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用遗传编码的非天然氨基酸打破免疫耐受
    联邦资助的研究与开发下作出发明的权利声明
     本 发 明 在 来 自 国 立 卫 生 研 究 院 (NIH) 的 政 府 资 助 下 进 行，资 助 号 HL-16411(5RO1GM62159)。美国政府享有本发明的某些权利。
     相关申请的交叉引用
     本申请要求以下美国临时专利申请序列号的优先权和权益 ： 2008 年 2 月 8 日提交 的 61/065,148 ； 2008 年 2 月 12 日提交的 61/065,515 ； 2008 年 7 月 25 日提交的 61/135,947 ； 2008 年 7 月 31 日 提 交 的 61/137,676 ； 2008 年 12 月 29 日 提 交 的 61/203,948 ； 2008 年 2 月 8 日 提 交 的 61/065,147 ； 2008 年 2 月 12 日 提 交 的 61/065,590 ； 2008 年 7 月 25 日 提 交 的 61/135,969 ； 2008 年 7 月 31 日 提 交 的 61/137,635 ； 和 2008 年 12 月 29 日 提 交 的 61/203,947 ； 将其全部公开内容纳入本文用于所有目的。
     技术领域
     本发明涉及免疫学领域。更具体说， 本发明提供通过给予掺入了一个或多个非天 然氨基酸的对应于靶标部分 ( 即所述自身部分或外来部分 ) 的免疫原， 在对象产生对抗自 身抗原， 如 TNFα 或无数其它自身抗原的免疫应答， 或者产生和提高对象对抗外来 ( 非自 身 ) 抗原的免疫应答的组合物和方法。
     发明背景
     现代医学中的一大挑战是治疗既不引起对象产生抗体 ( 例如， 由于对象对自身抗 原的免疫耐受 ) 也不引起强大 / 强烈抗体应答 ( 例如， 某些细菌 / 病毒感染 ) 的医学病 症。有大量医学病症属于这种类型。例如， 产生自或涉及对象自身蛋白质的病症可包含如 TNFα( 参与 / 涉及克罗恩氏病， 内毒素休克， 脑疟疾等 )， IL 10( 参与 SLE) 等部分。而且， 对象对于多种病毒和细菌感染难以产生强大的抗体， 如病毒和细菌感染， 如 HIV、 CMV、 结核 病和葡萄球菌。
     可提出多种不同方案以解决此类免疫应答问题。例如， 此类方案考虑改良的佐 剂 / 载体， 在抗原中引入强 T 细胞表位， 偶联疫苗和组合疫苗。参见例如 Baldridge 等， 《疫 苗 佐 剂 ： 免 疫 学 和 临 床 原 则》 (Vaccine Adjuvants ： Immunological and Clinical Principles.)C.J.Hackett， Harn， D.A.Jr. 编 .( 修 马 纳 出 版 公 司， 新 泽 西 州 托 托 瓦 )， 235-255 ； Makela 等， Expert Rev Vaccines ， 1(3) ： 399-410(2002) ； Dalum 等， Nat Biotechnol.17 ： 666(1999) ； 以及 Restifo， Curr Opin Immunol 8 ： 658(1996).。其它方案 尝试用非特异性标记的抗原 ( 即， 重氮衍生化的抗原 ) 进行免疫。参见 Weigle， J Exp Med 121 ： 289(1965)。
     然而， 持续需要更好更广泛应用的方法和组合物以产生或增强对象对抗特异性自 身蛋白质如 TNFα 的免疫学应答， 和 / 或对抗来自多种病原体如细菌、 病毒、 真菌和 / 或朊 蛋白病原物的特异性蛋白的免疫应答。 本发明提供了这些和其它益处， 一旦检验就会清楚。
     发明概述
     在产生多种疾病状态的疫苗中具有显著的选择性诱导对抗自身蛋白质的能力， 或增强外源抗原特定表位的免疫原性的能力， 所述疾病状态包括癌症、 蛋白质折叠疾病和感 染性疾病 ( 如细菌或病毒感染 )。本发明通过在蛋白质中掺入非天然氨基酸产生用于疫苗 接种的非天然免疫原， 或者产生用于被动免疫的抗体。 在本发明中， 加入非天然氨基酸的免 疫原对应接种 / 免疫对象的靶标部分 ( 如疾病相关部分 )， 或者对应对象体内的靶标部分 ( 如疾病相关部分 )。在将具有非天然氨基酸的免疫原给予对象的实施方式中， 非天然氨基 酸的存在引起对抗免疫原的免疫应答， 所述免疫应答交叉反应对抗靶标 ( 如疾病相关 ) 部 分。
     在第一方面， 本发明提供了在对象中产生或增强对抗靶标部分如多肽、 糖或两者 组合的免疫应答的方法， 如 B- 细胞介导的应答和 / 或 T- 细胞介导的应答， 所述靶标部分在 对象内或能够在对象内。所述方法包括提供包含一个或多个非天然氨基酸的非天然免疫 原， 并将非天然免疫原给予对象。对象 ( 如人、 猴、 小鼠、 大鼠、 猪、 奶牛、 鸡、 笼中鸟、 鸟舍鸟、 爬行动物和 / 或两栖动物 ) 产生对抗非天然免疫原的一种或多种抗体， 其中所述抗体针对 靶标部分交叉反应 ( 因此产生或增强对抗靶标的免疫原性应答 )。
     给予对象以产生或增强免疫应答的非天然免疫原对应对象体内至少一个靶标部 分 ( 或对应能够在对象体内的至少一个部分 )。 在一些实施方式中， 靶标部分可包含第一个 氨基酸序列， 非天然免疫原可包含与靶标序列相同的第二个氨基酸序列， 除了靶标部分序 列的一个或多个天然氨基酸被替换为免疫原序列中的一个或多个非天然氨基酸。 或者或此 外， 靶标部分可包含第一氨基酸序列， 非天然免疫原可包含与靶标部分序列相同的第二氨 基酸序列， 除了免疫原序列还包含一个或多个另外的非天然氨基酸序列。在各种实施方式 中， 非天然免疫原可包含与其起源的靶标部分基本相似的结构， 和 / 或可包含与其起源的 靶标基本相似的三级和 / 或四级结构。 非天然免疫原中出现的一个或多个非天然氨基酸可任意被抗体接近。 本方面方法 中产生的一种或多种交叉反应抗体可任意对靶标部分上的表位具有特异性， 所述表位包含 与非天然免疫原上的对应表位的相同序列。然而， 交叉反应抗体可任意对靶标部分上的表 位具有特异性， 与非天然免疫原的对应表位相比， 所述表位包含不同的序列， 如任意包含一 个或多个非天然氨基酸的不同序列。
     在这方面， 可通过多种途径产生起源于靶标部分的非天然免疫原。在优选实施方 式中， 使用正交翻译系统产生非天然免疫原。 然而， 非天然免疫原可任意在体内翻译系统中 产生 ( 如通过选择性压力掺入 ) ； 在体外翻译系统中产生 ( 如使用非天然氨基酸化学酰基 化的 tRNAs) ； 通过除翻译后修饰之外的工艺产生 ； 或通过对免疫原中出现的 20 种天然产生 的经典氨基酸之一进行化学修饰之外的工艺产生。
     掺入非天然免疫原的非天然氨基酸可任意包含除 20 种天然产生的经典氨基酸之 外的任何非天然氨基酸。可掺入的非天然氨基酸还可包括除 20 种经典氨基酸之外的任一 氨基酸， 其中所述非天然氨基酸包含如下结构 ：
     其中 R 是除 20 种经典天然氨基酸中任一种所用侧链之外的任何取代基 ； 其中 R1 是 20 种经典的天然氨基酸中一种所用的取代基 ； 其中 R2 是任何取代基， 使 R2-R1 一起组成 不同于 20 种经典天然氨基酸中任一种的侧链 ； 其中 Z 是 OH， NH2， SH， NH-R′或 S-R′ ； 其中 R′是除 H 之外的任何取代基 ； 并且其中 X 和 Y 各自是 S 或 O， 并且如果 R′是 H， 则R是L 构象。在一些实施方式中， 掺入免疫原的一个或多个非天然氨基酸可任意包含下列一个或 多个 ： 对 - 硝基苯丙氨酸 ； 邻 - 硝基苯丙氨酸 ； 间 - 硝基苯丙氨酸 ； 对 - 硼羰基 (boronyl) Phe ； 邻 - 硼羰基 Phe ； 间 - 硼羰基 Phe ； 对 - 氨基 Phe ； 邻 - 氨基 Phe ； 间 - 氨基 Phe ； 对-酰 基 Phe ； 邻 - 酰基 Phe ； 间 - 酰基 Phe ； 对 -OMe Phe ； 邻 -OMe Phe ； 间 -OMe Phe ； 对 - 磺基 Phe ； 邻 - 磺基 Phe ； 间 - 磺基 Phe ； 5- 硝基 His ； 3- 硝基 Tyr ； 2- 硝基 Tyr ； 硝基取代的 Leu ； 硝基取代的 His ； 硝基取代的 Ile ； 硝基取代的 Trp ； 2- 硝基 Trp ； 4- 硝基 Trp ； 5- 硝基 Trp ； 6- 硝基 Trp ； 7- 硝基 Trp ； 3- 氨基酪氨酸， 2- 氨基酪氨酸， O- 磺基酪氨酸， 2- 硫氧基苯丙氨 酸， 3- 硫氧基氧基苯丙氨酸或对 - 羧基苯丙氨酸， 邻 - 羧基苯丙氨酸和间 - 羧基苯丙氨酸。
     在某些实施方式中， 产生或增强的免疫应答所针对的靶标部分可以是非自身部 分， 如， 来源于细菌、 病毒、 真菌、 支原体、 原生生物、 蠕虫或朊蛋白的部分。非自身靶标部分 可任意包含以下一种或多种 ： 细菌抗原， 病毒抗原， 真菌抗原， 支原体 1 抗原， 原生动物抗 原， 蠕虫抗原， 朊病毒抗原， HIV 抗原， HIVgp120， HIV gp41， HIV gag， HIV pol， HIV env， HIV tat， HIV nef， HIV rev， 杯状病毒衣壳抗原， 乙型肝炎核心抗原， 乙型肝炎表面抗原， δ 肝炎 病毒试剂 (hepatitis delta agent)， 单纯疱疹病毒糖蛋白， 水痘带状疱疹病毒糖蛋白， 流 感病毒血凝素， 流感病毒神经氨酸酶， 流感病毒核蛋白， HPV 衣壳蛋白， 副流感病毒血凝素 / 神经氨酸酶， 脊髓灰质炎病毒衣壳多肽， Hep A 抗原， 牛痘病毒多肽， 狂犬病病毒糖蛋白 G， 伯 氏疏螺旋体 (B.burgdorferi)OspA， B 型流感嗜血杆菌外膜蛋白， 结核分枝杆菌脂阿拉伯甘 露糖， 结核分枝杆菌 mAPG， 酿脓链球菌 M 蛋白， 肺炎链球菌荚膜多糖， 鼠疫耶尔森菌 F1， 鼠疫
     耶尔森菌 V 抗原， 恶性疟原虫环孢子体 (PfCSP)， 恶性疟原虫孢子体表面蛋白 2(PfSSP2)， 恶 性疟原虫肝脏分级抗原 1 羧基末端 (PfLSA1 c 末端 )， 恶性疟原虫输出蛋白质 1(PfExp-1)， Pfs 48/45， Pfs 28， Pfs 25 或 Pfs 230。
     靶标非自身部分可任意来源于 ( 起源于 ) 下列一种或多种 ： 细菌、 病毒、 真菌、 支 原体、 原生动物、 蠕虫、 朊病毒、 放线菌、 芽孢杆菌、 类杆菌、 波氏杆菌、 巴尔通体、 包柔氏螺旋 体菌、 布鲁氏菌、 弯曲杆菌、 二氧化碳噬纤维菌、 衣原体、 梭菌、 棒状杆菌、 考克斯氏体、 潜蚤、 肠球菌、 埃立克体、 大肠杆菌、 弗朗西斯氏菌、 梭杆菌、 血巴尔通氏体、 嗜血杆菌、 缠绕杆菌、 克雷白氏杆菌、 L 型细菌、 钩端螺旋体、 李斯特菌、 分枝杆菌、 支原体、 奈瑟氏菌、 新立克次氏 体、 诺卡氏菌、 巴氏杆菌、 消化球菌、 消化链球菌、 肺炎球菌、 变形杆菌、 假单胞菌、 立克次氏 体、 罗克利马体、 沙门氏菌、 痢疾杆菌、 金黄色葡萄球菌、 链球菌、 螺旋体、 耶尔森氏菌、 腺病 毒、 甲病毒、 杯状病毒、 冠状病毒、 巨细胞病毒、 犬瘟热病毒、 埃博拉病毒、 肠病毒、 EB 病毒、 黄病毒、 丙型肝炎病毒、 嗜肝 DNA 病毒、 乙型肝炎病毒、 δ 肝炎病毒、 戊型或己型肝炎病毒、 GBV-C、 疱疹病毒、 单纯疱疹病毒、 水痘带状疱疹病毒、 免疫缺陷病毒、 艾滋病毒、 传染性腹膜 炎病毒、 流感病毒、 A 型流感病毒、 白血病病毒、 马尔堡病毒、 正粘病毒、 乳头瘤病毒、 HPV、 副 流感病毒、 副粘病毒、 RSV、 细小病毒、 瘟病毒、 小核糖核酸病毒、 脊髓灰质炎病毒、 痘病毒、 牛痘病毒、 狂犬病病毒、 呼肠病毒、 逆转录病毒、 轮状病毒、 犁头霉、 支顶孢、 链格孢、 曲霉、 一 蛙粪霉菌、 双极霉、 子囊酵母、 念珠菌、 假丝酵母、 一耳霉、 隐球菌、 叶枯病菌、 表皮癣菌、 外瓶 霉、 地丝菌、 组织胞浆菌、 马杜拉分支菌、 马拉色菌、 小孢子菌、 小丛梗孢、 被孢霉、 毛霉、 拟青 霉、 青霉、 单胞瓶霉、 瓶霉、 绿藻、 足肿菌、 假小托菌、 腐霉、 鼻孢子虫、 根霉、 线状担子菌、 孢子 丝菌、 匍柄霉、 毛癣菌、 毛孢子菌、 木丝霉、 巴贝斯虫、 结肠小袋纤毛虫、 孢子虫、 隐孢子虫、 艾 美虫、 脑胞内原虫、 内阿米巴、 贾第虫、 哈蒙德虫、 肝簇虫、 等孢子球虫、 利什曼虫、 微孢子虫 (Microsporidia)、 新孢子虫、 微孢子虫 (Nosema)、 五鞭毛虫、 疟原虫、 恶性疟原虫、 肺囊虫、 肉孢子虫、 血吸虫、 泰来虫、 弓形体、 锥虫、 棘唇虫、 猫圆线虫、 钩虫、 管圆线虫、 蛔虫、 布鲁格 氏丝虫、 仰口线虫、 毛细线虫、 夏氏线虫、 古柏线虫、 环体线虫、 网尾线虫、 膨结虫、 棘唇线虫、 绦虫、 复孔绦虫、 恶丝虫、 龙线虫、 蛲虫、 类丝虫、 血矛线虫、 兔唇蛔虫、 洛阿多肽、 曼森线虫、 缪勒线虫、 侏形吸虫、 钩虫、 细颈线虫、 结节线虫、 盘尾虫、 后睾吸虫、 胃线虫、 副丝虫、 肺吸 虫、 副蛔虫、 泡翼线虫、 原圆虫、 腹腔丝虫、 旋尾线虫、 宫绦虫、 冠丝虫、 类圆线虫、 圆线虫、 吸 吮线虫、 弓蛔线虫、 弓首蛔虫、 旋毛虫、 虹膜钩虫、 鞭虫属、 钩虫、 或吴策线虫。
     在本发明的其它实施方式中， 产生或增强的免疫应答所对抗的靶标部分可任意包 含对象的自身部分。自身部分可任意包含任何多种疾病相关部分， 如自身免疫病相关自身 抗原、 肿瘤相关抗原、 阿耳茨海默病相关抗原、 淀粉样蛋白 β40、 淀粉样蛋白 β42、 乳腺癌 相关抗原、 卵巢癌相关抗原、 前列腺癌相关抗原、 MAGE、 BAGE、 RAGE、 NY-ESO、 谱系特异性肿 瘤相关抗原、 黑色素细胞 - 黑色素瘤谱系抗原、 MART-1/Melan-A、 酪氨酸酶或酪氨酸酶相关 蛋白质、 酪氨酸酶相关蛋白质 2、 PSMA、 PSA、 突变的 ras、 重排的 bcr/ab1、 Her2/neu、 突变 或野生型 p53、 细胞色素 P450 1B1、 N- 乙酰葡糖胺基转移酶 -V 的异常表达的内含子序列、 CA19-9、 p53、 OCAA、 HOXB7、 Cal25、 PSA、 PSMA、 STEAP、 PCTA-1、 Ca15-3、 EGF、 EGFR、 HER-1、 CXCR4、 G 蛋白偶联受体 (GCPR) 或 CA27-29。
     在一些实施方式中， 靶标自身部分是 TNFα， 并且非天然免疫原是非天然 TNFα。 例如， 在对象为小鼠的实施方式中， 靶标部分可以是 mTNFα， 并且免疫原可以是非天然mTNFα， 如包括 pNO2Phe86-mTNFα、 pNO2Phe11-mTNFα、 pNO2Phe19-mTNFα、 pNO2Phe21-mTNFα、 pNO2Phe42-mTNFα、 pNO2Phe49-mTNFα、 pNO2Phe104-mTNFα 或 pNO2Phe113-mTNFα 的 非 天 然 mTNFα。
     相似的， 当对象是人时， 靶标自身部分可以是 hTNFα， 并且免疫原可以是非天 11 19 21 然 hTNFα，如 pNO2Phe -hTNFα、 pNO2Phe -hTNFα、 pNO2Phe -hTNFα、 pNO2Phe42-hTNFα、 pNO2Phe49-hTNFα、 pNO2Phe87-hTNFα、 pNO2Phe105-hTNFα 和 pNO2Phe114-hTNFα。
     在另一方面， 本发明了预防性或治疗性处理对象中疾病状态的方法， 如， 通过在对 象中产生 B- 细胞介导的应答和 / 或 T- 细胞介导的应答。 在各种实施方式中， 疾病状态包括 但不限于如下一种或多种 ： 自身免疫病、 癌症、 细菌感染、 病毒感染、 真菌感染、 支原体感染、 朊蛋白感染、 原生动物感染或蠕虫感染。该方面方法的一个集合包括将包含一个或多个非 天然氨基酸的非天然免疫原给予对象， 如人、 猴、 小鼠、 大鼠、 奶牛、 猪、 鸡、 笼中鸟、 鸟舍鸟、 爬行动物和两栖动物。 因此非天然免疫原刺激对象体内产生交叉反应对抗一种或多种靶标 部分如对象体内的多肽和 / 或糖的抗体， 或对抗能够在对象体内与疾病状态相关的一种或 多种靶标部分。在该方面方法的第二个集合中， 本发明包括通过产生对抗一个或多个靶标 部分 ( 如与疾病状态 / 状况相关的疾病相关部分 ) 的抗体， 预防性或治疗性处理对象体内 疾病状态。 产生此类抗体包括创造对抗包含一个或多个非天然氨基酸的非天然免疫原的抗 体， 其中所述抗体交叉反应对抗靶标部分。然后将抗体给予对象。
     该方面方法中的非天然免疫原通常对应对象体内的至少一个靶标部分 ( 或者对 应能够在对象体内的至少一个靶标部分 )。 在多种实施方式中， 靶标部分可包含第一个氨基 酸序列， 非天然免疫原可包含与靶标序列相同的第二个氨基酸序列， 除了靶标部分序列的 一个或多个天然氨基酸被替换为免疫原序列中的一个或多个非天然氨基酸。或者或此外， 靶标部分可包含第一氨基酸序列， 非天然免疫原可包含第二氨基酸序列， 其中免疫原序列 与靶标部分序列相同， 除了免疫原序列还包含一个或多个另外的非天然氨基酸序列。非天 然免疫原可包含与其起源的靶标部分基本相似的结构， 和 / 或可包含与其起源的靶标基本 相似的三级和 / 或四级结构。
     该方面方法中非天然免疫原中出现的一个或多个非天然氨基酸可任意被抗体接 近。一种或多种交叉反应抗体可任意对靶标部分上的表位具有特异性， 所述表位包含与非 天然免疫原上的对应表位的相同序列。然而， 交叉反应抗体可任意对靶标部分上的表位具 有特异性， 与非天然免疫原的对应表位相比， 所述表位包含不同的序列， 如任意包含一个或 多个非天然氨基酸的不同序列。
     在该方面的不同实施方式中， 给予对象的或产生对抗其抗体的免疫原可通过前述 方面或本文其它地方所述任何方法产生。非天然免疫原可任意包括任何非天然氨基酸， 如 前述方面或本文其它地方所述任何非天然氨基酸。靶标部分可任意包含非自身部分部分， 如包含前述方面或本文其它地方所述的任何非自身部分， 如疾病相关自身部分， 如前述方 面或本文其它地方所述的那些。
     在该方面的一些实施方式中， 靶标部分是 TNFα， 并且预防性或治疗性处理疾病状 态的方法可任意包括处理下列疾病状态的一种或多种 ： 内毒素休克、 脑疟疾、 自身免疫病、 多器官功能衰竭、 多发性硬化症、 心脏功能障碍、 动脉粥样硬化、 缺血再灌注损伤、 胰岛素抵 抗、 类风湿关节炎、 克罗恩病、 炎性肠病、 恶病质、 感染性休克、 艾滋病、 移植物抗宿主病、 杀菌肉芽肿、 成人呼吸窘迫综合症、 二氧化硅致肺纤维化。
     在一些实施方式中， 其中所述对象是小鼠， 靶标部分可以是 mTNFα， 并且免疫 86 11 原 可 以 是 非 天 然 mTNFα， 如 非 天 然 mTNFα， 包 括 pNO2Phe -mTNFα、 pNO2Phe -mTNFα、 19 21 42 p N O 2 P h e - m T N F α 、p N O 2 P h e - m T N F α 、p N O 2 P h e - m T N F α 、p N O 2 P h e 4 9 - m T N F α 、 pNO2Phe104-mTNFα 和 pNO2Phe113-mTNFα。在对象是人的一些实施方式中， 自身部分可以 11 是 hTNFα， 并 且 免 疫 原 可 以 是 非 天 然 hTNFα， 如 pNO2Phe -hTNFα、 pNO2Phe19-hTNFα、 p N O 2 P h e 2 1 - h T N F α 、p N O 2 P h e 4 2 - h T N F α 、p N O 2 P h e 4 9 - h T N F α 、p N O 2 P h e 8 7 - h T N F α 、 pNO2Phe105-hTNFα 和 pNO2Phe114-hTNFα。
     在另一方面， 本发明提供产生疫苗的方法 ( 以及产生的疫苗 )， 此类方法包括鉴定 不包含非天然氨基酸的靶标部分， 如多肽和 / 或糖， 用于抗体疗法， 气功包含一个或多个非 天然氨基酸的非天然免疫原， 以及将非天然免疫原与一种或多种药学上可接受的佐剂、 载 体或赋形剂混合， 从而产生疫苗。 这些方法中提供的非天然免疫原可与靶标部分结构相似， 从而当给予对象时， 如前述方面或本文其他地方所述， 该对象将产生与靶标部分交叉反应 对抗非天然免疫原的抗体。
     该方面方法中的非天然免疫原对应对象体内的至少一个靶标部分 ( 或者对应能 够在对象体内的至少一个靶标部分 )。 在多种实施方式中， 靶标部分可包含第一个氨基酸序 列， 非天然免疫原可包含与靶标序列相同的第二个氨基酸序列， 除了靶标部分序列的一个 或多个天然氨基酸被替换为免疫原序列中的一个或多个非天然氨基酸。或者或此外， 靶标 部分可包含第一氨基酸序列， 非天然免疫原可包含第二氨基酸序列， 其中免疫原序列与靶 标部分序列相同， 除了免疫原序列还包含一个或多个另外的非天然氨基酸序列。非天然免 疫原可包含与其起源的靶标部分基本相似的结构， 和 / 或可包含与其起源的靶标基本相似 的三级和 / 或四级结构。
     非天然免疫原中出现的非天然氨基酸可任意被抗体接近。 一种或多种交叉反应抗 体可任意对靶标部分上的表位具有特异性， 所述表位包含与非天然免疫原上的对应表位的 相同序列。 然而， 交叉反应抗体可任意对靶标部分上的表位具有特异性， 与非天然免疫原的 对应表位相比， 所述表位包含不同的序列， 如任意包含一个或多个非天然氨基酸的不同序 列。
     在各种实施方式中， 提供以产生疫苗的免疫原本身可通过前述方面或本文其他地 方所述任何方法产生。 非天然免疫原还可任意包含前述方面或本文其他地方所述非天然氨 基酸。靶标部分可任意包含非自身部分， 如包含上述方面或本文其它地方所述的任何非自 身抗原或部分， 如疾病相关自身部分， 如前述方面或本文其它地方所述的那些中的任何部 分。
