组的每组处死后剩余 的小鼠在 BSL-3 实验室进行攻毒实验， 再将 8 只小鼠为一组， 分为两组 ：
vAd-GFP 对照组 A ： 腹腔注射 215 个 LD50( 半数致死剂量 ) 东部马脑炎病毒
vAd-GFP 对照组 B ： 腹腔注射 21 个 LD50 东部马脑炎病毒
vAd-QE 免疫组 A ： 腹腔注射 215 个 LD50( 半数致死剂量 ) 东部马脑炎病毒vAd-QE 免疫组 B ： 腹腔注射 21 个 LD50 东部马脑炎病毒
PBS 对照组 A ： 腹腔注射 215 个 LD50( 半数致死剂量 ) 东部马脑炎病毒
PBS 对照组 B ： 腹腔注射 21 个 LD50 东部马脑炎病毒
持续 4 周观察小鼠发病和存活状况。
结果为加强免疫 4 周后， 215 个 LD50 的东部马脑炎病毒攻击后， vAd-QE 免疫组 A 的保护效率为 87.5％ (8 只小鼠死亡 1 只小鼠 ) ； 21 个 LD50 东部马脑炎病毒攻击后， vAd-QE 免疫组 B 的保护率为 100％ ( 无小鼠死亡 ) ； 对照组 (vAd-GFP 对照组 A、 vAd-GFP 对照组 B、 PBS 对照组 A、 PBS 对照组 B) 均无保护作用 (8 只小鼠都死亡 )。保护率是最后存活小鼠的 数量与其攻毒前小鼠的数量比值。
2、 利用 BHK 细胞单层测定小鼠血清中和抗体
收集上述攻毒后的各组小鼠的血清， 利用 BHK 细胞 (Invitrogen 公司产品， Cat. No.R760-07) 单层测定小鼠血清中和抗体。先将免疫小鼠血清适当稀释后， 置 56℃水浴中 处理 30min， 破坏其中的补体和其他不耐热的非特异性毒性因子， 然后以维持液 ( 含有 2％ ( 体积百分比 ) 胎牛血清的细胞维持液的配置方法 ： 向 500ml DMEM 液体中加入 10ml 胎牛血 清、 100X Antibiotic-Antimycotic、 100X NEAA、 100ul HEPES， 之后用实验室配置的经过过 滤除菌的 7.5％ NaHCO3( 质量百分比 ) 调节溶液的 pH 值为 7.0-7.2 ； 上述 DMEM、 胎牛血清、 100X Antibiotic-Antimycotic、 100X NEAA、 HEPES 均为 GIBCO 公司产品 ) 在无菌离心管中 进行 2 倍连续稀释。取 100 个 TCID50 东部马脑炎病毒病毒液和等体积不同稀释度的血清， 充分混匀后置 37℃孵育 1h， 中间上下颠倒离心管混匀液体 1-2 次， 1 小时后取出 96 孔板， 其 内的 BHK 细胞已铺满单层， 吸去细胞单层上的培养基， 加入作用过的病毒 - 抗体混合液 ( 即 上述孵育过的混匀液体 )， 培养板上同时设阳性和阴性对照孔 ( 阳性对照为用细胞维持液 稀释为 100 个 TCID50 的东部马脑炎病毒病毒液， 阴性对照为用细胞维持液稀释的不同浓度 的血清， 空白对照为细胞维持液 )。放入含有 5％ CO2 的 37℃培养箱中培养， 每天观察和记 录细胞病变的情况。
中和实验检测血清效价， 具体方法如下 ： 通过显微镜观察细胞的病变情况 ( 病变 时细胞膨大变圆聚集 )， 当孔内细胞病变达到 90％以上记为 ++++， 细胞病变达到 75％以上 记为 +++， 细胞病变达到 50 ％以上记为 ++， 细胞病变达到 25 ％以上记为 +， 无细胞病变记 为 -， 最后用 Reed-Muench 法计算血清的中和指数。
结果 ： 接种病毒前 vAd-QE 免疫组 A 和 vAd-QE 免疫组 B 小鼠血清效价均为 1 ∶ 120， 攻毒 4 周后， 接种 21 个 LD50 的东部马脑炎病毒攻击后的 vAd-QE 免疫组 B 存活小鼠的血清 效价为 1 ∶ 360， 215 个 LD50 东部马脑炎病毒攻击后的 vAd-QE 免疫组 A 的存活小鼠血清效 价则为 1 ∶ 600。而对照组 (vAd-GFP 对照组 A、 vAd-GFP 对照组 B、 PBS 对照组 A、 PBS 对照 组 B) 均无特异性抗体的产生。
结果表明， 所构建的重组腺病毒 vAd-QE 产生了较好体液免疫反应， 为进一步开展 免疫保护实验提供了重要的数据支持。10CN 101967186 A
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