     在本方面一些实施方式中， 靶标自身部分可以是 TNFα， 例如， 在对象是小鼠的 实施方式中， 靶标自身部分可以是 mTNFα， 并且免疫原可以是非天然 mTNFα， 如非天然 86 11 19 21 mTNFα，包 括 pNO2Phe -mTNFα、 pNO2Phe -mTNFα、 pNO2Phe -mTNFα、 pNO2Phe -mTNFα、 42 49 104 pNO2Phe -mTNFα、 pNO2Phe -mTNFα、 pNO2Phe -mTNFα 以 及 pNO2Phe113-mTNFα。 在 对象是人的一些实施方式中， 靶标自身部分可以是 hTNFα， 并且免疫原可以是非天然 11 19 21 hTNFα， 如 pNO2Phe -hTNFα、 pNO2Phe -hTNFα、 pNO2Phe -hTNFα、 pNO2Phe42-hTNFα、 pNO2Phe49-hTNFα、 pNO2Phe87-hTNFα、 pNO2Phe105-hTNFα 和 pNO2Phe114-hTNFα。在另一方面， 本发明还提供了在细胞中产生包含 pNO2Phe86-TNFα 的非天然 TNFα 的方法。所述方法包括在合适培养基中培养细胞。在此类实施方式中， 细胞可包含编码 TNFα 的核酸， 并且在 86 位氨基酸包含至少一个选择性密码子。细胞还可包含识别选择性 密码子的正交 -tRNA(O-tRNA)， 以及优先用 pNO2Phe 酰胺化 O-tRNA 的正交氨酰基 -tRNA 合成 酶 (O-RS)。 所述方法还包括提供 pNO2Phe， 它允许优先用 pNO2Phe 酰胺化 O-tRNA 的 (O-RS)， 并且允许正交氨酰基 -tRNA 合成酶将 pNO2Phe 掺入到对应选择性密码子的 86 位氨基酸， 从而产生非天然 TNFα。本文的其它实施方式包括通过相似的修饰在任何所需位置使用任 何所需非天然氨基酸产生任何其他非天然免疫原的方法 ( 如， 所需免疫原的核酸， 在所需 位置的合适选择性密码子， 存在所需的非天然氨基酸 s， 以及合适的对应的正交机器 ORS， OtRNA 等 )。
     本发明还提供非天然 TNFα。 本发明提供的非天然 mTNFα 包括 pNO2Phe86-mTNFα、 p N O 2 P h e 1 1 - m T N F α 、p N O 2 P h e 1 9 - m T N F α 、p N O 2 P h e 2 1 - m T N F α 、p N O 2 P h e 4 2 - m T N F α 、 pNO2Phe49-mTNFα、 pNO2Phe104-mTNFα 以 及 pNO2Phe113-mTNFα。 本 发 明 提 供 的 非 天 然 包 括 pNO2Phe11-hTNFα、 pNO2Phe19-hTNFα、 pNO2Phe21-hTNFα、 pNO2Phe42-hTNFα、 pNO2Phe49-hTNFα、 pNO2Phe87-hTNFα、 pNO2Phe105-hTNFα、 pNO2Phe114-hTNFα， 本文还提供包 含这些非天然 TNFα 的组合物。
     本发明还提供了对抗上述非天然 TNFα 的抗体， 以及包含这些抗体的组合物。本 发明还提供了交叉反应对抗不包含任何非天然氨基酸的天然 TNFα 以及包含一个或多个 非天然氨基酸的 TNFα 的抗体， 以及包含这些抗体的组合物。
     本发明还提供了包含 pNO2Phe43mRBP4 的非天然 mRBP4， 以及包含该非天然 mRBP4 的 组合物。此外， 本发明提供对抗该非天然 mRBP4 的抗体， 所述抗体交叉对抗不含非天然氨基 酸的 RBP4， 以及包含这些抗体的组合物。
     在本文的不同方面， 掺入非天然免疫原的一个或多个非天然氨基酸在合成免疫原 的过程中完成。在一些实施方式中， 通过除翻译后修饰或合成后化学修饰之外的工艺将一 个或多个非天然氨基酸掺入非天然免疫原。 因此， 在各种实施方式中， 通过如下一种或多种 方式将一个或多个非天然氨基酸掺入到非天然免疫原中 ： 正交翻译 ； 体外翻译 ； 天然化学 连接 ； 表达蛋白质连接 ； 或固相合成。 在本文的不同实施方式中， 非天然免疫原包含 20 种天 然产生的经典氨基酸中的一种或多种， 所述氨基酸已被糖基化、 硝基芳基修饰、 硝化、 烷化、 乙酰化、 氧化、 硫酸化或磷酸化 ( 如通过除了翻译后修饰外的工艺或通过除了化学修饰外 的工艺糖基化、 硝基芳基修饰、 硝化、 烷化、 乙酰化、 氧化、 硫酸化或磷酸化 )。
     在一些实施方式中， 本发明提供包含用于制造本发明所述方法和组合物的试剂盒 或物品。此类试剂盒可任意包含一个或多个容器、 标签和说明书， 以及用于构建抗体和 / 或 非天然免疫原和 / 或真实抗体和 / 或非天然免疫原 ( 如非天然 TNFαs) 的组分。试剂盒还 可任意包含一种或多种抗体 ( 如， 对抗非天然免疫原的抗体， 所述抗体交叉反应对抗对象 体内的天然靶标部分 ) 和 / 或一种或多种非天然免疫原以及任意其它组分 ( 如各种抗生 素， 各种抗真菌药物等 )。此类非天然免疫原包括但不限于 ： 任意一种或多种本发明提供的 非天然 TNFα， 或者任何本文所述的其它非天然免疫原。 试剂盒还任意包括试管或其它容器 ( 如， 玻璃、 塑料、 尼龙、 棉、 聚酯、 金属等容器 ) 用于储存组分， 或者在其中混合 / 制备组分， 以及一种或多种进行对象 ( 如， 需要治疗的人等 ) 给药的设备。在一些实施方式中， 进行对象给予组分的设备包括储存和 / 或混合 / 制备组分的容器。
     试剂盒还任意包含除本发明抗体 / 非天然免疫原组分外的其他组分， 如缓冲液、 稀释剂、 滤器、 敷料、 绷带、 喷头、 纱布、 屏障、 半渗透屏障、 亚舍板、 针头和注射器等。
     在一些实施方式中， 试剂盒包含涉及使用试剂盒治疗对象一种或多种医学病症 / 疾病状态的说明书 ( 如书面指导 )。在一些实施方式中， 试剂盒包含用户联系进行指导的 URL 地址或电话号码等。试剂盒可以是单位剂量， 散装包 ( 多次给药包装 ) 或亚单位剂量。
     本领域熟练技术人员明白本发明的方法和组合物可单独使用或与其它联用。
     在阅读下文详述和附图以及权利要求后， 本发明的这些以及其他特点将更加完全 明晰。
     定义
     在进行本发明详述之前， 应当理解的是本发明不限于特定设备或生物学系统， 当 然它们可以是多种多样的。 。应当理解本文所使用的术语仅为了描述特定的实施方式而不 是限制性的。在本说明书和权利要求书中所用的单数形式 “一个” ， “一种” 和 “该” 包括多 个指示物， 除非上下文中有明显的表示。因此， 例如， 提到 “一个表面” 时包括两个或多个表 面的组合 ； 提到 “细菌” 时包括细菌的混合物等。
     除非另有限定， 在此使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域技术人员的 通常理解一致。虽然也可采用与本文所述相似或等同的任何方法和材料实施或测试本发 明， 但下面描述了优选的方法和材料。 在说明和要求保护本发明的过程中， 将依据以下定义 使用以下术语。
     抗体 ： 本文所用 “抗体” 完全或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码 的一种或多种多肽。公认的免疫球蛋白基因包括 κ、 λ、 α、 γ、 δ、 ε 和 μ 恒定区基因， 以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为 κ 或 λ。重链归类为 γ、 υ、 α、 δ或 ε， 它们分别依次定义免疫球蛋白类型 IgG、 IgM、 IgA、 IgD 和 IgE。一种典型的免疫球蛋白 ( 如抗体 ) 的结构单位包含四聚体。各四聚体由两个相同的多肽链对组成， 各对有一条 “轻 链” ( 约 25kD) 和一条 “重链” ( 约 50-70kD)。各链的 N 末端确定约 100-110 或更多氨基酸 的可变区， 主要负责抗原识别。术语轻链可变区 (VL) 和重链可变区 (VH) 分别指这些轻链 和重链。
     抗体可以完整的免疫球蛋白或用不同肽酶消化产生许多良好表征的片段存在。 因 此， 例如， 胃蛋白酶在铰链区中的二硫连接下面消化抗体， 产生 F(ab′ )2， Fab 的二聚体， 其 本身是由二硫键连接于 的轻链。可在温和条件下还原 F(ab′ )2 以打断铰链区中 的二硫连接， 从而将 F(ab′ )2 二聚体转化为 Fab′单体。 Fab′单体实质上是具有部分铰链 区的 Fab( 对其它抗体片段的更详细描述参见， 《基础免疫学》 (Fundermental Immunology)， W.E.Paul 编， Raven Press， N.Y.(1999))。虽然根据完整抗体的消化定义了不同抗体片段， 但是本领域技术人员将理解， 也可用化学方法或通过重组 DNA 的方法从头合成所述 Fab′ 片段等。因此， 本文中所用术语抗体， 也包括通过全抗体修饰或用重组 DNA 方法从头合成所 产生的抗体片段。抗体包括单链抗体， 包括单链 Fv(sFv 或 scFv) 抗体， 其中由可变重链和 可变轻链连接在一起 ( 直接或经由肽接头 ) 形成连续的多肽。
     与两个或多个不同部分 “交叉反应” 的抗体能够与不同部分中的每一个结合， 如 通过本领域熟练技术人员所知的 ELISA、 FACS 或其他方法。例如， 与非天然 TNFα 如本文所述的非天然氨基酸中任一种如 pNO2Phe86mTNFα 结合的抗体， 并且与天生 ( 或天然 ) TNFα( 它不包含任何 ) 结合， 因此与两部分交叉反应。 在本文的具体实施方式种， 对抗非天 然蛋白质的抗体交叉反应相同蛋白的天然版本 ( 即相同的但不包含非天然氨基酸的蛋白 质 )。在各种实施方式中， 与非天然分子结合的抗体以与非天然分子结合能力的约 1-50％ 或 50-100％或更多与相同分子的天然版本交叉反应。
     抗原 ： 本文所用术语 “抗原” 指在用其进行免疫的对象种诱导抗体反应的分子或物 质。抗原可以是蛋白质、 肽、 糖、 核酸、 脂类、 半抗原或其它天然产生的或合成的化合物 ( 或 其组合 )。抗原可以是， 如先天的 ( 自身 ) 抗原， 或可以来源于如细菌、 病毒、 寄生虫、 真菌 等。该术语还引申为多种肿瘤抗原、 自身免疫病相关抗原等。
     同源 ： 术语 “同源” 指一起发挥功能的组分， 或彼此具有某方面的特异性， 如正交 tRNA(O-tRNA) 和正交氨酰基 -tRNA 合成酶 (O-RS)， 其中 O-RS 特异性用非天然氨基酸酰胺 化 O-tRNA。
     衍生自 ： 本文所用的术语 “衍生自” 指分离自特定分子或生物， 或是用特定分子或 生物的序列信息制得的某组份。例如， 衍生自第二多肽的多肽含有与该第二多肽的氨基酸 序列相同或基本上类似的氨基酸序列。以多肽为例， 可通过， 例如天然产生的诱变、 人工定 向诱变或人工随机诱变获得衍生的种类。 用于衍生多肽的诱变可以是有意定向或有意随机 的， 或混用两种方法。诱变多肽以产生衍生自第一 ( 多肽 ) 的不同多肽可以是随机的 ( 例 如， 聚合酶失真所致 )， 可通过合适的筛选方法， 例如本文引用的参考文献中所述的方法鉴 定衍生的多肽。诱变多肽通常需要对编码该多肽的多核苷酸进行操作。 靶标部分或靶标分子 ： “靶标部分” 、 “靶标分子” 、 “靶标蛋白质部分” 、 “靶标抗原” 等指如蛋白质、 肽、 糖、 脂、 核酸或此类组合的部分， 通过应用本发明， 对抗所述部分期望创 造 / 增强免疫应答。因此， 靶标部分可以是天生的 ( 自身 ) 或外源性 ( 外来 ) 分子。应当理 解的是本文中具体实施例的引用如， TNFα， 不应视为限制性的， 并且靶标部分 ( 以及因此 与其对应的非天然免疫原 ) 可以是需要免疫应答的任何分子。因此， 靶标部分是在其基础 之上进行非天然免疫原模拟或设计， 进行衍生， 与之对应的部分。如下文详述， 非天然免疫 原包含与靶标部分相同或基本相同的序列， 除了非天然免疫原包含一个或多个非天然氨基 酸 ( 并创造自如， 正交翻译系统， 体外翻译系统等， 和 / 或通过除了翻译后修饰或化学修饰 之外的方法 )。在许多实施方式中， 靶标部分是疾病相关部分， 即在对象体内由于疾病状态 ( 如， 癌症， 自身免疫病， 来自感染性有机体或由其引起的， 如细菌、 病毒、 软蛋白、 支原体、 真 菌、 寄生虫等 ) 引发或出现的部分。天然靶标部分 ( 即不包括非天然氨基酸 ) 可以是抗原 靶标部分 性的 / 和或免疫原性的或并非如此 ( 如可以是弱免疫原性 )。 在具体实施方式中， 的非天然版本 ( 如与天然靶标部分相似但包含用一个或多个非天然氨基酸替换靶标部分 中对应天然氨基酸， 和 / 或在靶标部分中加入氨基酸 ) 是抗原性的和 / 或免疫原性的 ( 而 不管天然靶标部分是否为抗原性和 / 或免疫原性 )。 将此类非天然靶标部分描述为 “非天然 靶标部分” 、 “非天然抗原” ， 或者更常常描述为 “非天然免疫原” 等。因此， 本文中 “非天然” 免疫原、 部分、 分子等包含一个或多个非天然氨基酸。在一些这种非天然部分中， 非天然氨 基酸可全部或任意被抗体接近 ( 如， 抗体可结合包含非天然氨基酸的部分的区域 )。
     有效量 ： 术语 “有效量” 指足以产生所需结果的剂量或量。所需结果可包括在剂量 或量的接受者中客观或主观的改善 ( 如产生交叉反应抗体， 长期存活， 肿瘤数目和 / 或大小
     的减少， 有效预防或部分预防疾病状态等 )。
     编码 ： 本文所用术语 “编码” 是指聚合物大分子或序列串内的信息用于指导与第一 分子或序列串不同的第二分子或序列串的合成所依据的任何程序。在本文中， 该术语用途 广泛， 具有多种用途。在某些方面， 术语 “编码” 用于描述 DNA 半保守复制的过程， 其中双链 DNA 分子的一条链用作模板， 由 DNA 依赖性的 DNA 聚合酶编码合成新互补姊妹链。 在另一方 面， 术语 “编码” 是指一个分子内的信息用于指导化学性质与第一分子不同的第二分子的合 成所依据的任何程序。例如， DNA 分子可编码 RNA 分子， 例如， 通过有 DNA 依赖性的 RNA 聚 合酶参与的转录过程。另外， RNA 分子可编码多肽， 如翻译过程。当术语 “编码” 用于描述 翻译过程时， 该术语还指编码氨基酸的三联密码子。在某些方面， RNA 分子也可编码 DNA 分 子， 例如， 通过有 RNA 依赖性的 DNA 聚合酶参与的逆转录过程。在另一方面， DNA 分子可编 码多肽， 此时 “编码” 应当被理解为既包括转录过程又包括翻译过程的情况。
     免疫原 ： 本文所用 “免疫原” 指可任意给予对象诱导免疫应答的部分。 “非天然免 疫原” 指包含一个或多个非天然氨基酸的部分， 如靶标部分， 如疾病相关部分， 可将其给予 对象诱导免疫应答。参见上文。对于本发明的非天然免疫原， 通过此类免疫应答产生的血 清抗体、 B- 细胞和 / 或 T- 细胞可方便的交叉反应对抗不包含非天然氨基酸的天然靶标部 分 ( 如， 免疫原起源的部分， 在其基础上进行模拟 / 设计的部分， 及其对应的部分 )， 由此产 生对抗天然靶标部分的免疫应答。 因此， 在一些实施方式中， 非天然免疫原可诱导对抗疾病 的保护性免疫应答 ( 或者用于治疗疾病状态 )， 所述疾病与非天然免疫原来源的天然靶标 部分相关 ( 或非天然免疫原与其对应 )。
     免疫原性组合物 ： “免疫原性组合物” 是包含一个或多个分子的组合物， 将组合物 给予对象后在对象体内引起对部分的体液和 / 或细胞免疫应答。免疫原性组合物可知界引 入接受对象体内， 如通过注射、 吸入、 口服、 鼻内和粘膜 ( 如， 直肠内或阴道内 ) 给药。
     免疫学应答或免疫应答 ： 对于 ( 靶标 ) 部分或其组合物的 “免疫学应答” 或 “免疫 应答” 指在对象体内产生对于部分的细胞和 / 或抗体介导的免疫应答。通常， 免疫应答包括 但不限于下列效应中的一种或多种 ： 产生抗体 ( 优选 )、 B 细胞、 辅助 T 细胞、 抑制 T 细胞和 / 或细胞毒性 T 细胞和 / 或 γδT 细胞， 特异性靶向 ( 靶标 ) 部分的一个或多个抗原。在 各种实施方式中， 对象显示治疗性或预防性免疫学应答， 因此增强了对于 ( 靶标 ) 部分的耐 受， 和 / 或降低了 ( 靶标 ) 部分所引起的 / 所相关的疾病状态的临床严重性。
     对……响应 ： 本文用于产生非天然分子中的术语 “对……响应” 指 O-tRNA 识别选 择性密码子并介导与 tRNA 偶联的非天然氨基酸掺入生长的多肽链中的过程。
     正交的 ： 在本文中， 术语 “正交的” 是指一种分子， 如正交 tRNA(O-tRNA) 和 / 或正交 氨酰 -tRNA 合成酶 (O-RS)， 与细胞的内源性组分一起行使功能时与细胞或翻译系统的相应 分子相比其效率降低， 或者与细胞的内源性组分一起无法行使功能。 对于 tRNA 和氨酰 tRNA 合成酶来说， 正交是指正交 tRNA 与内源性 tRNA 合成酶一起行使功能时和内源性 tRNA 与内 源性 tRNA 合成酶一起形式功能相比， 或者正交氨酰 tRNA 合成酶与内源性 tRNA 一起行使功 能时和内源性 tRNA 合成酶与内源性 tRNA 一起形式功能相比， 无效或效率降低， 例如效率低 于 20％、 10％、 5％或 1％。正交分子在细胞内缺乏正常内源性互补分子的功能。例如， 与内 源性 RS 氨酰化内源性 tRNA 相比， 细胞所有的内源性 RS 氨酰化细胞内的正交 tRNA 的效率 都降低， 或者效率为 0。在另一个实施例中， 与内源性 RS 氨酰化内源性 tRNA 相比， 正交 RS氨酰化细胞的所有内源性目的 tRNA 的效率都下降， 或者效率为 0。第二正交分子可被导入 细胞内与第一正交分子一起行使功能。例如， 正交 tRNA/RS 对包括导入的互补组分， 二者在 细胞内一起行使功能， 与对照如相应的 tRNA/RS 内源对或活性正交对， 其效率为对照的， 例 如， 45％、 50％、 60％、 70％、 75％、 80％、 90％、 95％、 99％或更高。
     正交氨酰基 tRNA 合成酶 ： 如本文所用正交氨酰基 tRNA 合成酶 (O-RS) 指在感兴趣 的翻译系统中使用氨基酸优先酰胺化 O-tRNA 的酶。被 O-RS 装载至 O-tRNA 上的氨基酸可 以是任何氨基酸， 不论天然、 非天然或人工的， 本文不作限制。优选与天然产生的酪氨酰氨 基酸合成酶相同或同源的合成酶， 或者与指定为 OR-S 的合成酶相同或同源。
     正交 tRNA ： 本文所用正交 tRNA(O-tRNA) 指与感兴趣翻译系统正交的 tRNA， 其中 tRNA 是， 如 (1) 与天然产生的 tRNA 相同或基本相似， (2) 来源于通过天然或人工诱变产生 的天然产生的 tRNA， (3) 来源于任何将 (1) 或 (2) 中野生或突变 tRNA 序列考虑其中的工 艺， (4) 与野生型或突变 tRNA 同源 ； (5) 与任何设计为正交 tRNA 合成酶底物的 tRNA 示例同 源， 或 (6) 任何设计为正交 tRNA 合成酶底物的 tRNA 示例的保守性变体。O-tRNA 可以携带 氨基酸的状态存在， 或者以非携带状态存在。还应当理解的是同类合成酶使用非天然氨基 酸可任意使 “O-tRNA” 处于携带状态 ( 酰胺化 )。事实上， 应当理解的是在转录中， 作为对于 选择性密码子的响应， 可方便使用 O-tRNA 将基本上任何非天然氨基酸插入生长的多肽中。
     药物组合物 ： 本文中术语 “药物组合物” 指适合对象中药学用途或给予对象 ( 包括 动物或人 ) 药物的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性药物， 如本发明的抗体和 / 或非天然免疫原， 以及药学上可接受的载体、 缓冲液、 佐剂等。 “药学上可接受的” 或 “药理 学上可接受的” 材料指非生物学或其它不需要的材料， 即在制剂或组合物中给予个体时， 不 引起任何 ( 或很少引起 ) 不需要的生物学效应或者与组合物中任何组分以有害方式相互作 用。
     多肽 ： 多肽是指任何长度的， 通常但不绝对是由共价肽键连接在一起的氨基酸残 基 ( 天然的或非天然的， 或其组合 ) 的任何寡聚物。多肽可以是任何来源的， 例如， 天然多 肽、 通过重组分子基因技术制备的多肽、 细胞和翻译系统来源的多肽、 或者以无细胞合成方 式制备的多肽。多肽的特征由其氨基酸序列决定， 例如， 其组成氨基酸残基的一级结构。在 本文中， 多肽的氨基酸序列不限于全长序列， 也可能是部分序列或完整序列。另外， 这并不 意味着根据拥有或不拥有任何特定生物活性来限制多肽。在本文中， 术语 “蛋白质” 是多肽 的同义词。术语 “肽” 是指小的多肽， 例如而不限于 2-25 个氨基酸长度的多肽。
     优选酰胺化 ： 在本文中关于正交翻译系统中， 在表达系统中， 当 O-RS 使 O-tRNA 携 带氨基酸比它使任何内源性 tRNA 效率更高时， O-RS “优先酰胺化” 同类 O-tRNA。 即当 O-tRNA 和任何给定的内源性 tRNA 以近似相等摩尔比出现在翻译系统中时， O-RS 使 O-tRNA 携带 ( 氨基酸 ) 比使内源性 tRNA 携带 ( 氨基酸 ) 频率更高。优选 O-RS 进行携带的 O-tRNA 与 O-RS 进行携带的内源性 tRNA 的相对比例高， 当 O-tRNA 和内源性 tRNA 以近似相等摩尔比出 现在翻译系统中时优选 O-RS 只对或接近只对 O-tRNA 进行携带。当 O-tRNA 和内源性 tRNA 以相等摩尔比存在时， O-RS 进行携带的 O-tRNA 和内源性 tRNA 的相对比例大于 1 ∶ 1， 优选 至少约 2 ∶ 1， 更优选 5 ∶ 1， 更优选 10 ∶ 1， 更优选 20 ∶ 1， 更优选 50 ∶ 1， 更优选 75 ∶ 1， 更优选 95 ∶ 1， 98 ∶ 1， 99 ∶ 1， 100 ∶ 1， 500 ∶ 1， 1,000 ∶ 1， 5,000 ∶ 1 或更高。
     当 (a) 与内源性 tRNA 相比， O-RS 优选酰胺化 O-tRNA， 和 (b) 与 O-RS 使用任何天然氨基酸酰胺化 O-tRNA 相比， 酰胺化对于非天然氨基酸具有特异性， O-RS“优选使用非天 然氨基酸进行酰胺化” 。即， 当非天然和天然氨基酸以相等摩尔比出现在含 O-tRNA 和内源 性 tRNA 的翻译系统中时， O-RS 用非天然氨基酸装载 O-tRNA 的频率比用天然氨基酸高。优 选携带非天然氨基酸的 O-tRNA 与携带天然氨基酸的 O-tRNA 比率高。更优选， O-RS 仅用或 接近仅用非天然氨基酸使 O-tRNA 进行携带。当天然氨基酸和非天然氨基酸以相等摩尔比 存在时， 携带非天然氨基酸的 O-tRNA 和携带天然氨基酸的 O-tRNA 的相对比例大于 1 ∶ 1， 优选至少约 2 ∶ 1， 更优选 5 ∶ 1， 更优选 10 ∶ 1， 更优选 20 ∶ 1， 更优选 50 ∶ 1， 更优选 75 ∶ 1， 更优选 95 ∶ 1， 98 ∶ 1， 99 ∶ 1， 100 ∶ 1， 500 ∶ 1， 1,000 ∶ 1， 5,000 ∶ 1 或更高。
     预防性处理 ： “预防性处理” 指当对象不表现疾病、 病理或医学失调的指征或症状 时， 或仅显示早期疾病、 病理或医学失调的指征或症状时对对象给予的处理， 因此给予处理 的目的是减少、 预防或降低疾病、 病理或医学紊乱发生的风险。 预防性处理作为对抗疾病或 失调的预防性处理。 “预防性活性” 指药物的活性， 当给予未显示病理、 疾病或紊乱指征或 症状的对象 ( 或仅显示早期指征或症状的对象 ) 此类非天然免疫原和 / 或抗体时或组合物 时， 减少、 预防或降低对象发生疾病、 病理或医学紊乱的风险。 “预防有用” 的药物或化合物 ( 如本发明的非天然免疫原和 / 或抗体 ) 指用于减少、 预防或降低疾病、 病理或医学紊乱发 生的药物或化合物。
     选择者密码子 ： 术语 “选择者密码子” 是指在翻译过程中能被 O-tRNA 识别但是不 能被内源性 tRNA 识别的密码子。O-tRNA 反密码子环可识别 mRNA 上的选择者密码子， 将其 氨基酸如非天然氨基酸插入到多肽的这个位点上。选择者密码子包括， 例如无义密码子如 终止密码子、 琥珀密码子、 赭石密码子、 乳白密码子 ； 四碱基或多碱基密码子 ； 罕用密码子 ； 天然或非天然碱基对来源的密码子和 / 或等等。
     对象 ： 本文所用术语 “对象” 包括但不限于哺乳动物， 包括如人、 非人灵长类 ( 如 猴 )、 小鼠、 猪、 奶牛、 山羊、 兔、 大鼠、 豚鼠、 仓鼠、 马、 猴、 绵羊或其它非人哺乳动物， 或非哺乳 动物， 如非哺乳脊椎动物， 如鸟 ( 如鸡或鸭 )。 在一些实施方式中， 本发明的方法和组合物用 于处理 ( 预防性和 / 或治疗性 ) 非人动物。许多有重要商用价值的动物对于可任意使用本 发明处理的如癌症或自身免疫病症或各种感染 ( 如病毒 / 细菌等 ) 易感。
     治疗性处理 ： “治疗性处理” 指给予显示病理、 疾病或紊乱指征或症状的对象的处 理， 其中给予对象处理的目的是减少或消除这些病理、 疾病或紊乱指征或症状， 如通常通过 减少和 / 或消除造成这些指征 / 症状的疾病状态。 “治疗性活性” 指药物的活性， 当给予患 病对象此类非天然免疫原和 / 或抗体时或组合物时， 减少或消除对象发生病理、 疾病或紊 乱的指征或症状。 “治疗有用” 的药物或化合物 ( 如本发明的非天然免疫原和 / 或抗体 ) 指 用于减少、 治疗或消除疾病、 病理或医学指征或症状的药物或化合物。
     翻译系统 ： 术语 “翻译系统” 指将氨基酸掺入生长多肽链 ( 蛋白质 ) 的组分。翻译 系统的组分包括， 如核糖体、 tRNA、 合成酶、 mRNA 等。
     处理 ： 本文所用 “处理” 一般指预防感染或再感染， 减少或消除症状， 和 / 或基本或 完全消除病原或疾病状态。处理可以是预防性的， 如在感染前， 疾病状态开始前， 或疾病状 态主要症状发展前， 或治疗性的， 如病原感染猴， 疾病状态开始后， 或疾病状态主要症状发 展后。
     非天然氨基酸 ： 本文所用术语 “非天然氨基酸” (UAA) 指任何氨基酸， 修饰的氨基酸， 和 / 或氨基酸类似物， 而并非 20 种常见天然产生的氨基酸或稀有天然产生的氨基酸如 硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸之一。例如， 非天然氨基酸对 - 硝基苯丙氨酸 ( 图 1A)， 对-磺 基酪氨酸， 和对 - 羧基苯丙氨酸在本文的各种实施方式中具有用途。在一些实施方式中， 非天然氨基酸包括但不限于 ： 对 - 硝基苯丙氨酸 ； 邻 - 硝基苯丙氨酸 ； 间 - 硝基苯丙氨酸 ； 对 - 硼羰基 Phe ； 邻 - 硼羰基 Phe ； 间 - 硼羰基 Phe ； 对 - 氨基 Phe ； 邻 - 氨基 Phe ； 间 - 氨基 Phe ； 对 - 酰基 Phe ； 邻 - 酰基 Phe ； 间 - 酰基 Phe ； 对 -OMe Phe ； 邻 -OMe Phe ； 间 -OMe Phe ； 对 - 磺基 Phe ； 邻 - 磺基 Phe ； 间 - 磺基 Phe ； 5- 硝基 His ； 3- 硝基 Tyr ； 2- 硝基 Tyr ； 硝基 取代的 Leu ； 硝基取代的 His ； 硝基取代的 Ile ； 硝基取代的 Trp ； 2- 硝基 Trp ； 4- 硝基 Trp ； 5- 硝基 Trp ； 6- 硝基 Trp ； 7- 硝基 Trp ； 3- 氨基酪氨酸， 2- 氨基酪氨酸， O- 磺基酪氨酸， 2- 硫 氧基苯丙氨酸， 3- 硫氧基氧基苯丙氨酸或对 - 羧基苯丙氨酸， 邻 - 羧基苯丙氨酸和间 - 羧基 苯丙氨酸。再次应当理解的是本发明不应限于特定的非天然氨基酸。下文显示了非天然氨 基酸的其它信息。
     应当理解的是将在下文对上文术语以及其它术语进行详述。
     附图简要说明
     图 1 显示了 pNO2Phe 的化学结构， mTNFα 三聚体的蛋白质结构， 以及测定 pNO2Phe 掺入突变 mTNFα 蛋白质的效率以及保真度的实验结果。
     图 2 显示了 pNO2Phe86-mTNFα 的 MALDI-TOF 质谱分析。
     图 3 显示了 wt-mTNFα 的 MALDI-TOF 质谱分析。
     图 4 显示了确定在突变 mTNFα 蛋白质的四级结构上进行 Tyr86pNO2Phe 取代效果 的 FPLC 实验结果。
     图 5 显示了不同 mTNFα 突变子的 NFκB-Luc 活性的分析。
     图 6 显示了用 (a)PBS， (b)WT-mTNFα， (c)pNO2Phe86mTNFα 或 (d)Phe86mTNFα 免疫 C57BL/6 小鼠的血清滴度。
     图 7 显 示 了 用 wt mTNFα 或 pNO2Phe86mTNFα 免 疫 Bcl2 小 鼠 抗 wt mTNFα 和 pNO2Phe86mTNFα 的血清滴度。
     图 8 显示了确定在无佐剂存在的条件下用 wt mTNFα 或 pNO2Phe86mTNFα 免疫 Bcl-2 小鼠血清抗 wt mTNFα 或 pNO2Phe86mTNFα 滴度的 ELISA 结果。
     图 9 显示了有无佐剂存在的条件下用 Phe86mTNFα 免疫 Bcl2 小鼠的抗 wtmTNFα 和 Phe86mTNFα 血清滴度。
     图 10A 显示了用 pNO2Phe42mTNFα 或 Phe42mTNFα 免疫 Bcl2 小鼠血清抗 wt mTNFα， pNO2Phe42mTNFα 和 Phe42mTNFα 滴度。图 10B 显示了用 pNO2Phe11mTNFα 或 Phe42mTNFα 免 疫 C57BL/6 小鼠抗 WTmTNFα， PBS 和 pNO2Phe11mTNFα 的血清滴度。
     图 11 显示了在严重内毒素血症模型中用 pNO2Phe86mTNFα 免疫能否提高老鼠生存 的实验结果。
     图 12 显示了 pNO2Phe86-mTNFα 胰蛋白酶解片段的 MS/MS 测序结果。
     图 13 显示了 His6-Phe86mTNFα(WT) 或 His6-pNO2Phe86mTNFα 的 N- 末端 His6 标签 对于后续免疫实验结果无影响。
     图 14 显示了确定血清滴度耐久性的实验结果。
     图 15 显示了 T 细胞增殖实验结果。图 16 显示了 pNO2Phe86mTNFα 免疫促进了类型转换至 IgG 应答， 这表明在小鼠中 对于 WT mTNFα 的交叉反应性， 并且持续了至少 40 周。
     图 17 显示了 mTNFα 的 4 个表面暴露位点， 展示了显著的免疫原性。
     图 18 显示了脂多糖 (LPS) 刺激后用各种 pNO2Phe mTNFα 突变子免疫小鼠得到显 著的生存受益。
     图 19 显示了将 pNO2Phe 掺入自身抗原 mRBP4 是否会丧失对 mRBP4 的耐受。
     图 20 显示了 WT mTNFα 不能维持 pNO2Phe86mTNFα， 诱导耐受性丧失。
     图 21 显示了三个 mTNFα 片段的质谱分析。
     图 22 显示了抗 -mTNFαmAb 与三个 mTNFα 片段的结合。
     图 23 显示了确认将 pNO2Phe 掺入 mTNFα 的表面暴露位点的实验结果。
     图 24 显示了确认将 pNO2Phe 掺入 mRBP4 的表面暴露位点的实验结果。
     图 25 显示了对于 pNO2Phe43mRBP4 和 pNO2Phe108mRBP4 胰蛋白酶解片段的 MS/MS 分 析与 pNO2Phe 的掺入模式相吻合。
     图 26 显示了确定 pNO2Phe43mRBP4 在 C57BL/6 小鼠中免疫原性的实验结果。
     图 27(A) 显示了 pNO2Phe43mRBP4 的含 pNO2Phe 的酶解片段的 MS/MS 测序结果。(B) 显示了 pNO2Phe108mRBP4 的含 pNO2Phe 的酶解片段的 MS/MS 测序结果。 发明详述
     概述
     在产生多种疾病状态的疫苗中具有显著的选择性诱导对抗自身蛋白质或其它自 身分子的能力， 或增强外源抗原特定表位的免疫原性的能力， 所述疾病状态包括癌症、 蛋白 质折叠疾病和感染性疾病 ( 如细菌或病毒感染 )。本发明通过在蛋白质中直接掺入非天然 氨基酸产生有益用于疫苗接种的非天然免疫原， 或者产生用于被动免疫的抗体。在本发明 中， 掺入非天然氨基酸的蛋白质对应接种 / 免疫对象的靶标部分 ( 如疾病相关部分 )( 或者 对应能够在对象体内的靶标部分 )。 在将含非天然氨基酸的免疫原给予对象的实施方式中， 非天然氨基酸的存在引起对抗非天然免疫原的免疫应答。 此类应答产生的抗体有益的交叉 反应对抗免疫原起源 ( 或对应的 ) 的天然靶标部分， 因此产生对抗靶标部分的免疫应答。 本 发明的方法在产生对抗对象体内 ( 或能够在对象体内 ) 的非免疫原性或弱免疫原性靶标部 分的免疫应答中尤其有用。本发明的实施方式还包括给予对象对抗非天然免疫原 ( 即含非 天然氨基酸的免疫原 ) 产生的抗体， 所述抗体交叉反应对抗对象体内 ( 或能够在对象体内 ) 的对应的天然靶标部分 ( 又如疾病相关部分 )。 在任一实施方式中， 本发明使对抗靶标部分 如细菌抗原。 刺激的免疫保护升高， 而无论使天生自体蛋白质， 如， TNFα， 或外源性分子，
     在一个实施例中， 本文所述发明还提供了可用于治疗和 / 或预防 TNFα 活性相关 病理的组合物和方法。肿瘤坏死因子 α(TNFα) 是一种多效性细胞因子， 参与加剧和 / 或 导致许多慢性炎症性疾病， 如感染性休克， 类风湿关节炎， 脑疟疾和克罗恩病。本发明提供 了产生非天然 TNFα 如含有一个或多个免疫原性的、 抗体可接近的非天然氨基酸的 TNFα。 本发明还提供了使用非天然 TNFα 打破对 TNFα 免疫耐受的方法， 如， 诱导产生或增强对于 身体内源性 TNFα 的免疫应答。 例如用非天然 TNFα 引起的抗体与 TNFα 的表为交叉反应， 中和内源性的 TNFα， 可减轻或缓解此类疾病的症状， 如内毒素休克、 脑疟疾、 自身免疫病、 多器官功能衰竭、 多发性硬化症、 心脏功能障碍、 动脉粥样硬化、 缺血再灌注损伤、 胰岛素抵
     抗、 类风湿关节炎、 克罗恩病、 炎性肠病、 恶病质、 感染性休克、 艾滋病、 移植物抗宿主病、 杀 菌肉芽肿、 成人呼吸窘迫综合症、 二氧化硅致肺纤维化。
     在一些包含 TNFα 实施方式中， 用含有高度免疫原性硝基苯基基团的非天然氨基 酸对 - 硝基苯丙氨酸取代 mTNFα 蛋白质 86 位的酪氨酸， 产生具有有用的治疗性和 / 或预 防性特征的非天然 TNFα 衍生物。在对象 ( 如小鼠 ) 体内具有治疗性和 / 或预防性处理用 途的其它非天然 TNFα 衍生物包括 pNO2Phe11-mTNFα， pNO2Phe19-mTNFα， pNO2Phe21-mTNFα， pNO2Phe42-mTNFα， pNO2Phe49-mTNFα， pNO2Phe104-mTNFα， 或 pNO2Phe113-mTNFα。 在 对 象 ( 如 人 ) 体 内 具 有 治 疗 性 和 / 或 预 防 性 处 理 用 途 的 其 它 非 天 然 TNFα 衍 生 物 包 括 pNO 2Phe 11-hTNF α， pNO 2Phe 19-hTNF α，pNO 2Phe 21-hTNF α， pNO 2Phe 42-hTNF α， pNO2Phe49-hTNFα， pNO2Phe87-hTNFα， pNO2Phe105-hTNFα 或 pNO2Phe114-hTNFα。
     在另一实施例中， 本文所述发明还提供了可用于治疗和 / 或预防视黄醇结合蛋 白 (RBP4) 活性相关病理的组合物和方法。RBP4 参与如马修伍德综合症 (Matthew Wood Syndrome)， 年龄相关黄斑变性 (AMD) 和斯塔加特病 (Stargardt’ s disease) 等的出现 / 发 展。
     用非天然免疫原打破免疫耐受
     现代医学治疗中的一大挑战是开发出有效方法， 增强特异性弱免疫原性外源性抗 原的免疫原性如得到中和抗体， 或者选择性克服对于自身抗原的耐受。对于免疫学区分 自身和非自身的过程非常重要的概念是自体耐受， 其中哺乳动物的免疫系统对于自体蛋 白质 “耐受” 以避免自身免疫病， 主要是因为缺少自体反应 B- 或 T- 细胞或发生失活。采 取多种策略以应对这些挑战， 包括开发改良佐剂和载体， 在抗原中引入强 T 细胞表位， 脂 偶联和组合疫苗等。参见例如 Baldridge 等， 《疫苗佐剂 ： 免疫学和临床原则》 (Vaccine Adjuvants ： Immunological and Clinical Principles.)C.J.Hackett， Harn， D.A.Jr. 编 .( 修马纳出版公司， 新泽西州托托瓦 )， 235-255 ； Makela 等， Expert Rev Vaccines， 1(399) ： 399-410(2002) ； Dalum 等， Nat Biotechnol.17 ： 666(1999) ； 以 及 Restifo， Curr Opin Immunol 8 ： 658(1996).。已表明用重氮衍生物广泛非特异性标记的兔甲状腺球蛋白 对兔进行免疫， 可诱导对于天然甲状腺球蛋白的交叉反应抗体。参见 Weigle， J Exp Med 121 ： 289(1965)。然而， 很难对该方法进行方便修改 / 控制以解决其它抗原的问题等。同 样， 含有二硝基苯基团的自体癌症细胞的非特异性衍生化在黑色素瘤病人中用作疫苗 (Berd， D.(2004)《M-Vax ： 一种自体半抗原修饰的人类癌症疫苗》 (M-Vax ： an autologous， hapten-modified vaccine for human cancer)Expert Rev Vaccines 3 ： 521-527)。还可 参考其它文献 ( 如下文中的实施例 )。
     与之前的尝试相比， 本发明在靶标部分 ( 如疾病相关的靶标部分 ) 的靶标表位用 一个活多个非天然氨基酸 (UAA) 取代一个活多个天然氨基酸 ( 在特定所需位点 ) 从而创造 非天然免疫原。其它或此外， 可在靶标部分的靶标表位中加入一个或多个特异性非天然氨 基酸残基从而创造非天然免疫原。取代和 / 或创造非天然氨基酸可在非天然免疫原中创造 一个或多个免疫原性， 任意结构保守的表位， 从而能够 ( 在对象中 ) 引起针对野生型 (wt) 天然靶标蛋白质对应区域的强烈的免疫应答， 如 T- 细胞应答和 / 或 B- 细胞应答。并且， 如 下文所述， 对于非天然免疫原所产生的交叉反应抗体还可对不包含非天然氨基酸的对应天 然靶标分子的区域具有特异性。参见下文。在使用单克隆抗体或嵌合药物打破耐受方面，本发明可任意领先于之前的尝试， 之前的问题在于需要频繁的注射和大量蛋白质。 。 如本文 所示， 在一些实施方式中， 使用本发明非天然免疫原在对象中产生的抗体的血清持久性在 治疗过程中使免疫增强的频率降低。
     B 细胞通过 BCR(B 细胞受体 ) 或膜结合免疫球蛋白识别血液或淋巴中游离 ( 可溶 性 ) 抗原 ( 如非天然免疫原 )。在抗原识别之后， B 细胞将其内吞， 并以 MHC 复合物的形式 在其表面展示抗原片段。 B 细胞一旦被活化， 发育为记忆 B 细胞， 产生并分泌抗体， 帮助中和 抗原 ( 非天然免疫原 ) 起源 ( 或对应 ) 的疾病相关靶标部分， 和 / 或帮助破坏具有抗体可 接近表位的感染性靶标剂。
     抗原 ( 如非天然免疫原 ) 特异性 T 细胞， 如 CD4+T 细胞与如 B 细胞展示的 MHC- 复 合物肽片段相结合。然后 T 细胞增殖避过那释放刺激免疫细胞增殖和纷华的细胞因子， 这 些激活的 T 细胞中的一些发育成为记忆细胞， 提供了对如抗非天然免疫原起源的靶标 ( 如 疾病相关的 ) 的即时保护， 以及引起更迅速和有效的二次免疫应答的能力。在 T 淋巴细胞 增殖实验中可测定该活性 ( 参见实施例 1 和 2)。
     细菌、 酵母或哺乳动物细胞对应特定的无义以及移框密码子已经遗传学编码超过 50 种非天然氨基酸。参见例如， Wang 等， Science 292 ： 498(2001) ； Chin 等， Science 301 ： 964(2003) ； Liu 等， Nat Methods 4 ： 239(2007) ； Anderson 等， Proc Natl Acad Sci U S A 101 ： 7566(2004) ； 和 Wang 等， Angew Chem Int Ed Engl 44 ： 34(2004)， 以及本文其它参考文 献。 这些包括金属结合和翻译后修饰氨基酸， 荧光和氧化还原活性氨基酸， 以及光反应和化 学反应氨基酸。例如， 将苯丙氨酸的衍生物对 - 硝基苯丙氨酸 (pNO2Phe， 图 1A) 掺入细菌蛋 白质中对应琥珀无义密码子， 用作光谱距离探针时具有高保真度和良好的效率。参见 Tsao 等， J Am Chem Soc 128 ： 4572(2006)。 应当理解的是在本文的举例和描述中讨论了 pNO2Phe 的使用， 单不局限与此， 本发明涵盖任何非天然氨基酸 ( 如， 包括但不限于本文所列举的和 / 或本文参考文献中所描述的 ) 的用途。下文中给出了可用于本文各种实施方式的非天然 氨基酸的其它信息。
     用非天然免疫原打破免疫耐受的实施例。
     历史上曾使用硝基芳基作为高免疫原性半抗原 ( 参见 Keinan 编， 《催化抗体》 Catalytic Antibodies(WV 公司 (Wiley-VCH)， 魏恩海姆 (Weinheim)， 2005)， 1-28)， 可能是 由于缺电子的 π 系统趋于与对抗体结合位点常见的 Tyr 和 Trp 侧链相互作用。因为它们 的结构相似性， 感兴趣的靶标部分的 Phe → pNO2Phe 或 Tyr → pNO2Phe 突变 ( 如疾病相关部 分 ) 可产生强烈免疫应答的免疫原， 所述免疫应答与免疫原来源 ( 对应 ) 的天然靶标部分 交叉反应。
     因此， 如实施例所示， 用如鼠肿瘤坏死因子 -α(mTNFα)Tyr86 → pNO2Phe 突变子免 疫小鼠， 产生对野生型 mTNFα(wt mTNFα) 响应的高滴度抗体， 因此可有效保护小鼠对抗脂 多糖 (LPS) 刺激。
     选择 mTNFα 作为靶标蛋白质展示本发明的 ( 多个 ) 方面， 因为它是涉及感染、 炎症和自身免疫现象的鉴定清楚的细胞因子 ( 参见 Vassalli， Annu Rev Immunol 10 ： 411(1992)) ； 并且对于 mTNFα 的生物学特征， 包括其表达、 结构、 功能和信号转导机制已 经进行了深入研究。参见例如， 前述 Vassalli ； Baeyens 等， Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55 ： 772(1999) ； Pennica 等， Proc Natl Acad Sci U S A 82 ： 6060(1985) ；Pasparakis 等， J Exp Med 184 ： 1397(1996) ； Baeyens， H.L. 等， Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53 ： 329(1997) ； 以及 Aggarwal， Vilcek， J.， 编 《肿瘤坏死因子 ： 结构、 功能和 作用机制》 (Tumor necrosis factors ： structure， function， and mechanism of action) ( 纽约德克尔， 1992)(Dekker， New York， 1992)， 1-587。此外， mTNFα 敲除小鼠可以存活， 并不表现出明显的表型异常 ( 参见 Pasparakis， 同上 )， 这表明小鼠在产生对抗 TNF 的中和 免疫应答中可以存活， 这使接种动物可用于分析抗 -TNFα 抗体的产生和生物学活性。而 且， 抗 -TNFα 抗体 (Knight 等， Mol Immunol 30 ： 1443(1993) ； 和 Present 等， N Engl J Med 340 ： 1398(1999)) 和可溶性嵌合 TNFα 受体 (Peppel 等， J Exp Med 174 ： 1483(1991) ； 和 Williams 等， Immunology 84 ： 433(1995)) 已广泛用于治疗类风湿性关节炎。因此， 临 床需要 TNFα- 特异性疫苗 (Dalum， 同上 ； Spohn 等， J Immunol 178 ： 7450(2007) ； Buanec 等， Proc Natl Acad Sci U S A 103 ： 19442(2006) ； Capini 等， Vaccine 22 ： 3144(2004))。 基 于 mTNFα 三 聚 体 的 X- 射 线 晶 体 结 构 基 础 (Baeyens 等， Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55 ： 772(1999) ； 和 Baeyens 等， Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53 ： 86 329(1997))， 选择 Tyr → pNO2Phe 单一突变的 mTNFα(pNO2Phe86mTNFα， 参见图 1B) 作为本 86 发明展示说明的免疫原。Tyr 在不同哺乳动物的 TNF 中高度保守， 已经确定该位点的突变 86 不影响蛋白质的折叠或三聚体形成。Tyr 突变还导致细胞毒性的显著丢失， 这在以产生疫 苗为目的时具有优势。参见例如， Van Ostade 等， Protein Eng 7 ： 5(1994) ； Loetscher 等， J Biol Chem 268 ： 26350(1993) ； 和 Zhang 等， J Biol Chem 267 ： 24069(1992)。
     通过鉴定对抗 TNFα 的多克隆 IgG 抗体的特征和持久性， 以及通过展示产生对抗 野生型视黄醇结合蛋白 4， mRBP4 的抗体 ( 因此显示了本发明中免疫功能无关的自身蛋白的 用途 )， 实施例 2 进一步展示了本发明的广泛应用。 有趣的是， 实施例 2 显示了 pNO2Phe- 诱导 打破了自身耐受， 产生了针对 WT mTNFα 的多个表位的抗体， 所述表位不必包含天然 TNFα 中与非天然免疫原 TNFαpNO2Phe 残基对应的区域。因此， 利用本发明的非天然免疫原进行 免疫可以有利的引起免疫球蛋白表位扩展， 据此不同于诱导表位的表位变成正在进行的免 疫应答的主要靶标。参见下文。免疫扩大至整个非天然免疫原来源的疾病相关靶标部分的 表位是一种在疫苗设计后尤其需要的一种现象。 对于免疫系统能力的增强使其能够攻击疾 病相关靶标部分的多个靶标能够增加针对靶标部分免疫应答的有效性 / 或强度。
     应当理解的是下文中实施例展示的不仅仅是本发明实施方式中的 TNFα 或 RPB4。 从本文描述可知， 各种实施方式中在非天然 TNFα 和 RPB4 靶标部分中可包含一个或多个任 意非天然氨基酸。而且， 此类非天然免疫原上出现的非天然氨基酸可位于免疫原内部的任 何位置。取代天然 TNFα 和 RBP4 中对应的天然氨基酸的非天然氨基酸可以是保守氨基酸 取代， 也可以是非保守氨基酸取代。也可一通过多种方法中的任何方法构建非天然免疫原 性 TNFα 和 RBP4。对然很多实施方式使用正交翻译 ( 参见下文 ) 作为直接掺入非天然氨基 酸的途径， 但也可任意使用其它直接掺入方法 ( 如体外翻译系统， 固相和称等 )。本文的实 施方式一般不使用翻译后或化学修饰方法， 除了与直接掺入方法如正交翻译联用。
     加强 / 增强免疫原性应答的方法和组合物
     从本文实施例和说明可知， 本发明的非天然免疫原可产生对抗天然靶标部分 ( 如 不包含非天然氨基酸的疾病相关蛋白质 ) 强烈的交叉反应抗体应答， 从而保护性对抗靶标 部分相关的疾病 ( 或可用于处理疾病状态 )。 因此， 本发明通过将非天然氨基酸掺入感兴趣靶标部分的特异性表位， 如疾病相关靶标部分的表面暴露表位或 T- 细胞表位， 可打破免疫 学自身耐受。例如， 在如下简化图中， 靶标部分 ( 如疾病相关靶标部分 ) 包含表位 1、 2、 和 3。非天然免疫原也包含表位 1、 2 和 3， 所述表位来源于或对应 ( 具有相同序列 ) 靶标部分 的表位 1、 2 和 3。 然而， 非天然免疫原的表位 2 包含替换靶标部分的对应天然氨基酸的非天 然氨基酸 ( 星号表示 )。在非天然免疫原中存在非天然氨基酸产生能识别靶标部分不同表 位的交叉反应抗体 ( 表位扩张 )。例如， 可产生针对表位 1 和 3( 不对应包含非天然氨基酸 的非天然免疫原的表位 )， 和表位 2( 对应包含非天然氨基酸的非天然免疫原的表位 ) 的交 叉反应抗体。
     靶标部分
     表位 1 表位 2 表位 3
     非天然免疫原表位 1 表位 2 * 表位 3通过位点特异性将非天然氨基酸掺入导感兴趣的靶标部分的特定表位创造非天 然免疫原， 从而打破免疫学自身耐受， 可应用于大量内源性靶标部分 ( 如蛋白质 )， 包括蛋 白折叠疾病或癌症相关的那些 ( 如淀粉样蛋白 -β(1-42) 肽或前列腺特异性抗原 )。 此外， 该方法可产生对抗弱免疫原表位的强抗体应答， 从而得到针对异源靶标部分的中和抗体， 如来自病毒、 细菌、 真菌、 朊蛋白或寄生虫感染的异源靶标。
     应当理解的是， 本文各种实施方式使用非天然免疫原 ( 即， 对应靶标部分但含有 一个或多个非天然氨基酸的分子 ) 给药， 当接种入对象时， 将产生对抗非天然免疫原的抗 体、 B 细胞和 / 或 T- 细胞， 它们交叉反应对抗靶标部分， 如不包含非天然氨基酸的疾病相关 部分， 并且所述靶标部分在对象体内或能够在对象体内。 在另外的实施方式中， 可使用非天 然免疫原产生与天然靶标部分交叉反应的抗体， 所述抗体然后预防性 / 治疗性给予对象。
     因此， 在本文的一些实施方式中， 本发明包含的方法通过将包含一个或多个非天 然氨基酸的非天然免疫原给予对象， 在对象中 ( 如疾病相关部分， 对象的自体分子， 来自对 象体内病原的分子， 或来自能够在对象体内的病原的分子等 ) 产生针对靶标部分的免疫应 答。对象产生与针对不含非天然氨基酸的靶标部分对应的抗原的抗体， 所述抗体交叉反应 对抗特定靶标部分。 还应当理解的时， 所产生的抗体不必对于靶标部分的表位具有特异性， 所述表位对应非天然免疫原上的具有非天然氨基酸的表位。 本发明的方法可用于打破对象 体内对于靶标 ( 如疾病相关 ) 部分的免疫耐受。此外， 当本文进行关于通过正交翻译系统 或其它直接掺入的方法 ( 参见下文 ) 描述时， 一旦创造免疫原性非天然抗原也可通过其它 方法进行修饰 ( 如化学修饰等 )。通常这类间接方法与直接掺入方法如正交方法联用或作 为补充。
     如下文详述中所解释， 用于在对象中产生免疫学应答的免疫原通常包含对象体内 靶标部分或能够在对象体内的靶标部分的 “非天然” 版本 ( 如来自可感染对象的细菌的靶 标部分， 来自对象体内发生肿瘤的靶标部分等 )。换言之， 非天然免疫原任意包含与靶标部 分相同的氨基酸序列 / 结构， 除了靶标部分的一个或多个氨基酸残疾被替换为非天然氨基
     酸 ( 参见下文用作另外展示的实施例部分 )。 另外或此外， 非天然免疫原可包含靶标部分的 氨基酸序列以及一个或多个其它非天然氨基酸残基。在具体实施方式中， 与初始靶标部分 相比， 替换和 / 或加入非天然氨基酸不改变 ( 或仅仅轻微改变 ) 非天然免疫原的构象结构。 因此， 非天然免疫原和靶标部分的三级和 / 或四级结构可以相同， 或彼此非常相似。在非天 然免疫原中放置一个或多个非天然氨基酸可任意基于下述进行选择， 如与靶标部分来源的 免疫原相比， 放置位置是否会改变免疫原的构象， 放置位置是否使非天然氨基酸被抗体接 近 ( 如抗体能否与含有非天然氨基酸的区域结合 ) 等。掺入非天然免疫原的非天然氨基酸 可以是保守或非保守取代 ( 与靶标部分中对应的天然氨基酸相比 )。
     本发明的其它实施方式还包含预防性和 / 或治疗性处理对象的方法， 通过给予一 种或多种非天然免疫原和 / 或给予对抗一种或多种与对应天然靶标部分交叉反应的非天 然免疫原的抗体。
     本发明还包括含有通过鉴定至少推测对于治疗敏感 ( 如 TNFα) 的靶标部分 ( 如 疾病相关部分 ) 产生疫苗的方法的实施方式。应当理解的是此类靶标部分通常是 “天然 的” ， 并且不包含任何非天然氨基酸。所述方法还包括提供非天然免疫原， 即靶标部分所对 应的 “非天然” 版本， 其包括一个或多个非天然氨基酸， 如取代和 / 或加入非天然氨基酸。再 次， 所述免疫原可包含与靶标部分相同或相近的结构构象， 因此给予对象非天然免疫原诱 导针对免疫原的交叉对抗靶标部分的抗体。本发明还包括此类方法产生的疫苗。 应当理解的是在本文的各种实施方式中， 当创建免疫学应答和 / 或当给予预防性 治疗等时， 天然靶标部分可出现或不出现于对象体内。 因此， 当描述本文靶标部分在或位于 对象体内时， 应当理解的是还包括其中靶标部分能够位于对象体内。 因此， 靶标部分可来自 于对象体内发生的肿瘤， 或来自可感染对象的感染性剂等。
     因此， 如通篇进行解释， 在各种实施方式中， 靶标部分可以是疾病相关部分， 天生 的部分， 外源部分等。靶标部分本身可以是非免疫原性的或者部分或弱免疫原性的。外源 靶标部分可以来自任何有机体 ( 如细菌、 病毒等 )。 靶标部分本身可以是任何自身抗原 ( 如 肿瘤相关的等 )。掺入非天然免疫原的非天然氨基酸可以是任何非天然氨基酸， 参见下文， 并且可以位于免疫原内的任何位置。与靶标部分的天然氨基酸相比， 免疫原中的非天然氨 基酸起到可以是保守或非保守取代。如下文进一步描述， 非天然免疫原还可通过多种直接 掺入方法创造 ( 如正交翻译， 固相合成等 )。 本文典型的实施方式不通过间接搀入方法创造 非天然免疫原， 如翻译后修饰或化学修饰 ( 但这类方法可任意与直接掺入方法联用， 如正 交翻译或在直接掺入方法如正交翻译后使用 )。
     疾病状态和疾病相关靶标部分
     本发明的方法和组合物可用于预防性和 / 或治疗性处理多种医学状况 / 疾病状 态。例如， 本发明可用于治疗自身免疫失调。此类免疫失调包括但不限于 ： 自身免疫病 ( 如 糖尿病， 关节炎， 类风湿性关节炎， 少年类风湿性关节炎， 骨关节炎， 银屑病关节炎， 多发性 硬化 ( 如涉及 MS 相关抗原如 TRAIL， CD95/CD95 等 )， 脑脊髓炎， 重症肌无力， 系统性红斑 狼疮 (SLE)， 自身免疫甲状腺炎， 皮炎， 过敏性皮炎， 湿疹性皮炎， 牛皮癣， 干燥综合征， 克罗 恩氏病， 口疮性溃疡， 虹膜炎， 结膜炎， 角结膜炎， 溃疡性结肠炎， 哮喘， 过敏性哮喘， 皮肤红 斑狼疮， 硬皮病， 阴道炎， 直肠炎， 药疹， 麻风病逆转反应， 麻风结节性红斑， 自身免疫葡萄膜 炎， 变应性脑脊髓炎， 急性出血坏死性脑病， 特发性双边渐进性耳聋， 再生障碍性贫血， 纯红
     细胞贫血， 特发性血小板减少， 多软骨炎， 韦格氏肉芽肿， 慢性活性肝炎， 斯蒂文斯 - 约翰逊 综合症， 特发性腹泻， 扁平苔藓， 格氏眼病， 结节病， 原发性胆汁性肝硬化， 后葡萄膜炎和肺 间质纤维化， 移植物抗宿主病， 移植和过敏 ( 如特应性过敏 )。 本发明还可治疗非自身免疫 / 非感染性病原来源的疾病状态， 如糖尿病 / 心血管病 ( 如涉及 RBP4)， 或者特发性来源， 如阿 耳茨海默病 ( 如其中疾病相关靶标部分可包括如淀粉样蛋白 β40， 淀粉样蛋白 β42 等 )。
     本发明方法和组合物的各种实施方式还可用于预防性和 / 或治疗性处理 TNFα 活性相关的疾病状态， 如恶病质、 脓毒性休克、 细菌肉芽肿、 成人呼吸窘迫综合征、 二氧化硅 诱导的肺纤维化、 自身免疫病、 多器官衰竭、 多发性硬化、 心脏功能障碍、 动脉粥样硬化、 缺 血 - 再灌注损伤、 胰岛素抵抗和炎性肠病等。本发明的其它实施方式可用于预防性和 / 或 治疗性处理 RBP4 活性相关的疾病状态， 如马修伍德综合症， 年龄相关的黄斑变性 (AMD) 和 斯塔加特病 (Stargardt’ s disease) 等 .
     在其它实施方式中， 发明的其它实施方式可用于预防性和 / 或治疗性处理各种癌 症 ( 如乳腺癌、 前列腺癌、 卵巢癌、 肺癌、 皮肤癌等 )。 此类治疗包括但不限于 ： 治疗具有肿瘤 相关抗原的癌症。 已知多种癌症的肿瘤相关抗原， 如乳腺癌， 前列腺癌， 卵巢癌等。 肿瘤相关 抗原包括但不限于 ： 来自结肠癌和其它癌症的癌胚 (CEA)， MAGE， BAGE， RAGE， 和 NY-ESO( 在 睾丸的免疫豁免区以及多种肿瘤细胞中表达的非突变抗原 ) ； 谱系特异性肿瘤抗原， 如黑 色素细胞 - 黑色素瘤谱系抗原 MART-1/Melan-A， gp100， gp75， mda-7， 酪氨酸酶和酪氨酸酶 相关蛋白质， 或前列腺特异性膜抗原 (PSMA) 和前列腺特异性抗原 (PSA)， 它们表达于来源 于相同组织的正常和恶性细胞 ； 表位蛋白质 / 肽， 来自于肿瘤细胞的突变基因或与正常细 胞相比转录水平不同的基因， 如突变 ras， bcr/ab1 重排， Her2/neu， 突变或野生型 p53， 细胞 色素 P450 1B1， 和异常表达的内含子序列如 N- 乙酰葡糖胺基转移酶 -V ； 免疫球蛋白基因的 克隆性重排产生骨髓瘤和 B- 细胞淋巴瘤中独特的独特型 ； 来源于癌病毒过程的表位蛋白 质 / 肽， 如人乳头瘤病毒蛋白质 E6 和 E7 ； 和肿瘤选择性表达的非突变癌胚蛋白质， 如癌胚 抗原和甲胎蛋白。
     在具体实施方式中， 本发明可用于治疗卵巢癌， 和 / 或靶标疾病相关部分可包括 如， 卵巢肿瘤相关抗原， CA19-9， p53， OCAA， HOXB7， Cal25 等。在另外的实施方式中， 本发明 可用于治疗前列腺癌， 和 / 或靶标疾病相关部分可包括如前列腺肿瘤相关抗原， PSA， PSMA， STEAP， PCTA-1 等。本文其它实施方式包括治疗乳腺癌， 和 / 或靶标相关部分可包括如， CA15-3， CA27-29， Her2/neu 等。本发明可利用的肿瘤相关抗原的其它信息参见如， 《T 淋巴 细胞识别的肿瘤抗原》 (Tumor-Antigens Recognized By T-lymphocytes)Boon 等， Annual Review Of Immunology 12 ： 337-365， 1994 ； 和 《T 细胞识别的人肿瘤抗原列表》 (A listing of human tumor Antigens recognized by T cell)Renkvist 等， Cancer Immunology Immunotherapy 50 ： (1)3-152001 年 3 月。
     在其它实施方式中， 本发明可用于治疗疾病、 失调等， 所涉及的抗原包括但不限于 如 EGF， EGFR， HER-1， CXCR4， 任何 G 蛋白偶联受体 (GCPR)。本领域熟练技术人员熟悉多种 本发明可应用的肿瘤相关抗原以及对应的癌症， 自身抗原和免疫失调。
     在一些实施方式中， 本发明包括治疗 HIV 感染， 其中非天然抗原可对应 HIV/AIDS 相关靶标疾病的相关部分， 如 gp120， gp41， gp160 等。其它示例性 HIV 靶标部分包括但不限 于： gag， pol， env， tat， nef 和 rev。在其它实施方式中， 本发明可用于治疗病毒感染， 并且非天然免疫原客队应病毒 相关的靶标相关部分， 如腺病毒， α 病毒， 杯状病毒 ( 如杯状病毒衣壳抗原 )， 冠状病毒， CMV( 如 pp65)， 瘟热病毒， 艾博拉病毒， 肠道病毒， EBV( 如， gp340 或核抗原 3A)， 黄病毒如 丙肝病毒 Hep C( 如核心抗原 )， 嗜肝 DNA 病毒， 如乙肝病毒 ( 如乙型肝炎核心或表面抗原 HbsAg， 或包膜 Ag pre S2， 或 pre S1ag)， δ 肝炎病毒， 戊型或己型肝炎病毒， 甲型肝炎病毒 ( 如 VP1)， GBV-C， 疱疹病毒 ( 如单纯疱疹病毒蛋白质， 如 I 型糖蛋白 G 或 gpD 或 CP27， 或水痘 带状疱疹病毒糖蛋白， 如 IE62 或 gp1 或包膜蛋白质 )， 免疫缺陷病毒如 HIV( 如包膜或蛋白 酶 )， 传染性腹膜炎病毒， 流感病毒 ( 如， 流感 A 血凝素， 神经氨酸酶或核蛋白 )， LCMV( 如核 蛋白质 )， 白血病病毒， 马耳堡病毒， 正粘病毒病毒， 乳头瘤病毒如 HPV( 如 HPV 衣壳蛋白 )， 副流感病毒 ( 如 the 血凝素 / 神经氨酸酶 )， 副粘病毒如 RSV( 如 F 或 G 蛋白质 s)， 细小病 毒， 瘟病毒， 小核糖核酸病毒 ( 如脊髓灰质炎病毒衣壳多肽， 如 VP1， VP2 或 VP3， 或甲型肝炎 抗原 )， 痘病毒 ( 如牛痘病毒多肽， 如包膜蛋白 )， 狂犬病病毒 ( 如狂犬病病毒糖蛋白 G)， reo 病毒， 逆转录病毒， 鼻病毒 ( 如人鼻病毒衣壳 )， 风疹病毒 ( 如衣壳蛋白 ) 或轮状病毒。
     在另外的实施方式中， 本发明可用于治疗细菌或分枝杆菌感染， 并且可利用细菌 或分枝杆菌相关疾病相关靶标部分创造非天然免疫原， 如放线菌， 芽孢杆菌， 类杆菌， 波氏 杆菌 ( 如百日咳杆菌表面蛋白 )， 巴尔通体， 包柔氏螺旋体菌 ( 如莱姆病螺旋体乌斯帕 )， 布 鲁氏菌 ( 如布鲁氏菌表面蛋白 )， 弯曲杆菌， 二氧化碳噬纤维菌， 衣原体 ( 如沙眼衣原体表 面蛋白 )， 梭菌， 棒状杆菌， 考克斯氏体， 潜蚤， 肠球菌， 埃立克体， 大肠杆菌， 弗朗西斯氏菌， 梭杆菌， 血巴尔通氏体， 嗜血杆菌 ( 如 B 型流感外膜蛋白 )， 缠绕杆菌， 克雷白氏杆菌， L 型细 菌， 钩端螺旋体， 李斯特菌 ( 如表面蛋白 )， 分枝杆菌， 支原体， 奈瑟氏菌， 新立克次氏体， 诺 卡氏菌， 巴氏杆菌， 消化球菌， 消化链球菌， 肺炎球菌， 变形杆菌， 假单胞菌， 立克次氏体， 罗 克利马体， 沙门氏菌， 痢疾杆菌， 金黄色葡萄球菌 ( 如金黄色葡萄球菌的 GP-1)， 链球菌 ( 如 如化脓性链球菌的 M 蛋白或肺炎链球菌荚膜多糖或链球菌表面蛋白抗原 )， 螺旋体， 弧菌 ( 霍乱弧菌及推测菌毛亚单位 ) 以及耶尔森氏菌 ( 如鼠疫 F1 和 V 抗原 )。
     本文其它实施方式可包含治疗真菌感染的方法和组合物等， 并且创造的非天然免 疫原可对应真菌相关靶标疾病相关部分， 如犁头霉， 支顶孢， 链格孢， 曲霉， 一蛙粪霉菌， 双 极霉， 子囊酵母， 念珠菌， 假丝酵母， 一耳霉， 隐球菌， 叶枯病菌， 表皮癣菌， 外瓶霉， 地丝菌， 组织胞浆菌， 马杜拉分支菌， 马拉色菌， 小孢子菌， 小丛梗孢， 被孢霉， 毛霉， 拟青霉， 青霉， 单 胞瓶霉， 瓶霉， 绿藻， 足肿菌， 假小托菌， 腐霉， 鼻孢子虫， 根霉， 线状担子菌， 孢子丝菌， 匍柄 霉， 毛癣菌， 毛孢子菌， 木丝霉。
     本文其它实施方式可包含治疗原生动物感染的方法和组合物等， 并且创造的非天 然免疫原可对应原生动物寄生虫相关靶标疾病相关部分， 如巴贝斯虫， 肠袋虫， 贝诺孢子 虫， 隐孢子虫， 艾美虫， 脑胞内原虫， 内阿米巴虫， 梨形鞭毛虫， 哈蒙德虫， 肝簇虫等孢子球 虫， 利什曼原虫 ( 如硕大利什曼原虫表面糖蛋白如 gp63)， 小孢子虫， 孢子虫， 微孢子虫， 五 鞭毛虫， 疟原虫 ( 如恶性疟原虫环孢子体 (PfCSP)， 孢子体表面蛋白 2(PfSSP2)， 肝脏状态抗 原 1 羧基端 (PfLSA1 c- 末端 )， 输出蛋白质 1(PfExp-1)， Pfs 48/45， Pfs 28， Pfs 25， Pfs 230)， 肺囊虫， 肉胞子虫， 血吸虫， 泰来虫， 弓形体和锥虫。
     本文其它实施方式可包含治疗寄生虫感染的方法和组合物等， 并且创造的非天然 免疫原可对应寄生虫相关靶标疾病相关部分， 如棘唇虫， 猫圆线虫， 钩虫， 管圆线虫， 蛔虫，布鲁格氏丝虫， 仰口线虫， 毛细线虫， 夏氏线虫， 古柏线虫， 环体线虫， 网尾线虫， 膨结虫， 棘 唇线虫， 绦虫， 复孔绦虫， 恶丝虫， 龙线虫， 蛲虫， 类丝虫， 血矛线虫， 兔唇蛔虫， 洛阿多肽， 曼 森线虫， 缪勒线虫， 侏形吸虫， 钩虫， 细颈线虫， 结节线虫， 盘尾虫， 后睾吸虫， 胃线虫， 副丝 虫， 肺吸虫， 副蛔虫， 泡翼线虫， 原圆虫， 腹腔丝虫， 旋尾线虫， 宫绦虫， 冠丝虫， 类圆线虫， 圆 线虫， 吸吮线虫， 弓蛔线虫， 弓首蛔虫， 旋毛虫， 虹膜钩虫， 鞭虫属， 钩虫， 或吴策线虫。
     本文其它实施方式可包含治疗外寄生虫感染的方法和组合物等， 并且创造的非天 然免疫原可对应外寄生虫相关靶标疾病相关部分。此类外寄生虫包括如， 跳蚤， 扁虱， 包括 硬蜱和软蜱， 蝇如蚊， 蚊子， 沙子， 苍蝇， 黑蝇， 马蝇， 喇叭蝇， 鹿蝇， 采采蝇的， 稳蝇， 蝇蛆病， 蝇蛆造成苍蝇， 蚂蚁 ； 蜘蛛， 虱子， 螨虫， 和半翅目昆虫， 如臭虫， 吸血的有毒昆虫。在另外的 实施方式中， 免疫原可对应花粉过敏原或过敏原的靶标部分。
     非天然氨基酸
     本文使用的非天然氨基酸指任何氨基酸、 修饰氨基酸， 或不是硒半胱氨酸和 / 或 吡咯赖氨酸的氨基酸类似物， 下面是 20 种经典的遗传编码的 α- 氨基酸 ： 丙氨酸、 精氨酸、 天冬酰胺、 天冬氨酸、 半胱氨酸、 谷胺酰胺、 谷氨酸、 甘氨酸、 组氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 赖氨 酸、 甲硫氨酸、 苯丙氨酸、 脯氨酸、 丝氨酸、 苏氨酸、 色氨酸、 酪氨酸、 缬氨酸。 在本发明的各种 实施方式中， 搀入非天然免疫原的一种或多种非天然氨基酸可以是任何非天然氨基酸。因 此， 应当理解是本文对于具体非天然氨基酸的引用不应视为对本发明的限制。通过体内编 码将广泛的非天然氨基酸掺入蛋白质中， 如使用包含正交元件的翻译系统。参见例如， Liu 等 (2007)《在哺乳动物细胞中将非天然氨基酸掺入蛋白质》 “Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells” Nat Methods 4 ： 239-244 ； Wang 等 (2006)《扩展遗传学编码》 “Expanding the genetic code” Annu Rev Biophys Biomol Struct 35 ： 225-249 ； Xie & Schultz(2006)《蛋白质化学工具箱 - 扩展遗传学 编码》 “A chemical toolkit for proteins--an expanded genetic code” Nat Rev Mol Cell Biol 7 ： 775-782 ； Wang 和 Schultz《扩 展 遗 传 学 编 码》 “Expanding the Genetic Code， ” Angewandte Chemie Int. 编 .， 44(1) ： 34-66(2005) 以及 Chin 等 (2003)《扩展真 核遗传编码》 “An expanded eukaryotic genetic code” Science 301 ： 964-967。
     此外， 在本发明的各种实施方式中， 可在体外将非天然氨基酸掺入到免疫原中， 如使用生物合成方法， 其中用所需非天然氨基酸将抑制子 tRNA 化学酰化， 然后加入到 能够支持免疫原生物合成的体外提取物中。关于此类体外合成方法的描述， 参见例如， V.W.Cornish， D.Mendel 和 P.G.Schultz， Angew.Chem.Int.Ed.Engl.， 1995， 34 ： 621(1995) ； C.J.Noren， S.J.Anthony-Cahill， M.C.Griffith， P.G.Schultz， 《将 非 天 然 氨 基 酸 定 点 掺入蛋白质的常用方法》 “A general method for site-specific incorporation of unnatural amimo acids into proteins， ” Science 244182-188(1989) ； 以及 J.D.Bain， C.G.Glabe， T.A.Dix， A.R.Chamberlin， E.S.Diala， 《将非天然氨基酸生物合成定点掺入多 肽中》 “Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide， ” J.Am.Chem.Soc.111 8013-8014(1989)。 通过可用的合成肽化学或通过翻 译后加工还可将非天然氨基酸加入天然或合成蛋白质中 ( 或者可利用此类技术将天然氨 基酸转化为非天然氨基酸 )。然而应当理解的此类翻译后核化学修饰通常与在合成分子过 程中掺入一个活多个非天然氨基酸 ( 如直接掺入， 如正交翻译， 固相合成等 ) 联用或作为补充。因此， 氨基酸的翻译后加入或化学修饰 ( 如果发生的话 ) 通常只在具有合成分子过程 中已经加入非天然氨基酸的分子上进行。 下文说明了将非天然氨基酸非正交掺入免疫原的 进一步信息。
     式 I 说明 α- 氨基酸的一般结构 ：
     非天然氨基酸一般是任何具有式 I 的结构， 其中 R 基团是除了 20 种天然氨基酸中 使用的一种以外的任何取代基。参见例如， L.Stryer 的 《生物化学》 ， 第三版， 1988， 自由人 公司 (Freeman and Company)， 纽约中二十种天然氨基酸的结构。需要注意的是， 本发明的 非天然氨基酸， 例如用于增强免疫应答的非天然氨基酸可以是除上述二十种 α- 氨基酸外 的天然产生的化合物。
     因为本文所用的非天然氨基酸一般与侧链中的天然氨基酸不同， 非天然氨基酸与 其它氨基酸， 例如， 天然或非天然氨基酸以天然产生的蛋白质中形成的相同方式形成酰胺 键。然而， 非天然氨基酸具有使其与天然氨基酸不同的侧链基团。
     在非天然氨基酸中， 例如， 式 I 中的 R 任选地包括烷基 -、 芳基 -、 酰基 -、 肼、 氰基 -、 卤素 -、 酰肼、 链烯基、 醚、 硼酸、 硼酸盐、 磷酰基、 膦酰基、 膦、 烯酮、 亚胺、 酯、 羟胺、 胺等， 或它 们的任意组合。其它感兴趣的的非天然氨基酸包括但不限于， 含有可光敏化的交联剂的氨 基酸、 自旋标记的氨基酸、 荧光氨基酸、 金属结合氨基酸、 含金属的氨基酸、 放射性氨基酸、 具有新官能团的氨基酸、 与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、 光笼蔽和 / 或可光 异构的氨基酸、 含有生物素或生物素 - 类似物氨基酸、 含酮氨基酸、 糖基化氨基酸、 与氨基 酸侧链连接的糖部分、 含有聚乙二醇或聚醚的氨基酸、 重原子取代的氨基酸、 可化学切割或 可光切割的氨基酸、 与天然氨基酸相比具有延长侧链的氨基酸 ( 例如， 聚醚或长链烃， 如大 于约 5、 大于约 10 个碳等 )、 含有碳 - 连接糖的氨基酸、 含有氨基硫代酸的氨基酸和含有一 种或多种有毒部分的氨基酸。感兴趣的其它非天然氨基酸包括但不限于 ： 含光可活化交 联剂的氨基酸、 自旋 - 标记的氨基酸、 荧光氨基酸、 金属结合氨基酸、 含金属的氨基酸、 放射 性氨基酸、 含有新官能团的氨基酸、 能与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、 光锁定 (photocaged) 和 / 或光致异构 (photoisomerizable) 的氨基酸、 含生物素或生物素类似物 的氨基酸、 含酮基的氨基酸、 糖基化的氨基酸、 与氨基酸侧链相连的糖部分、 含聚乙二醇或 聚醚的氨基酸、 重原子取代的氨基酸、 化学方法可切割或光可切割的氨基酸、 与天然氨基酸 相比侧链延长的氨基酸 ( 如聚醚或长链烃， 如超过约 5 个、 约 10 个碳原子等 )、 含碳连接糖 的氨基酸、 含氨基硫代酸的氨基酸以及含一个或多个毒性部分的氨基酸。
     在另一方面， 本发明可利用具有式 IV 所示通用结构的非天然氨基酸 ：
     具有此结构的非天然氨基酸一般可以是任何结构， 其中 R1 是 20 种天然氨基酸之 一 ( 例如， 酪氨酸或苯丙氨酸 ) 所用的取代基， R2 是取代基， 以使 R2-R1 一起构成不同于 20 种经典天然氨基酸中任何氨基酸的侧链。因此， 此类非天然氨基酸可视作天然氨基酸衍生 物。
     非天然氨基酸也可任选地包含修饰的主链结构， 如式 II 和 III 所示结构 ：
     其中 Z 一般包括 OH、 NH2、 SH、 NH-R′或 S-R′ ； X 和 Y 可以相同或不同， 它们一般包 括 S 或 O， R 和 R′是任选地相同或不同， 它们一般是除氢以外的任何取代基 ( 其中如果 R′ 是 H 则 R 是 L 构型 )。例如， 本文所用非天然氨基酸任选地包括在氨基或羧基中的取代， 如 式 II 和 III 所示。该类非天然氨基酸包括但不限于例如， 具有与普通的二十种然氨基酸相 应的侧链或非天然侧链的 α- 羟酸、 α- 硫代酸 α- 氨基硫代羧酸酯。此外， 在 α- 碳上的 取代任选地包括 L、 D 或 α-α- 双取代氨基酸， 如 D- 谷氨酸、 D- 丙氨酸、 D- 甲基 -O- 酪氨 酸、 氨基丁酸等。其它结构替代物包括环氨基酸， 如脯氨酸类似物， 以及 3、 4、 6、 7、 8和9元 环脯氨酸类似物， β 和 γ 氨基酸， 如取代的 β- 丙氨酸和 γ- 氨基丁酸。
     在一些方面， 本发明利用 L 构型的非天然氨基酸。然而， 不应认为本发明仅限于使 用 L- 构型的非天然氨基酸。也考虑到将这些非天然氨基酸的 D- 对映异构体用于本发明。
     本发明各种实施方式也包括， 酪氨酸类似物， 其包括对位取代的酪氨酸、 邻位取代 的酪氨酸和间位取代的酪氨酸， 其中取代的酪氨酸包括， 例如， 炔基， 乙酰基， 苯甲酰基、 氨 基、 肼、 羟胺、 硫醇基、 羧基、 异丙基、 甲基、 C6-C20 直链或支链烃、 饱和或不饱和烃、 O- 甲基、 聚 醚、 硝基等。此外， 也考虑到多取代芳环。本发明的谷氨酰胺类似物包括但不限于， α- 羟 基衍生物、 γ- 取代衍生物、 环状衍生物和酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。苯丙氨酸类似物的 例子包括但不限于， 对位取代的苯丙氨酸、 邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸， 其 中取代基包括， 炔基、 羟基、 甲氧基、 甲基、 烯丙基、 醛、 硝基、 硫醇基或酮基等。 非天然氨基酸 的具体例子包括但不限于 ： 对 - 乙硫基羰基 -L- 苯丙氨酸、 对 -(3- 氧代丁酰基 )-L- 苯丙氨 酸、 1， 5- 丹酰 - 丙氨酸、 7- 氨基 - 香豆素氨基酸、 7- 羟基 - 香豆素氨基酸、 硝基苄基 - 丝氨 酸、 O-(2- 硝基苄基 )-L- 酪氨酸、 对 - 羧甲基 -L- 苯丙氨酸、 对 - 氰基 -L- 苯丙氨酸、 间-氰 基 -L- 苯丙氨酸、 联苯基丙氨酸、 3- 氨基 -L- 酪氨酸、 联吡啶基丙氨酸、 对 -(2- 氨基 -1- 羟乙 基 )-L- 苯丙氨酸、 对 - 异丙基硫基羰基 -L- 苯丙氨酸、 3- 硝基 -L- 酪氨酸和对 - 硝基 -L- 苯
     丙氨酸。另外， 还有对 - 炔丙氧基苯丙氨酸、 3， 4- 二羟基 -L- 苯丙氨酸 (DHP)、 3， 4， 6- 三羟 基 -L- 苯丙氨酸、 3， 4， 5- 三羟基 -L- 苯丙氨酸、 4- 硝基 - 苯丙氨酸、 对 - 乙酰基 -L- 苯丙氨 酸、 O- 甲基 -L- 酪氨酸、 L-3-(2- 萘基 ) 丙氨酸、 3- 甲基 - 苯丙氨酸、 邻 -4- 烯丙基 -L- 酪氨 酸、 4- 丙基 -L- 酪氨酸、 3- 硝基 - 酪氨酸、 3- 巯基 - 酪氨酸、 三 -O- 乙酰基 -GlcNAc- 丝氨酸、 左旋多巴、 氟化苯丙氨酸、 异丙基 -L- 苯丙氨酸、 对 - 叠氮基 -L- 苯丙氨酸、 对 - 酰基 -L- 苯 丙氨酸、 对 - 苯甲酰 -L- 苯丙氨酸、 L- 磷酸丝氨酸、 膦酰丝氨酸、 膦酰酪氨酸、 对 - 碘 - 苯丙氨 酸、 对 - 溴苯丙氨酸、 对 - 氨基 -L- 苯丙氨酸和异丙基 -L- 苯丙氨酸等。可用于本发明各种 实施方式中的其它非天然氨基酸包括例如， 对 - 硝基苯丙氨酸 ； 邻 - 硝基苯丙氨酸 ； 间-硝 基苯丙氨酸 ； 对 - 硼羰基 Phe ； 邻 - 硼羰基 Phe ； 间 - 硼羰基 Phe ； 对 - 氨基 Phe ； 邻 - 氨基 Phe ； 间 - 氨基 Phe ； 对 - 酰基 Phe ； 邻 - 酰基 Phe ； 间 - 酰基 Phe ； 对 -OMe Phe ； 邻 -OMe Phe ； 间 -OMe Phe ； 对 - 磺基 Phe ； 邻 - 磺基 Phe ； 间 - 磺基 Phe ； 5- 硝基 His ； 3- 硝基 Tyr ； 2- 硝 基 Tyr ； 硝基取代的 Leu ； 硝基取代的 His ； 硝基取代的 Ile ； 硝基取代的 Trp ； 2- 硝基 Trp ； 4- 硝基 Trp ； 5- 硝基 Trp ； 6- 硝基 Trp ； 7- 硝基 Trp ； 3- 氨基酪氨酸、 2- 氨基酪氨酸、 O- 磺 基酪氨酸、 2- 硫氧基苯丙氨酸、 3- 硫氧基氧基苯丙氨酸或对 - 羧基苯丙氨酸、 邻 - 羧基苯丙 氨酸和间 - 羧基苯丙氨酸。另外的实施方式可包括非天然氨基酸， 如脂肪族， 芳基或杂环取 代硼酸， 对 - 二羟硼基苯丙氨酸， 邻 - 二羟硼基苯丙氨酸间 - 二羟硼基苯丙氨酸。在本文的 不同实施方式中， 非天然免疫原包含 20 种天然产生的经典氨基酸中的一种或多种， 所述氨 基酸已被糖基化、 硝基芳基修饰、 硝化、 烷化、 乙酰化、 氧化、 硫酸化或磷酸化 ( 如通过除了 翻译后修饰外的工艺或通过除了化学修饰外的工艺糖基化、 硝基芳基修饰、 硝化、 烷化、 乙 酰化、 氧化、 硫酸化或磷酸化 )。 已知多种利用正交翻译系统可掺入的非天然氨基酸的结构。 参见本文引用参考文献， 将其每一整体纳入本文作参考。
     非天然氨基酸的化学合成
     许多上面提供的非天然氨基酸都可以从， 例如， 美国西格玛公司 (Sigma， USA) 或 奥尔德里奇公司 (Aldrich， Milwaukee， WI， USA) 购得。如各种出版物中所提供的方法或用 本领域技术人员已知的标准方法任选地合成那些不能从市场上购得的非天然氨基酸。有 机合成技术参见， 例如， Fessendon 和 Fessendon 的 《有机化学》 ， (1982， 第二版， 马萨诸塞 州波士顿 WG 出版公司 (Willard Grant Press， Boston Mass.)) ； March 的 《高级有机化学》 ( 第三版， 1985， 纽约威利父子公司 (Wiley and Sons， New York)) ； 和 Carey 和 Sundberg 的 《高级有机化学》 ( 第三版， A 和 B 部分， 1990， 纽约普利马出版社 (Plenum Press， New York))。描述非天然氨基酸合成的其它出版物包括， 例如， WO2002/085923 题为 “体内掺入 非天然氨基酸” (In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids) ； Matsoukas 等， (1995)J.Med.Chem.， 38， 4660-4669 ； King 和 Kidd(1949) 从邻苯二甲酸的中间体新合成谷 氨酰胺和谷氨酸 γ- 二肽 (A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of J.Chem.Soc.， 3315-3319 ； Friedman Glutamic Acid from Phthylated Intermediates)， 和 Chatterrji(1959) 合 成 谷 胺 酰 胺 衍 生 物 作 为 抗 肿 瘤 剂 的 模 式 底 物 (Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents)， J.Am. Chem.Soc.81， 3750-3752 ； Craig 等 (1988)7- 氯 -4[[4-( 二 乙 氨 基 )-1- 甲 基 丁 基 ] 氨 基 ] 喹啉 ( 氯喹 ) 的对映体的绝对构型 (Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine))，J.Org.Chem.53， 1167-1170 ； Azoulay 等 (1991) 作 为 潜 在 抗 疟 药 的 谷 胺 酰 胺 类 似 物 (Glutamin analogues as Potential Antimalarials)， Eur.J.Med.Chem.26， 201-5 ； Koskinen 和 Rapoport(1989) 合成构象受限的氨基酸类似物 4- 取代脯氨酸 (Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues)， J.Org.Chem.54， 1859-1866 ； Christie 和 Rapoport(1985) 从 L- 天 冬 酰 胺 合 成 光 学 纯 的 2- 哌啶酸 (Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine)。应用于 通过氨基酸脱羰和亚胺 离子环化全合成 (+)- 阿扑长春胺 (Application to the Total Synthesis of(+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization)， J.Org.Chem.1989 ： 1859-1866 ； Barton 等， (1987) 用 自 由 基 化 学 合 成新 α- 氨基酸和衍生物 ： 合成 L- 和 D-α- 氨基 - 己二酸、 L-α- 氨基庚二酸和合适的 非饱和衍生物 (Synthesis of Novelα-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry ： Synthesis of L-and D-α-Amino-Adipic Acids， L-α-aminopimelic Acid Tetrahedron Lett.43 ： 4297-4308 ； and Appropriate Unsaturated Derivatives) ， 和， Subasinghe 等， (1992) 使君子氨酸类似物 ： β- 杂环 2- 氨基丙酸衍生物的合成及 其在新使君子氨酸 - 敏化位点上的活性 (Quisqualic acid analogues ： synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site)， J.Med.Chem.35 ： 4602-7。也参见 2003 年 12 月 22 日提交的国际公开号 WO 2004/058946， 题为 “蛋白质阵列 (PROTEIN ARRAYS)” 。
     非天然氨基酸的细胞摄取
     细胞摄取非天然氨基酸通常是设计和选择非天然氨基酸， 例如用于通过遗传编码 的正交对 ( 使识别选择者密码子的 OtRNA 带电的 ORS) 掺入免疫原中应考虑的问题之一。 例如， α- 氨基酸的高电荷密度可能限制摄取。天然氨基酸通过蛋白质转运系统的收集 ( 作用 ) 摄取入细胞， 这些系统往往显示程度不同的氨基酸特异性。可进行快速筛选来评 估细胞将摄取哪种非天然氨基酸。可参见， 例如 2003 年 12 月 22 日提交的名为 “Protein Arrays( 蛋 白 质 阵 列 )”的 国 际 公 布 WO 2004/058946 中 的 毒 性 试 验 ； Liu 和 Schultz， (1999)， “Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code( 含扩增遗传密码的生物演化的进展 )” ， PNAS， 96 ： 4780-4785。 虽然不难采用各种试验 分析摄取情况， 但设计适合于细胞摄取途径的非天然氨基酸的另一种方法是提供生物合成 途径， 从而能在体内产生氨基酸。 非天然氨基酸的生物合成
     细胞中已有许多生物合成途径来产生氨基酸和其它化合物。虽然自然界中， 例如 细胞中， 可能不存在特定非天然氨基酸的生物合成方法， 但本发明的各种实施方式提供了 这种方法。例如， 通过加入新的酶或修饰现有的宿主细胞途径可以在宿主细胞中任选产生 非天然氨基酸的生物合成途径。其它新的酶任选是天然产生的酶或人工开发的酶。例如， 生物合成对氨基苯丙氨酸 ( 如 WO 2002/085923( 同上 ) 所示 ) 依赖加入其它生物的已知酶 的混合物。可通过用含这些酶的基因的质粒转染细胞而将这些基因引入细胞。当这些基因 在细胞中表达时， 它们提供了合成所需化合物的酶途径。可任选加入的酶类型的例子参见 例如 Genbank。也可以相同方式将人工开发的酶任选加入细胞。可以此方式操控细胞机理 和资源用以产生非天然氨基酸。
     实际上， 可采用各种方法产生新的酶从而在体内或体外用于生物合成途径， 改进 现有途径， 产生非天然氨基酸。开发酶和其它生物合成途径组分的许多现有方法适用于本 发明以产生非天然氨基酸 ( 或者， 实际上， 用于开发合成酶使之具有新的底物特异性或其 它感兴趣的活性 )。例如， 可任选采用 DNA 改组来开发新的酶和 / 或这些酶的途径， 从而能 在体外或体内产生非天然氨基酸 ( 或产生新的合成酶 )。可参见， 例如 Stemmer， (1994)， “Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling( 通过 DNA 改组在体外快 速进化蛋白质 )” ， Nature， 370(4) ： 389-391 ； Stemmer， (1994)， “DNA shuffling by random fragmentation and reassembly ： In vitro recombination for molecular evolution( 通 过随机断裂和装配的 DNA 改组 ： 分子进化的体外重组 )” ， Proc.Natl.Acad.Sci.USA.， 91 ： 10747-10751。相关方法改组关联的 ( 例如同源的 ) 基因家族， 从而能快速开具有所需特 性的酶。这种 “家族基因改组” 方法的例子见 Crameri 等， (1998)， “DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution( 不同种类基 因家族的 DNA 改组加速了定向进化 )” ， Nature， 391(6664) ： 288-291。也可采用称为 “产生 杂交酶的递增截短” (ITCHY) 的 DNA 重组方法来产生新的酶 ( 无论是生物合成途径组分或 合成酶 )， 例如 Ostermeier 等， (1999)， “A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology( 不 依 赖 DNA 同 源 性 的 杂 交 酶 的 组 合 方 法 )” ， Nature Biotech， 17 ： 1205 中所述。该方法也可用于产生用作一种或多种体外或体内重组方法底物 的酶或其它途径变体的文库。也可参见， Ostermeier 等， (1999)， “Combinatorial Protein Engineering by Incremental Truncation( 采用递增截短的组合蛋白质工程 )” ， Proc. Natl.Acad.Sci.USA， 96 ： 3562-67 ； Ostermeier 等， (1999)“ ，Incremental Truncation as a Strategy in the Engineering of Novel Biocatalysts( 作为工程改造新生物催化剂的方 法的递增截短 )” ， Biological and Medicinal Chemistry， 7： 2139-44。本文任选使用的另 一种方法采用指数集合诱变 (exponential ensemble mutagenesis) 来产生酶或其它途径 变体的文库， 其能例如催化与产生非天然氨基酸 ( 或新合成酶 ) 有关的生物合成反应。 在该 方法中， 平行地随机选取 (randomized) 感兴趣序列中的小基团残基， 以在各不同位置鉴定 可产生功能性蛋白质的氨基酸。适用于本发明以产生新酶进而产生非天然氨基酸 ( 或新合 成酶 ) 的此类方法的例子见 Delegrave 和 Youvan， (1993)， Biotechnology Research， 11 ： 1548-1552。 在另一方法中， 利用掺杂或简并寡核苷酸的随机或半随机诱变可用于工程改造 酶和 / 或途径成分， 例如采用如以下文献所述的通用诱变方法 ： Arkin 和 Youvan， (1992)， “Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets of amino acids for semi-random mutagenesis” ( 优化核苷酸混合物来编码用于半随机诱变的特定氨基酸亚 组 )， Biotechnology 10 ： 297-300 ； 或 Reidhaar-Olson 等， (1991)， “Random mutagenesis of protein sequences using oligonucleotide cassettes” ( 用寡核苷酸盒随机诱变蛋 白质序列 )， Methods Enzymol.， 208 ： 564-86。利用多核苷酸重装配和位点饱和诱变的另一 种方法 ( 常称为 “非随机” 诱变 ) 可用于产生酶和 / 或途径组分， 然后筛选它们行使一种或 多种合成酶或生物合成途径功能 ( 例如在体内产生非天然氨基酸 ) 的能力。可参见， 例如 Short， “NON-STOCHASTIC GENERATION OF GENETIC VACCINES AND ENZYMES( 遗传疫苗和酶 的非随机产生 )” ， WO 00/46344。
     这种突变方法的替代方法包括重组生物的整个基因组并选择得到的后代的特定途径功能 ( 常称为 “全基因组改组” )。该方法适用于本发明各种实施方式， 例如通过 基因组重组并选择能够产生非天然氨基酸 ( 或其中间体 ) 的生物 ( 大肠杆菌或其它细 胞 )。例如， 以下出版物所指导的方法可应用于途径设计， 从而能开发细胞中现有和 / 或 新的途径进而在体内产生非天然氨基酸 ： Patnaik 等， (2002)， “Genome shuffling of lactobacillus for improved acid tolerance( 乳酸杆菌基因组改组来提高酸耐受性 )” ， Nature Biotechnology， 20(7) ： 707-712 ； 和 Zhang 等， (2002)， “Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria( 基因组改组导致细菌表型快速改善 )” ， Nature， 2 月 7 日， 415 ： 644-646。
     其它可用于生物和代谢途径工程改造 ( 例如为产生所需化合物 ) 的技术也适 用于产生非天然氨基酸。指导有用的路径工程改造方法的出版物的例子包括 ： Nakamura 和 White， (2003)， “Metabolic engineering for the microbial production of 1， 3 propanediol( 微生物生产 1， 3 丙二醇的代谢工程 )” ， Curr.Opin.Biotechnol.， 14(5) ： 454-9 ； Berry 等， (2002)， “Application of Metabolic Engineering to improve both the production and use of Biotech Indigo( 应用代谢工程来提高 Biotech Indigo 的 生产和用途 )” ， J.Industrial Microbiology and Biotechnology， 28 ： 127-133 ； Banta 等， (2002)， “Optimizing an artificial metabolic pathway ： Engineering the cofactor specificity of Corynebacterium 2， 5-diketo-D-gluconic acid reductase for use in vitamin C biosynthesis( 优化人工代谢途径 ： 工程改造用于维生素 C 生物合成的棒状杆 菌 2， 5- 二酮基 -D- 葡糖酸还原酶的辅助因子特异性 )” ， Biochemistry， 41(20) ： 6226-36 ； Selivonova 等， (2001)“ ，Rapid Evolution of Novel Traits in Microorganisms( 微生物 中新特性的快速进化 )” ， Applied and Environmental Microbiology， 67 ： 3645， 和许多其 它出版物。
     无论采用什么方法， 用工程改造的生物合成途径产生的非天然氨基酸的浓度足以 有效地生物合成蛋白质， 例如天然细胞含量， 但不应达到显著影响其它细胞氨基酸的浓度 或耗尽细胞资源的程度。以此方式在体内所产生的浓度一般为约 10mM 到约 0.05mM。一旦 细胞被工程改造从而产生了特定途径所需的酶和非天然氨基酸， 为了核糖体蛋白质合成和 细胞生长， 可任选采用体内选择以进一步优化非天然氨基酸的产生。
     非天然免疫原
     本文用于在对象中产生免疫学应答的免疫原通常包含对象体内靶标部分或能够 在对象体内的靶标部分的 “非天然” 版本 ( 如来自可感染对象的细菌的靶标部分， 来自对象 体内发生肿瘤的靶标部分等 )。 换言之， 非天然免疫原任意包含与靶标部分相同的氨基酸序 列 / 结构， 除了靶标部分的一个或多个氨基酸残疾被替换为非天然氨基酸 ( 参见下文用作 展示的实施例部分 )。另外或此外， 非天然免疫原可包含靶标部分的相同氨基酸序列但具 有一个或多个其它非天然氨基酸残基。本发明的非天然免疫原包括如， 10 格或更多个非天 然氨基酸， 5-10 个非天然氨基酸， 5 个或更少非天然氨基酸， 或者 2 个或更少非天然氨基酸 等。与总氨基酸相比， 非天然免疫原可包含如 10％或更多， 5-10％， 5％或更少， 2％或更少， or 1％或更少百分数的非天然氨基酸。应当理解的嗜， 本文中非天然免疫原可包含一个或 多个数目不同的非天然氨基酸。
     本发明非天然免疫原中一个或多个非天然氨基酸的位置不应视为限制。因此， 例如非天然氨基酸可出现于免疫原的 C 末端或 N 末端， 或者非天然氨基酸可出现于免疫原始 氨基酸序列内的任何位置。参见下文实施例部分。非天然氨基酸 ( 同样对于特定非天然氨 基酸的选择 ) 的放置可出于多种考虑进行。例如， 与起源 ( 或与之对应 ) 的天然靶标蛋白 质部分相比， 非天然氨基酸的位置 / 选择可任意不显著影响免疫原的结构构象。因此， 所得 到的非天然免疫原的结构构象与对应天然靶标部分任意接近匹配， 因此发生抗体的交叉反 应。 因此， 在本文的一些实施方式中， 选择特定的非天然氨基酸及其在免疫原内的特定位置 以尽量见效免疫原与对应天然靶标部分相比的结构 ( 三级 / 四级 ) 变化。在一些实施方式 中， 非天然氨基酸选择 / 放置是否会有助于降低传染性、 毒性等问题对非天然氨基酸及其 放置造成影响。掺入免疫原的非天然氨基酸结构上可任意区别于其取代的天然氨基酸。因 此， 在一些实施方式中， 特定非天然氨基酸对于靶标部分的天然氨基酸是非保守性替换的。 参加下文实施例中关于在非天然免疫原中将靶标部分的 Lys 残基用 pNO2Phe 取代。在其它 实施方式中， 非天然氨基酸对于天然氨基酸是保守性取代物。非天然氨基酸在免疫原中的 位置同样受到抗体可接近性和 / 或其产生血清抗体、 B- 细胞和 / 或 T- 细胞应答能力的影 响。因此， 在本发明的各种非天然免疫原中， 非天然氨基酸可被抗体接近， 如暴露于表面。
     在各种实施方式中， 非天然氨基酸可以是任何非天然氨基酸。 承上， 尽管非天然氨 基酸可以是除 20 种蛋白 α- 氨基酸外的天然产生的化合物， 可用于本发明的非天然氨基酸 具有区别于天然氨基酸的侧链基团， 。本发明所用的非天然氨基酸包括邻 - 甲基 -L- 酪氨 酸， L-3-(2- 萘基 ) 丙氨酸， 3- 甲基 - 苯丙氨酸， 邻 -4- 烯丙基 -L- 酪氨酸， 4- 丙基 -L- 酪氨 酸， 三 -O- 乙酰基 -GlcNAcb- 丝氨酸， L-Dopa， 氟化苯丙氨酸， 异丙基 -L- 苯丙氨酸， 对-叠 氮 -L- 苯丙氨酸， 对 - 酰基 -L- 苯丙氨酸， 对 - 苯甲酰 -L- 苯丙氨酸， L- 磷酸丝氨酸， 膦酰 丝氨酸， 膦酰酪氨酸， 对 - 碘 - 苯丙氨酸， 对 - 硼基苯丙氨酸， 对 - 氨基 -L- 苯丙氨酸， 异丙 基 -L- 苯丙氨酸， 酪氨酸的非天然类似物 ； 谷氨酰胺的非天然类似物 ； 苯丙氨酸的非天然类 似物 ； 丝氨酸的非天然类似物 ； 苏氨酸的非天然类似物 ； 烷基、 芳基、 酰基、 叠氮基、 氰基、 卤 素、 肼、 酰肼、 羟基、 烯基、 炔基 (alkynl)、 醚、 硫醇、 磺酰基、 硒基、 酯、 硫代酸、 硼酸盐、 硼化物 (boronate)、 磷、 膦酰基、 膦、 杂环、 烯酮、 亚胺、 醛、 羟胺、 酮或氨基取代的氨基酸， 或其任何 组合 ； 带有光活化交联剂的氨基酸 ； 自旋标记的氨基酸 ； 荧光氨基酸 ； 带有新型官能团的氨 基酸 ； 与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸 ； 结合金属的氨基酸 ； 含金属的氨基酸 ； 放射性氨基酸 ； 光束缚的和 / 或光敏异构化的氨基酸 ； 含生物素或生物素类似物的氨基酸 ； 糖基化或糖修饰的氨基酸 ； 含酮氨基酸 ； 包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸 ； 重原子取代的氨 基酸 ； 可化学裂解或可光裂解的氨基酸 ； 带有延长侧链的氨基酸 ； 含有毒性基团的氨基酸 ； 糖取代的氨基酸例如糖取代的丝氨酸等 ； 含碳连接的糖的氨基酸 ； 具有氧化还原活性的氨 基酸 ； 含 α- 羟基的酸 ； 含氨基硫代酸的氨基酸 ； α， α 二取代氨基酸 ； - 氨基酸 ； 以及脯氨 酸之外的环状氨基酸。
     在各种实施方式中， 本文中的非天然免疫原如非天然 TNFα 可包含下列一种或多 种： 对 - 硝基苯丙氨酸 ； 邻 - 硝基苯丙氨酸 ； 间 - 硝基苯丙氨酸 ； 对 - 硼羰基 Phe ； 邻 - 硼羰 基 Phe ； 间 - 硼羰基 Phe ； 对 - 氨基 Phe ； 邻 - 氨基 Phe ； 间 - 氨基 Phe ； 对 - 酰基 Phe ； 邻-酰 基 Phe ； 间 - 酰基 Phe ； 对 -OMe Phe ； 邻 -OMe Phe ； 间 -OMePhe ； 对 - 磺基 Phe ； 邻 - 磺基 Phe ； 间 - 磺基 Phe ； 5- 硝基 His ； 3- 硝基 Tyr ； 2- 硝基 Tyr ； 硝基取代的 Leu ； 硝基取代的 His ； 硝 基取代的 Ile ； 硝基取代的 Trp ； 2- 硝基 Trp ； 4- 硝基 Trp ； 5- 硝基 Trp ； 6- 硝基 Trp ； 7- 硝基 Trp ； 3- 氨基酪氨酸， 2- 氨基酪氨酸， O- 磺基酪氨酸， 2- 硫氧基苯丙氨酸， 3- 硫氧基氧基 苯丙氨酸或对 - 羧基苯丙氨酸， 邻 - 羧基苯丙氨酸， 和间 - 羧基苯丙氨酸。应当理解的是对 于特定氨基酸的列举不应视作对于本发明的限制， 并且如本文所列举的其它非天然氨基酸 也可用作本发明。
     通过应用蛋白质结晶学、 NMR 等， 本领域熟练技术人员熟悉确定蛋白质形状 / 构象 以及确定非天然氨基酸掺入多肽的影响 ( 如果有的话 )。下文实施例中显示了产生非天然 免疫原并确定该免疫原的结构构象和抗体可接近性的例子。 此类确定可任意有助于天然免 疫原中特定非天然氨基酸的选择和 / 或放置。
     本发明的非天然免疫原可基于多种靶标部分， 并可以不仅包含多肽 / 蛋白质， 还 包括糖、 脂、 半抗原和 / 或其它非蛋白质分子的关联多肽 / 蛋白质。本发明的免疫原可包括 但不限于本文所述的其它任何靶标 ( 疾病相关 ) 部分。
     在本文所述的一类有用的实施方式中， 非天然免疫原包含非天然 TNFα， 还可以 包含高免疫原性 (E.Keinan 编 .《催化抗体》 (Catalytic Antibodies)(WV 公司， 魏恩海 姆， 2005)， 1-28)、 结构保守的、 可被抗体接近的 4- 硝基 -L- 苯丙氨酸 (pNO2Phe， 图 1A)， 如 86 11 19 21 42 pNO2Phe TNFα、 pNO2Phe -mTNFα、 pNO2Phe -mTNFα、 pNO2Phe -mTNFα、 pNO2Phe -mTNFα、 49 104 113 pNO2Phe -mTNFα、 pNO2Phe -mTNFα 或 pNO2Phe -mTNFα。 在这些实施方式中， 取代突变使 非天然 mTNFα 维持与天然 mTNFα 基本相似的三级和四级蛋白质结构， 因此使所产生的对 抗非天然 mTNFα 的中和抗体更有可能与 wt mTNFα 上所对应的表位交叉反应。如本文其 它地方详述， 与内源性 mTNFα 相比， 非天然氨基酸的取代和 / 或加入不改变 ( 或不显著改 变 ) 非天然 mTNFα 与的构象结构。在人对象中具有治疗性和 / 或预防性处理用途的非天 然 hTNFα 包括 pNO2Phe11-hTNFα、 pNO2Phe19-hTNFα、 pNO2Phe21-hTNFα、 pNO2Phe42-hTNFα、 pNO2Phe49-hTNFα、 pNO2Phe87-hTNFα、 pNO2Phe105-hTNFα 或 pNO2Phe114-hTNFα。
     通常， 血清水平水平的升高与多种疾病状态相关。 然而应当理解的是， 在体内产生 免疫应答的个体和 / 或给予预防性处理的个体等并不显示代表疾病状态的血清 TNFα 水 平。因此， 应当理解的是本发明的抗体和 / 或非天然免疫原可给显示或不显示 TNFα 相关 疾病的个体。
     在本发明的其它实施方式中， 非天然免疫原包含非天然 RBP4， 如治疗和 / 或预防 RBP4 相关的疾病状态。可使用一种或多种非天然氨基酸取代任何天然 RBP4 产生非天然 RBP4。应当理解的是， 对于 TNFα 或其它靶标部分， 取代无需 ( 但可以 ) 用结构保守的非天 然氨基酸替换天然氨基酸。或者或此外， 可将在 RBP4 多肽中加入一个或多个其它非天然氨 基酸 ( 而非 “替换” 其中的天然氨基酸 ) 而产生非天然 RBP4。如前文有关非天然 TNFα 免 疫原的叙述， 对于本文中任何其它免疫原构建， 非天然 RBP4 可任意包含与天然 RBP4 基本相 似的结构， 因此增加了针对非天然 RBP4 产生的中和抗体与对应的天然 RBP4 表位发生交叉 反应的可能性 ( 而不管靶 RBP4 上的该表位是否对应具有非天然氨基酸的非天然 RBP4 中的 表位 )。当然， 同理可知， 非天然免疫原中的用于取代靶标部分天然氨基酸的任何非天然氨 基酸不需要是保守取代。参见下文实施例。在对象中具有治疗性和 / 或预防性处理用途的 非天然的 RBP4 包括 pNO2Phe43mRBP4 和 pNO2Phe108mRBP4 及其人体对应物。
     产生非天然免疫原
     应当理解的是， 可通过多种方法构建本发明的非天然免疫原， 通常是直接掺入的方法。因此， 虽然本文的叙述和实施例主要集中于使用正交翻译系统将非天然氨基酸掺入 蛋白质， ， 但是也可以使用其它方法创造非天然免疫原给予对象， 如产生针对靶标部分的免 疫应答， 或产生用于创造交叉反应抗体的非天然免疫原， 所述抗体可给予对象如中和靶标 部分。在许多实施方式中， 在构建免疫原的过程当中， 将非天然氨基酸加入非天然免疫原 ( 如在用正交翻译、 体外合成或化学合成等构建免疫原的过程中 )， 而非通过翻译后修饰或 对分子中的天然氨基酸进行化学修饰 ( 尽管此类方法可任意与直接掺入的方法联用或作 为补充 )。 因此， 尽管本文详述了构建包含非天然氨基酸的分子的具体方法， 如正交翻译， 但 是不应视作对本发明的限制。 本文的许多实施方式中还包括其它构建含非天然氨基酸的分 子的方法， 包括非翻译后修饰和非化学修饰。
     应当理解的是， 在一些实施方式中利用遗传学方法将非天然氨基酸掺入免疫原 ( 如通过正交翻译系统， 如本文和本文参考文献所述 ) 可提供优于固相肽合成或其它相似 体外方法产生非天然免疫原的益处。例如， 在体内利用遗传学方法将非天然氨基酸掺入免 疫原使用活细胞的生物合成机器合成非天然免疫原。此类体内生产可产生精确的与天生 ( 天然 ) 靶标部分相似的功能性免疫原 ( 或其它部分 )， 但具有因非天然氨基酸而引入的附 加活性 / 功能性基团。因此有助于产生交叉识别天生 ( 天然 ) 靶标部分或野生型部分的强 烈免疫应答。而且， 使用新的生物技术工具在体内进行非天然氨基酸的掺入有助于产生正 确天然构象的免疫原 ( 即与对应靶标部分的构象相似或相同 )， 而且产率高成本低。 在一些 实施方式中， 通过其它体外方法如固相肽合成使用非天然氨基酸全合成蛋白质更多靶向较 短的分子 ( 如～ 60-100 个氨基酸 )， 以较低的产率得到变性蛋白质， 可任意将其连接在一 起。
     正交 tRNA/ 酰胺基 -tRNA 合成酶技术
     如本文所解释的， 本发明中用于产生针对天然靶标部分 ( 对象天生或外源性的 ) 的免疫应答的非天然免疫原通常通过正交 tRNA/ 酰胺基 -tRNA 合成酶系统构建。因此， 对 于本发明新组合物和方法的理解通过对正交 tRNA 和正交氨酰基 -tRNA 合成酶对相关活性 的理解得以加深。通常， 为了在遗传编码中加入非天然氨基酸， 需要包含氨酰基 -tRNA 合成 酶和合适 tRNA 的新的正交对在宿主翻译机器中有效发挥功能， ， 但是存在着对于翻译系统 “正交的” 问题。因此， 正交部分发挥功能不依赖于翻译系统内源性的合成酶和 tRNA。正交 对所需的特征包括， 仅解码或识别特定密码子如选择性密码子如琥珀终止密码子的 tRNA， 所述密码子不被任何内源性 tRNA 解码， 以及氨酰基 -tRNA 合成酶， 该合成酶仅使用特定非 天然氨基酸优先酰胺化同源 tRNA 或 “使其处于携带状态” 。O-tRNA 通常不被酰胺化或很少 酰胺化， 即由内源性合成酶携带。例如， 在大肠杆菌宿主系统中， 正交对包括不与任何内源 性 tRNA 交叉反应的氨酰基 -tRNA 合成酶， 大肠杆菌中由 40 种内源性的 tRNA 合成酶， 以及 不被任何内源性合成酶酰胺化的正交 tRNA， 大肠杆菌种有 21 种正交 tRNA。
     本领域了解适合产生包含本发明的一个或多个非天然氨基酸的蛋白质的正交 翻译系统的一般原理， 以及用于产生正交翻译系统的一般方法。例如参见名为 《生产正 交 tRNA- 酰 胺 -tRNA 合 成 酶 对 的 方 法 和 组 合 物》 (METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS) 的 国 际 公 开 号 WO 2002/086075 ； 名为 《体内掺入非天然氨基酸》 (VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS) 的国际公开号 WO 2002/085923 ； 名为 《扩展真核遗传编码》的国际公开号 WO 2004/094593 ； 2004 年 7 月 7 日 提 交 的 WO 2005/019415 ； 2004 年 7 月 7 日 提 交 的 WO 2005/007870 ； 2004 年 7 月 7 日提交的 WO 2005/007624 ； 2005 年 10 月 27 日提交的 WO 2006/110182， 名为 《体内非天然氨基酸掺入所用正交翻译系统》 (ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS) ； 以及 2007 年 3 月 7 日提交的 WO 2007/103490， 名为 《在真核宿主细胞中表达正交翻译组件的系统》 (SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS)。参见如 Liu 等 (2007)《在哺乳动物细胞中使用遗传学方法将非天然氨基酸 掺入蛋白质》 “Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells” Nat Methods 4 ： 239-244 ； 2008 年 10 月 30 日提交的国际申请号 PCT/ US2008/081868， 名为 《遗传学编码的硼酸氨基酸》 “A Genetically Encoded Boronate Amino Acid， ” ； 2006 年 10 月 11 日提交的 WO2007/047301《对噬菌体展示多肽进行选择 性 翻 译 后 修 饰》 “Selective Posttranslational Modification of Phage-Displayed Polypeptides， ” ； 以 及 2005 年 10 月 27 日 提 交 的 WO2006/110182《体 内 非 天 然 氨 基 酸 掺 入 所 用 正 交 翻 译 组 件》 “Orthogonal Translation Components for the In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids。将这些申请每一的整体纳入本文作为参考 文献。为了讨论将掺入天然氨基酸的正交翻译系统， 及其产生和用途， 还可以参见 Wang 和 Schultz， (2005)《扩展遗传编码》 (Expanding the Genetic Code)Angewandte Chemie Int Ed 44 ： 34-66 ； Xie 和 Schultz， (2005)《扩展的遗传编码》 (An Expanding Genetic Code) Methods 36 ： 227-238 ； Xie 和 Schultz， (2005)《在遗传库中加入氨基酸》 (Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire)Curr Opinion in Chemical Biology 9 ： 548-554 ； Wang 等 (2006)《扩 展 遗 传 编 码》 (Expanding the Genetic Code)Annu Rev Biophys Biomol Struct 35 ： 225-249 ； Deiters 等 (2005)《在大肠杆菌体内将炔掺入蛋白质》 (In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Escherichia coli)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15 ： 1521-1524 ； Chin 等， (2002)《在大肠杆菌遗传编码 中加入 L-4- 叠氮基苯丙氨酸》 (Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli)J Am Chem Soc 124 ： 9026-9027 ； 以及 2005 年 9 月 20 日提交 的国际公开号 WO2006/034332。将这些文档每一的内容整体纳入本文作参考。正交翻译系 统的其它细节参见美国专利号 7,045,337 ； 7,083,970 ； 7,238,510 ； 7,129,333 ； 7,262,040 ； 7,183,082 ； 7,199,222 和 7,217,809。
     此外， 本文所用非天然氨基酸 ( 然后是构建的 ) 指任何氨基酸， 修饰的氨基酸， 除 了硒代半胱氨酸和 / 或吡咯赖氨酸和 20 个遗传编码的 α- 氨基酸外的氨基酸类似物。参 见例如， L.Stryer 的 《生物化学》 ， 第三版， 1988， 纽约自由人公司 (Freeman and Company， New York) 中二十种天然氨基酸的结构。在各种实施方式中， 非天然氨基酸是任何免疫原 性氨基酸 ( 如常见氨基酸的免疫原性类似物 )。此外， 尽管非天然氨基酸可以是除 20 种蛋 白 α- 氨基酸外的天然产生的化合物， 本发明的非天然氨基酸具有区别于天然氨基酸的侧 链基团， 。可用于本发明免疫原的非天然氨基酸的非限制性例子包括邻 - 甲基 -L- 酪氨酸， L-3-(2- 萘基 ) 丙氨酸， 3- 甲基 - 苯丙氨酸， 邻 -4- 烯丙基 -L- 酪氨酸， 4- 丙基 -L- 酪氨 酸， 三 -O- 乙酰基 -GlcNAcb- 丝氨酸， L-Dopa， 氟化苯丙氨酸， 异丙基 -L- 苯丙氨酸， 对-叠 氮 -L- 苯丙氨酸， 对 - 酰基 -L- 苯丙氨酸， 对 - 苯甲酰 -L- 苯丙氨酸， L- 磷酸丝氨酸， 膦酰丝氨酸， 膦酰酪氨酸， 对 - 碘 - 苯丙氨酸， 对 - 硼基苯丙氨酸， 对 - 氨基 -L- 苯丙氨酸， 异丙 基 -L- 苯丙氨酸， 酪氨酸的非天然类似物 ； 谷氨酰胺的非天然类似物 ； 苯丙氨酸的非天然类 似物 ； 丝氨酸的非天然类似物 ； 苏氨酸的非天然类似物 ； 烷基、 芳基、 酰基、 叠氮基、 氰基、 卤 素、 肼、 酰肼、 羟基、 烯基、 炔基 (alkynl)、 醚、 硫醇、 磺酰基、 硒基、 酯、 硫代酸、 硼酸盐、 硼化物 (boronate)、 磷、 膦酰基、 膦、 杂环、 烯酮、 亚胺、 醛、 羟胺、 酮或氨基取代的氨基酸， 或其任何 组合 ； 带有光活化交联剂的氨基酸 ； 自旋标记的氨基酸 ； 荧光氨基酸 ； 带有新型官能团的氨 基酸 ； 与另一分子共价或非共价相互作用的氨基酸 ； 结合金属的氨基酸 ； 含金属的氨基酸 ； 放射性氨基酸 ； 光束缚的和 / 或光敏异构化的氨基酸 ； 含生物素或生物素类似物的氨基酸 ； 糖基化或糖修饰的氨基酸 ； 含酮氨基酸 ； 包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸 ； 重原子取代的氨 基酸 ； 可化学裂解或可光裂解的氨基酸 ； 带有延长侧链的氨基酸 ； 含有毒性基团的氨基酸 ； 糖取代的氨基酸例如糖取代的丝氨酸等 ； 含碳连接的糖的氨基酸 ； 具有氧化还原活性的氨 基酸 ； 含 α- 羟基的酸 ； 含氨基硫代酸的氨基酸 ； α， α 二取代氨基酸 ； ###- 氨基酸 ； 以及脯 氨酸之外的环状氨基酸。
     在特定实施方式中， 本文中的非天然免疫原如非天然 TNFα 或其它任何非天然免 疫原可包含下列一种或多种 ： 对 - 硝基苯丙氨酸 ； 邻 - 硝基苯丙氨酸 ； 间 - 硝基苯丙氨酸 ； 对 - 硼羰基 Phe ； 邻 - 硼羰基 Phe ； 间 - 硼羰基 Phe ； 对 - 氨基 Phe ； 邻 - 氨基 Phe ； 间 - 氨基 Phe ； 对 - 酰基 Phe ； 邻 - 酰基 Phe ； 间 - 酰基 Phe ； 对 -OMePhe ； 邻 -OMe Phe ； 间 -OMe Phe ； 对 - 磺基 Phe ； 邻 - 磺基 Phe ； 间 - 磺基 Phe ； 5- 硝基 His ； 3- 硝基 Tyr ； 2- 硝基 Tyr ； 硝基 取代的 Leu ； 硝基取代的 His ； 硝基取代的 Ile ； 硝基取代的 Trp ； 2- 硝基 Trp ； 4- 硝基 Trp ； 5- 硝基 Trp ； 6- 硝基 Trp ； 7- 硝基 Trp ； 3- 氨基酪氨酸， 2- 氨基酪氨酸， O- 磺基酪氨酸， 2- 硫 氧基苯丙氨酸， 3- 硫氧基氧基苯丙氨酸或对 - 羧基苯丙氨酸， 邻 - 羧基苯丙氨酸和间 - 羧基 苯丙氨酸。应当理解的是对于特定氨基酸的列举不应视作对于本发明的限制， 并且其它非 天然氨基酸 ( 如其它免疫原性非天然氨基酸 ) 也可用作本发明。
     正交翻译系统
     正交翻译系统通常包括含有细胞如原核细胞如大肠杆菌， 所述细胞包含正交 tRNA(O-tRNA)、 正 交 氨 酰 基 tRNA 合 成 酶 (O-RS) 和 非 天 然 氨 基 酸， 如对硝基苯丙氨酸 (pNO2Phe)、 对羧基苯丙氨酸、 硫化酪氨酸等。( 参见上文 )， 其中 O-RS 用非天然氨基酸酰胺 化 O-tRNA。正交对可包括 O-tRNA， 如抑制 tRNA、 移框 tRNA 等， 以及同类 O-RS。可用于产生 本文非天然蛋白质的正交系统， 通常包括 O-tRNA/O-RS 对， 可包含细胞或无细胞环境。
     通常， 当正交对识别选择性密码子并装载与选择性密码子相对应的氨基酸时， 正 交对被称为 “抑制” 选择性密码子。也就是说， 翻译系统如大肠杆菌细胞不识别选择性密码 子， 内源性机器未正常装载， 阻止了多肽的产生， 都则将从核酸翻译为多肽。在正交对系统 种， O-RS 用特定的非天然氨基酸如， 本文实施例中所用的对硝基苯丙氨酸 (pNO2Phe)， 酰胺 化 O-tRNA。装载的 O-tRNA 识别选择性密码子， 并且抑制选择性密码子引起的翻译阻断。
     翻译系统， 如大肠杆菌细胞， 使用 O-tRNA/O-RS 对将非天然氨基酸掺入生长的多 肽链， 如通过编码感兴趣多肽的多核苷酸 ( 如与对象体内或能在对象体内的靶标部分相对 应的非天然免疫原等 )， 其中多核苷酸包含被 O-tRNA 识别的选择性密码子。 在某些系统中， 细胞可包含一个或多个其它 O-tRNA/O-RS 对， 其中另外的 O-RS 用不同的非天然氨基酸装载 另外的 O-tRNA。例如， 一个 O-tRNA 可以识别 4 个碱基密码子， 并且其它 O-tRNA 可识别终止密码子。或者， 多个不同的终止密码子， 多个不同的四碱基密码子， 多个不同的罕用密码子 和 / 或多个部同的非编码密码子可用于相同的编码核酸中。因此， 单个多肽， 如非天然免疫 原， 可包含多个非天然氨基酸， 和 / 或系统中创造的不同多肽可包含不同的非天然氨基酸。 关于更多关于可用的 O-RS/O-tRNA 同源对及其用途的细节， 参见例如本文其它地方注明的 参考文献。
     因此， 一些翻译系统可包含多个 O-tRNA/O-RS 对， 从而使不止一种非天然氨基酸 掺入多肽。例如， 翻译系统还可包括其它不同的 O-tRNA/O-RS 对和第二种非天然氨基酸， 其 中所述另一种 O-tRNA 识别第二种选择性密码子， 并且所述另外的 O-RS 优选使用第二种非 天然氨基酸酰胺化 O-tRNA。例如， 包含 O-tRNA/O-RS 对的细胞， 其中 O-tRNA 识别如琥珀密 码子， 还可包含第二正交对， 其中第二 O-tRNA 识别不同的选择性密码子， 如蛋白石密码子、 赭石密码子、 四碱基密码子、 罕用密码子、 非编码密码子等。 在一些系统中， 不同的正交对来 自不同来源， 这有利于不同选择性密码子的识别。
     某些翻译系统可包含细胞， 如大肠杆菌细胞， 所述细胞包含正交 tRNA(O-tRNA)、 正交酰氨基 -tRNA 合成酶 (O-RS)、 非天然氨基酸以及编码感兴趣多肽的多核苷酸的核酸， 所述感兴趣多肽如与对象自身蛋白质靶标相对应的非天然免疫原， 其中多核苷酸包含被 O-tRNA 识别的选择性密码子。 尽管正交翻译系统可使用培养细胞产生含有非天然氨基酸的 蛋白质， 这并不意味着本文中所用的正交翻译系统需要完整的活细胞。 例如， 正交翻译系统 可使用存在细胞提取物的无细胞系统。事实上， 使用无细胞体外转录 / 翻译系统用于蛋白 质的生产是一项成熟技术。 将这些体外系统应用于使用本文所述正交翻译系统组件产生具 有非天然氨基酸的蛋白质也在本发明范围之内。
     O-tRNA 和 / 或 O-RS 可以是天然产生的或可以来自于天然产生的 tRNA 和 / 或 RS 的突变， 如， 从多种有机体中产生 tRNA 文库和 / 或 RS 文库， 和 / 或使用多种可用的突变策 略。例如， 一种用于产生正交 tRNA/ 酰胺基 -tRNA 合成酶对的策略包括将异源性 tRNA/ 合 成酶对引入系统， 其中所述对作为一种来源或者多种来源， 而非使用 tRNA/ 合成酶对的翻 译系统。异源性合成酶候选物的特征包括， 如不携带任何宿主细胞 tRNA， 异源性 tRNA 候选 物的特征包括， 如不被任何宿主细胞合成酶酰胺化。此外， 异源性 tRNA 对于所有宿主细胞 来说是正交的。产生正交对的第二个策略包括产生突变文库用于筛选和 / 或选择 O-tRNA 或 O-RS。也可将这些策略组合。
     正交 tRNA(O-tRNA)
     希望正交 tRNA(O-tRNA) 介导将非天然氨基酸掺入多核苷酸编码的多肽， 所述多 核苷酸包含 O-tRNA 在体内或体外识别的选择性密码子。
     因此包含 O-tRNA 的组合物还包含正交氨酰基 -tRNA 合成酶 (O-RS)， 其中 O-RS 优 选用非天然氨基酸酰胺化 O-tRNA。此类含有 O-tRNA 的组合物还可包含体外或体内翻译系 统。包含编码感兴趣多肽的多核苷酸的核酸， 其中多核苷酸包含被 O-tRNA 识别的选择性密 码子， 或一种或多种选择性密码子的组合， 可在细胞中出现。
     产生重组正交 tRNA 并筛选其对应选择性密码子将非天然氨基酸掺入多肽的效 率的方法参见如， 国际申请公开号 WO 2002/086075， 《产生正交 tRNA 酰胺基 tRNA 合成酶 对的方法和组合物》 (METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS” ； WO 2004/094593， 《扩展遗传编码》 (EXPANDINGEUKARYOTIC GENETIC CODE” ； 以 及 2004 年 7 月 7 日 提 交 的 WO 2005/019415。 参 见 Forster 等， (2003)《通过全新设计的翻译遗传编码编程肽模拟物合成酶》 “Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo” Proc Natl Acad Sci U S A 100 ： 6353-6357 ； 和 Feng 等， (2003) 《通过单一氨基酸变换扩展 tRNA 合成酶的 tRNA 识别》 “Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change” Proc Natl Acad Sci U S A 100 ： 5676-5681。其它细节参见美国专 利号 7,045,337 ； 7,083,970 ； 7,238,510 ； 7,129,333 ； 7,262,040 ； 7,183,082 ； 7,199,222 和 7,217,809。
     正交酰胺基 -tRNA 合成酶 (O-RS)
     本文中用于产生非天然多肽的 O-RS 系统， 优选在体外或体内用非天然氨基酸酰 胺化 O-tRNA。通过包含 O-RS 的多肽和 / 或通过编码 O-RS 的多核苷酸 that encodes O-RS 或其部分， 可将 O-RS 提供给翻译系统， 如大肠杆菌细胞， 。
     产生 O-RS， 测定其酰胺化效率， 和 / 或改变其底物特异性的一般细节参见国际 公开号 WO 2002/086075， 名为 《产生正交 tRNA 氨酰基 -tRNA 合成酶对的方法和组合物》 (METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS) ； 以及 WO 2004/094593， 名为 《扩展真核遗传编码》 (EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE)。参见， Wang 和 Schultz《扩展遗传编码》 (Expanding the genetic Code)Angewandte Chemie Int Ed 44 ： 34-66(2005) ； 以及 Hoben 和 Soll(1985) Methods Enzymol 113 ： 55-59， 将其内容整体纳入本文作参考。关于该系统的其它细节 参 见 美 国 专 利 号 7,045,337 ； 7,083,970 ； 7,238,510 ； 7,129,333 ； 7,262,040 ； 7,183,082 ； 7,199,222 和 7,217,809。
     来源和宿主有机体
     可任选用其产生非天然免疫原的本发明正交翻译组分 (O-tRNA 和 O-RS) 可得自任 何生物或生物的组合， 可用于任何其它物种的宿主翻译系统， 只要所述 O-tRNA/O-RS 组分 与宿主系统能以正交方式起作用。某正交配对中的 O-tRNA 和 O-RS 无需得自同一生物。例 如， 正交组分可得自用于真细菌宿主系统的古细菌基因。
     另外， 正交 O-tRNA 可衍生自古细菌， 如詹氏甲烷球菌、 嗜热碱甲烷杆菌 ； 盐细菌， 如沃氏富盐菌和盐细菌种 NRC-1 ； 闪烁古生球菌、 激烈火球菌、 极端嗜热古菌、 嗜热泉生古 细菌、 海沼甲烷球菌、 甲烷嗜高热菌 (Methanopyrus kandleri)、 梅氏甲烷八叠球菌 (Mm)、 耐超高温热棒菌 (Pyrobaculum aerophilum)、 深海火球菌、 硫磺矿硫化叶菌 (Ss)、 超嗜热 古菌 (Sulfolobus tokodaii)、 嗜酸热原体、 火山热原体等 ； 或真细菌， 如大肠杆菌、 嗜热栖 热菌、 枯草芽胞杆菌 (Bacillussubtilis)、 嗜热脂肪芽孢杆菌等 ； 而正交 O-RS 可得自以下 生物 ( 或生物的组合 )， 例如古细菌， 如詹氏甲烷球菌、 嗜热碱甲烷杆菌 ； 盐细菌， 如沃氏富 盐菌和盐细菌种 NRC-1 ； 闪烁古生球菌、 激烈火球菌、 极端嗜热古菌、 嗜热泉生古细菌、 海沼 甲烷球菌、 甲烷嗜高热菌、 梅氏甲烷八叠球菌、 耐超高温热棒菌、 深海火球菌、 硫磺矿硫化叶 菌、 超嗜热古菌、 嗜酸热原体、 火山热原体等 ； 或真细菌， 如大肠杆菌、 嗜热栖热菌、 枯草芽胞 杆菌、 嗜热脂肪芽孢杆菌等。在其它系统中， 真核生物来源， 例如植物、 藻类、 原生动物、 真 菌、 酵母菌、 动物 ( 例如哺乳动物、 昆虫、 节肢动物 ) 等也可用作 O-tRNA 和 O-RS 的来源。而 且， O-tRNA/O-RS 配对的各组分可得自同一生物或不同生物。O-tRNA、 O-RS 或 O-tRNA/O-RS 配对可在体内或体外选择或筛选和 / 或可用于细胞， 例如真细菌细胞， 从而产生含有非天然氨基酸的多肽。 所用的真细菌细胞可包括但不限于， 例如， 大肠杆菌 (Escherichia coli)、 嗜热栖热菌 (Thermus thermophilus)、 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)、 嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillus stearothermphilus) 等。
     选择者密码子
     各种选择者密码子均可扩增蛋白质生物合成机器的遗传密码子框架。例如， 选择者密码子可包括， 如独特的三碱基密码子、 无义密码子 ( 如终止密码子 ( 如琥珀密 码子 (UAG) 或乳白密码子 (UGA)))、 非天然密码子、 至少四碱基的密码子、 罕用密码子 等。可将许多选择者密码子引入所需基因， 例如一个以上、 两个以上、 三个以上等。可采 用常规的定点诱变将选择者密码子引入编码感兴趣多肽 ( 例如， 对象的自身抗原等 ) 的 多核苷酸中感兴趣的位点。可参见， 例如 Sayers 等 (1988)， “5 ′， 3 ′ Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis( 硫代磷酸酯寡核苷 酸定向诱变中的 5’ ， 3’ 核酸外切酶 )” ， Nucleic Acids Res， 16 ： 791-802。利用不同的选择 者密码子， 可利用多对正交 tRNA/ 合成酶配对， 从而能利用这些不同的选择者密码子同时 位点特异性地掺入多个非天然氨基酸， 例如包含至少一个非天然氨基酸。
     非天然氨基酸也可由罕用密码子编码。例如， 当体外蛋白合成反应中的精氨酸浓 度下降时， 证实罕用的精氨酸密码子 AGG 可利用丙氨酸酰化的合成 tRNA 而有效插入 ala。 参 Ala 见例如， Ma 等， (1993)“用具有不同反密码子的合成 tRNA 进行体外蛋白质工程改造” (In Ala vitro protein engineering using synthetic tRNA with different anticodons) Biochemistry 32 ： 7939-7945。在这种情况下， 合成 tRNA 与大肠杆菌中少量存在的天然产 Arg 生的 tRNA 竞争。此外， 一些生物不能利用所有三联密码子。已可在体外转录 / 翻译提取 物中利用藤黄微球菌 (Micrococcus luteus) 的未指定密码子 AGA 插入氨基酸。参见例如， Kowal 和 Oliver， (1997)“在藤黄微球菌中使用未指定的密码子进行基于 tRNA 的氨基酸 诱变 (Exploiting unassigned codons in Micrococcus luteus for tRNA-based amino acid mutagenesis)” Nucl Acid Res 25 ： 4685-4689。
     选择者密码子也可包括延伸密码子， 例如四个或四个以上碱基的密码子， 如四个、 五个、 六个或更多碱基的密码子。四碱基密码子的例子包括， 例如 AGGA、 CUAG、 UAGA、 CCCU 等。五碱基密码子的例子包括， 例如 AGGAC、 CCCCU、 CCCUC、 CUAGA、 CUACU、 UAGGC 等。将非 天然氨基酸掺入蛋白质如非天然免疫原如下文所述任何非天然 TNFα 或者事实上感兴趣 的任何靶标部分的具体方法可包括使用基于移框抑制的扩展密码子。四个或四个以上碱 基的密码子可将例如一个或多个非天然氨基酸插入同一蛋白质。在其它例子中， 反密码 子环可解码例如至少一种四碱基密码子、 至少一种五碱基密码子或至少一种六碱基密码 子或更多。由于可能的四碱基密码子有 256 种， 所以同一细胞中可用四个或四个以上碱 基的密码子编码多种非天然氨基酸。参见 Anderson 等， (2002)《探索密码子和反密码子 大小的极限》 (Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size)Chemistry and Biology 9 ： 237-244 ； Magliery 等， (2001)《扩展遗传编码 ： 选择有效的四碱基密码抑制 子， 以及在大肠杆菌中使用文库法鉴定 “狡猾的” 四碱基密码子》 (Expanding the Genetic Code ： Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of“Shifty” Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli)JMol Biol 307 ： 755-769 ； Ma 等， (1993)《体外使用具有不同反密码子的合成 tRNAAla 工程 改造蛋白》 (In vitro protein engineering using synthetic tRNAAla with different anticodons)Biochemistry 32 ： 7939 ； Hohsaka 等， (1999)《在 体 外 蛋 白 合 成 系 统 中 将 含 大 芳 族 基 团 的 非 天 然 氨 基 酸 有 效 掺 入 链 霉 亲 合 素》 (Efficient Incorporation of Nonnatural Amino Acids with Large Aromatic Groups into Streptavidin in In Vitro Protein Synthesizing Systems)J Am Chem Soc 121 ： 34-40 ；以 及 Moore 等， (2000) 《四联密码子 ： 密码子扩增的启示， 以及翻译步骤大小的说明》 (Quadruplet Codons ： Implications for Code Expansion and the Specificaion of Translation Step Size) J Mol Biol 298 ： 195-209。四碱基密码子已在各种正交系统中用作选择者密码子。可参 见， 例如， WO 2005/019415 ； WO 2005/007870 和 WO 2005/07624。 还可参见 Wang 和 Schultz， (2005)《扩展遗传编码》 (Expanding the genetic Code)Angewandte Chemie Int Ed 44 ： 34-66.
     对于给定系统， 选择者密码子还可包括天然三碱基密码子中内源性系统不用 ( 或 很少用 ) 的那个天然碱基密码子。例如， 这包括缺乏能识别该天然三碱基密码子的 tRNA 的 系统， 和 / 或该三碱基密码子是罕用密码子的系统。
     选择者密码子任选包含非天然碱基对。适用于本文中方法和组合物的用途 的非天然碱基对的描述包括 ： 例 如 Hirao 等， (2002)， “An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein( 将氨基酸类似物掺入蛋白质的非天 然碱基对 )” ， Nature Biotechnology， 20 ： 177-182。参见 Wu 等， (2002)《非天然核苷的酶 磷酸化》 (Enzymatic Phosphorylation of Unnatural Nucleosides)J Am Chem Soc 124 ： 14626-14630。
     如上所述， 在本发明的不同实施方式中， 可通过多种方式构建非天然免疫原 ( 可 用于在对象体内产生免疫应答， 或者产生交叉反应抗体然后给予对象 )。例如， 通常可通过 直接掺入法如正交翻译系统或体外翻译系统或通过固相合成来构建非天然免疫原。然而， 间接掺入如化学修饰或翻译后修饰可与正交翻译方法、 或体外翻译系统方法、 或通过正交 或体外翻译系统对氨基酸进行另外的修饰 ( 或对已经构建分子中的天然氨基酸进行另外 的修饰 ) 等联用 ( 或作为补充 )。应当理解的是本发明的各种实施方式可包含通过多种可 用方法构建的非天然氨基酸。
     将非天然氨基酸掺入免疫原的非正交方法
     除上述之外， 各种非正交策略可用于将非天然氨基酸引入本文中的靶标部分 ( 或 者通过正交方法对掺入靶标部分 ( 如疾病相关部分 ) 的非天然氨基酸进行修饰 ) 产生非天 然免疫原 ( 如与上述正交方法联用 )。应当理解的是， 本文中的典型实施方式中， 在构建免 疫原的过程中将非天然氨基酸掺入免疫原 ( 如当免疫原进行翻译、 创造 / 合成等时 )， 并且 不通过后期化学修饰或翻译后修饰加入。 因此， 在一些实施方式中， 具有反应性侧链氨基酸 2 的衍生物如 Lys、 Cys 和 Tyr， 如将赖氨酸转化为 N - 乙酰基 - 赖氨酸， 可与正交方法或其它 直接掺入方法联用和 / 或作为补充。化学合成也可提供掺入非天然氨基酸的方法。参见例 如 Dawson 等， Annu.Rev.Biochem.， 69 ： 923(2000)。
     在另一实施例中， 将常用的体外生物合成方法 ( 其中用所需非天然氨基酸化学酰 基化抑制子 tRNA) 加入到能够支持蛋白质合成的体外提取物中， 该方法已用于将超过 100种非天然氨基酸定点掺入多种任何大小的蛋白质， 可用于本文创造非天然免疫原。参见例 如， Cornish 等， Angew.Chem.Int.Ed.Engl.， 1995， 34 ： 621(1995) ； Noren 等， Science 244 182-188(1989) ； 以及 Bain 等， J.Am.Chem.Soc.111 8013-8014(1989)。
     称为选择性压力掺入的体内方法也可用于利用野生型合成酶的混乱创建本文的 非天然免疫原。参见例如， Budisa 等， FASEB J.， 13 ： 41(1999)。在该营养缺陷型菌株中， 特定天然氨基酸供应细胞的相关代谢通路被关闭， 菌株生长于含有限浓度天然氨基酸的限 制性培养基中， 靶标基因的转录受到抑制。在进入静止生长期时， 天然氨基酸耗尽， 换上非 天然氨基酸类似物。重组蛋白质表达的诱导引起含非天然类似物蛋白质的积累。参见如 Minks 等， Anal.Biochem.， 284 ： 29(2000) ； Duewel 等， Biochemistry， 36 ： 3404(1997) ； 以及 Tang 等， Angew.Chem.Int.Ed.Engl.， 40 ： 1494(2001)。另外的例子可参见如 Hendrickson 等， EMBO J.， 9： 1665(1990) ； Boles 等， Nat.Struct.Biol.， 1： 283(1994) ； Budisa 等， Eur. J.Biochem.， 230 ： 788(1995) ； Budisa 等， J.Mol.Biol.， 270 ： 616(1997) ； vanHest 等， FEBS Lett.， 428 ： 68(1998) ； van Hest 等， J.Am.Chem.Soc.， 122 ： 1282(2000) ； 以 及 Kiick 等， Tetrahedron， 56 ： 9487(2000)。
     本文中另一将非天然氨基酸掺入免疫原的可选 / 附加策略是对具有校对机制的 合成酶进行修饰。这些合成酶不能进行区分， 因此用同类天然氨基酸结构相似的氨基酸使 tRNA 携带， 所述同类天然氨基酸是 tRNA 通常携带的。在合成酶的另一位点纠正错误， 该合 成酶对 tRNA 错误携带的氨基酸进行去酰基化， 以保证蛋白质翻译的保真度。如果合成酶的 校对活性失活， 携带通常其携带的氨基酸结构类似物的 tRNA 可脱离编辑功能， 将结构氨基 酸类似物掺入生长的多肽链中。 。参见 Doring 等， Science， 292 ： 501(2001)。
     固相合成和半合成方法也可用于合成包含本文非天然氨基酸的免疫原。例如， 参见下述公开物以及引用文献 ： Crick 等， Nature， 1227-1232(1961) ； Hofmann 等， J.Am Chem， 5914-5919(1966) ； Kaiser 等， Acc Chem Res， 47-54(1989) ； Nakatsuka 等， J Am Chem Soc， 3808-3810(1987) ； Schnolzer 等， Science， 221-225(1992) ； Chaiken 等， CRC Crit Rev Biochem， 255-301(1981) ； Offord， Protein Eng.， 151-157(1987) ； 以 及 Jackson 等， Science， 243(1994)。
     可在本文各种实施方式中使用化学修饰在本发明的非天然免疫原中引入多种非 天然侧链， 包括辅因子、 自旋标记物和寡核苷酸。化学修饰以及其它翻译后修饰通常可用 作直接掺入方法如正交翻译的辅助 ( 如果有的话 )。因此， 化学修饰可任意与正交活上 述其它方法联用， 如对通过正交方法掺入的非天然氨基酸进行修饰。参见如 Corey 等， Science， 1401-1403(1987) ； Kaiser 等， Rev Biochem， 565-595(1985) ； Kaiser 等， Science， 505-511(1984) ； Neet 等， J Biol.Chem， 6392-6401(1968) ； Polgar 等， J.Am Chem Soc， 3153-3154(1966) ； 以及 Pollack 等， Science， 1038-1040(1988)。
     或者， 使用化学修饰的酰胺基 -tRNA 的生物合成方法已被用于将多种生物物理探 针掺入体外合成的蛋白质， 在本文中可用于创造非天然免疫原。参见下列公开物及其引用 文献 ： Brunner， J.， Annu.Rev Biochem， 483-514(1993) ； 以及 Krieg 等， Proc.Natl.Acad. Sci， 8604-8608(1986)。
     通过将化学酰胺基化的抑制子 tRNA 加入包含所需琥珀无义突变的基因编程的蛋 白合成反应中， 也可将非天然氨基酸定点掺入本发明的非天然免疫原。 利用这些方案， 使用特定氨基酸的营养缺陷型菌株， 可将 20 种常见氨基酸种的多种用结构相近的同源物取代， 如氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。参见如 Noren 等， Science， 244 ： 182-188(1989) ； Nowak 等， Science 268 ： 439-42(1995) ； Bain 等， J.Am Chem Soc， 111 ： 8013-8014(1989) ； Budisa 等， FASEB J.， 13 ： 41-51(1999) ； Ellman 等， Methods in Enz.， 301-336(1992) ； 以及 Mendel 等， Annu Rev Biophys.Biomol Struct.， 24， 435-62(1995)。
     可使用显微注射技术将非天然氨基酸掺入本发明的非天然免疫原。参见例如 Nowak 等， Science， 268 ： 439(1995) ； 和 Dougherty， Curr.Opin.Chem.Biol.， 4： 645(2000)。 参 见 如 Turcatti 等， J.Biol.Chem.， 271 ： 19991(1996)Gallivan 等， Chem.Biol.， 4： 739(1997) ； Miller 等， Neuron， 20 ： 619(1998) ； England 等， Cell， 96 ： 89(1999) ； 以及 Lu 等， Nat.Neurosci.， 4： 239(2001)。
     固相多肽合成是广泛用于化学合成含非天然氨基酸的多肽和小蛋白的另一方法 ( 参见如 Merrifield(1963) 《固相肽合成 I， 四肽合成》 (Solid Phase Peptide synthesis. I.The synthesis of a tetrapeptide)JACS 85 ： 2149-2154)， 可将其改变以产生本发明的 非天然免疫原。该技术通常包含两步 ： 第一阶段 SPPS 包括在多聚支持物上通过重复的偶 联 - 去保护循环使用受保护的氨基酸衍生物进行肽链的组装。固相连接肽的游离 N 末端胺 可与单一 N- 保护的氨基酸单位偶联。然后将该单位去保护， 暴露新的可被另一氨基酸连 接的 N- 末端胺。在 SPPS 第二阶段， 将肽从支持物上切割， 并移除侧链保护基团以产生肽， 如包含一个活多个非天然氨基酸的肽。有两种固相肽合成的主要使用形式 ： Fmoc(Carpino 等， (1972) 《9- 芴甲氧酰氨基保护基团》 (9-Fluorenylmethoxycarbonyl amino-protecting group)J Org Chem 37 ： 3404-3409)， 其中使用了碱性活性 α- 氨基保护基， 以及 t-Boc， 其 中使用了酸性活性 α- 氨基保护基。每一方法包括不同的树脂和氨基酸侧链保护以及后续 切割 / 去保护步骤。
     还可使用蛋白质半合成将非天然氨基酸掺入蛋白质产生本文的非天然免疫原。 蛋 白质半合成常使用分裂的蛋白内含肽， 可自身剪切并与剩下部分如外显肽再连接的蛋白质 的一部分， 产生称为剪切产物的新的活性蛋白质。 例如， 不包含非天然氨基酸的蛋白质结构 域可与第二个不包含非天然氨基酸的蛋白质结构域联用， 产生非天然免疫原。该策略有利 于产生难以在体内蛋白质表达系统中表达的非天然免疫原。
     多种化学连接技术也可用于将非天然氨基酸掺入本文蛋白质， 例如在蛋白质半合 成过程中， 从而产生非天然免疫原。例如， 在天生化学连接 (NCL) 反应中， 在存在外源性巯 基催化剂的条件下， 包含 N- 末端半胱氨酸的多肽与含 α- 硫酯基团如 C- 末端 α- 硫酯 的非天然氨基酸发生反应， 在连接位点产生天生肽键 (Dawson 等， (1994)《通过天生化学 连接的蛋白质反应》 (Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation)Science 266 ： 776-779)。表达蛋白连接 (EPL) 是一种蛋白工程改造方案， 使重组和合成多肽化学选 择性或区域选择性的连接一起。该方法使大多数蛋白质的一级结构可被合成有机化学工 具所接近， 使多种非天然氨基酸中任何类掺入蛋白以产生非天然免疫原。关于这些和其它 化学连接技术的深入细节参见 Howl 编， 《肽合成及其应用》 (Peptide Synthesis and Its Applications)， 修马纳出版公司， 新泽西州托托瓦 (Humana Press ： Totowa NJ)， 2005 等。
     关于技术的其它细节
     产生 RS 和 tRNA 突变的其它有用参考文献， 以及多种重组和体外核酸操作的其它有用方法 ( 包括克隆、 表达、 PCR 等 ) 包括 Berger 和 Kimmel， 《分子克隆技术指导 ： 酶学方 法》 (Guide to Molecular Cloning Techniques， Methods in Enzymology)152 卷科学出 版社， 加州圣地亚哥， 贝格 (Academic Press， Inc.， San Diego， CA(Berger)) ； Kaufman 等， (2003)《生物医学分子和细胞方法手册第二版》 (Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine Second Edition)Ceske( 编 )CRC 出版社 ( 考夫曼 ) ； 以及 《核酸实验手册》 (The Nucleic Acid Protocols Handbook)Ralph Rapley( 编 )(2000) 冷泉港， 修马纳出版公司 ( 拉普利 )(Cold Spring Harbor， Humana Press Inc(Rapley)) ； Chen 等 ( 编 )《PCR 克隆实验方案 ： 第二版》 (PCR Cloning Protocols， Second Edition) ( 分子生物学方法， 192 卷 ) 修马纳出版公司 ； 以及 Viljoen 等， (2005) 《分子诊断 PCR 手册》 (Molecular Diagnostic PCR Handbook)， 斯普林格公司 (Springer)， ISBN 1402034032。
     各种蛋白质方法均为已知， 它们可用于分离、 检测、 操作或处理按照本发明产 生的蛋白质， 例如来自表达任何本发明非天然免疫原的细胞的重组培养物的蛋白质。 本 领 域 熟 知 各 种 蛋 白 质 分 离 和 检 测 方 法， 包 括 例 如， R.Scopes， 《蛋 白 纯 化》 (Protein Purification)， Springer-Verlag， N.Y.(1982) ； Deutscher， 《酶 学 方 法》 (Methods in Enzymology) 第 182 卷 ： “蛋白纯化指南” (Guide to Protein Purification)， Academic Press， Inc.N.Y.(1990) ； Sandana(1997)《蛋 白 的 生 物 分 离》 (Bioseparation of Proteins)， Academic Press， Inc. ； Bollag 等 (1996)《蛋 白 方 法》 (Protein Methods) 第 2 版， Wiley-Liss， NY ； Walker(1996)《蛋白操作程序手册》 (The Protein Protocols Handbook)Humana Press， NJ， Harris 和 Angal(1990)《蛋 白 纯 化 应 用 ： 实 用 方 法》 (Protein Purification Applications ： A Practical Approach)Oxford 的 IRL Press， Oxford， England ； Harris 和 Angal《蛋白纯化方法 ： 实用方法》 (Protein Purification Methods ： A Practical Approach)Oxford 的 IRL Press， Oxford， England ； Scopes(1993) 《蛋 白 纯 化 ： 原 理 和 实 践》 (Protein Purification ： Principles and Practice) 第 3 版 SpringerVerlag， NY ； Janson 和 Ryden(1998)《蛋 白 纯 化 ： 原 理、 高 分 辨 率 方 法 和 应 用》 (Protein Purification ： Principles， High Resolution Methods and Applications)， 第 二版， Wiley-VCH， NY ； 和 Walker(1998) 《CD-ROM 上的蛋白操作程序》 (Protein Protocols on CD-ROM)Humana Press， NJ ； 和其中引用的参考文献中所列方法。关于蛋白质纯化和检测方 法的其它细节参见 Satinder Ahuja 编， 《生物分离手册》 (Handbook of Bioseparations)， 科学出版社 (Academic Press)(2000)。 这些可用的方法可用于 ( 任意与其它蛋白纯化方法 联用 ) 分离和 / 或纯化通过本文多种方法产生的非天然免疫原 ( 如， 通过正交翻译方法 ) 从而， 如， 制备治疗所用免疫原、 疫苗或本发明的其它方面。
     抗体和抗体生产
     在一些实施方式中， 本发明包含一种或多种针对免疫原 ( 即包含一个或多个非天 然氨基酸的非天然疾病相关部分 ) 的抗体， 可将抗体给予对象。如上文详述， 该抗体通常与 对象体内或能够在其体内的对应靶标部分交叉反应， 其中天然靶标部分不包含非天然氨基 酸， “非天然” 免疫原源自天然靶标部分且与免疫原相对应。
     如上所述， 抗体指由一个或多个基本由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段 编码的多肽构成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括 κ、 λ、 α、 γ、 δ、 ε 和 μ 恒定区 基因， 以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为 κ 或 λ。重链归类为 γ、 υ、 α、δ 或 ε， 它们分别依次定义免疫球蛋白类型 IgG、 IgM、 IgA、 IgD 和 IgE。
     一种典型的免疫球蛋白 ( 如抗体 ) 的结构单位包含四聚体。各四聚体由两个相同 的多肽链对组成， 各对有一条 “轻链” ( 约 25kD) 和一条 “重链” ( 约 50-70kD)。各链的 N 末 端确定约 100-110 或更多氨基酸的可变区， 主要负责抗原识别。术语轻链可变区 (VL) 和重 链可变区 (VH) 分别指这些轻链和重链。
     本发明抗体可以完整的免疫球蛋白或用不同肽酶消化产生许多良好表征的片段 存在。因此， 例如， 胃蛋白酶在铰链区中的二硫连接下面消化抗体， 产生 F(ab′ )2， Fab 的 二聚体， 其本身是由二硫键连接于 VH-CH1 的轻链。可在温和条件下还原 F(ab′ )2 以打断 铰链区中的二硫连接， 从而将 F(ab′ )2 二聚体转化为 Fab′单体。Fab′单体实质上是具 有部分铰链区的 Fab( 对其它抗体片段的更详细描述参见， 《基础免疫学》 (Fundermental Immunology)， W.E.Paul 编， Raven Press， N.Y.(1999))。虽然根据完整抗体的消化定义了 不同抗体片段， 但是本领域技术人员将理解， 也可用化学方法或通过重组 DNA 的方法从头 合成所述 Fab′片段。因此， 本文中所用术语抗体， 也包括通过全抗体修饰或用重组 DNA 方 法从头合成所产生的抗体片段。 抗体具体包括单链抗体 ( 以一条多肽链形式存在的抗体 )， 或重链可变区和轻链可变区连接在一起 ( 直接或通过肽接头连接 ) 行成连续多肽的单链 Fv 抗体 (sFv 或 scFv)。单链 Fv 抗体与 VH-VL 异源二聚体共价连接， 所述 VH-VL 异源二聚体表 达自包含直接连接或通过肽编码接头连接的 VH- 和 VL- 编码序列的核酸。参见 Huston 等 (1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA， 85 ： 5879-5883。尽管 VH 和 VL 彼此连接组成单一多肽链， 但是 VH 和 VL 结构于的连接是非共价的。本领域熟练技术人员了解将天然聚集的但是化学 分离的来自抗体 V 区的轻重多肽链转化为以具有与抗原结合位点结构基本相似的三维结 构折叠的分子的 scFv 抗体和多种其它结构 ( 参见如美国专利号 5,091,513， 5,132,405 和 4,956,778)。用于本发明的抗体包括多克隆和单克隆抗体。
     可使用本发明的非天然免疫原或其片段产生本发明抗体。 使用本文发明的非天然 免疫原产生多克隆抗体、 人源化抗体、 单克隆抗体或抗体片段。通过标准方法纯化抗体， 提 供的制备物基本没有不需要的会影响抗体反应性的污染物， 如血清蛋白质。对于多克隆抗 体， 可用本发明的非天然免疫原免疫所选哺乳动物 ( 如小鼠、 兔、 山羊、 马等 )。然后按照本 领域熟练技术人员熟知方法收集免疫动物的血清， 并进行处理。 而且， 通过本领域熟练技术 人员熟知步骤， 利用免疫亲和色谱纯化多克隆抗体。
     或者此外， 可创造针对本发明非天然免疫原的单克隆抗体。本领域技术人员熟知 通过杂交瘤技术产生单克隆抗体。例如， 可通过细胞融合或其它技术如直接用原癌 DNA 转 化 B 淋巴细胞， 用 EB 病毒转染， 创造用于产生本发明抗体的永生细胞系。 参见例如 Schreier 等， 《杂交瘤技术》 (Hybridoma Techniques)(1980) ； Hammerling 等， 《单克隆抗体和 T- 细胞 杂交瘤》 (Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas)(1981) ； Kennett 等， 《单克隆 抗体》 (Monoclonal Antibodies)(1980) ； 美国专利号 4,341,761 ； 4,399,121 ； 4,427,783 ； 4,444,887 ； 4,452,570 ； 4,466,917 ； 4,472,500 ； 4,491,632 ； 和 4,493,890 等。
     本领域技术人员易于理解其它多种已知方法指导抗体的设计和产生 ( 如单克隆、 多克隆、 人源化等 )。也可通过多种商业服务制备抗体 ( 如勃克利抗体实验室 (Berkeley Antibody Laboratories， 贝瑟实验室 (Bethyl Laboratories)， 安乐华 (Anawa)， 欧罗吉泰 (Eurogenetec 等 ))。基于含抗体可接近的对 - 硝基苯丙氨酸的非天然 TNFα 免疫原的抗 -TNFα。
     在下文实施例详述的具体实施方式中， 本发明提供了可用于治疗和 / 或预防 TNFα 活性相关病理的组合物和方法。
     肿瘤坏死因子 α(TNFα) 在多种慢性炎症疾病， 包括克罗恩氏病， 内毒素休克， 脑 疟疾， 类风湿性关节炎等的病理中扮有重要角色。治疗和 / 或预防这些疾病的一大挑战是 开发出方法使免疫系统选择性克服对于内源性 TNFα 的耐受， 从而刺激 TNFα 中和抗体的 产生。
     对于 TNFα 的中和可缓解这些疾病症状。例如， 多种实验使用抗 -TNFα 抗血 清测定其治疗潜能 ( 参见 Veres 等， (2007)《英夫利昔单抗用于治疗儿科克罗恩氏病》 (Infliximab therapy for pediatric Crohn ′ s disease” )Expert Opin Biol Ther 7： 1869-1880 ； Ackermann 等 (2007)， 《肿 瘤 坏 死 因 子 α 作 为 风 湿 病 治 疗 靶 点》 (Tumor necrosis factor as a therapeutic target of rheumatologic disease)Expert Opin Ther Targets 8 ： 2553-68， Knight 等 (1993)《小鼠 - 人嵌合 TNF 抗体得构建及初步表征》 (Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody)Mol Immunol 30 ： 1443-1453 ； Present 等， (1999)《在克罗恩氏病人中用英夫 利昔单抗治疗瘘》 “Infliximab for the Treatment of Fistulas in Patients with Crohn′ s Disease” New Engl J Med 340 ： 1398-1405)。对于可溶性嵌合 TNFα 受体在尽 量减少关节炎， 感染性休克和克罗恩氏病的效果已经进行了研究 (Peppel 等 (1991)， 《肿瘤 坏死因子 (TNF) 受体 -IgG 重链嵌合蛋白质作为二价 TNF 活性拮抗剂》 (A tumor necrosis factor(TNF)receptor-IgG heavy chain chimeric protein as a bivalent antagonist of TNF activity)J Exp Med 174 ： 1483-1489 ； Williams 等 (1995)， 《利用 TNF 受体 -IgG 融 合 蛋 白 以 及 与 抗 -CD4 组 合 成 功 治 疗 胶 原 诱 导 的 关 节 炎》 (Successful therapy of collagen-induced arthritis with TNF receptor-IgG fusion protein and combination with anti-CD4)Immunology 84 ： 433-439 ； Hoy 等 (2007) 《依那西普在控制强直性脊柱炎和 银屑病关节炎方面的用途综述》 (Etanercept ： A Review of its Use in the Management of Ankylosing Spondylitis and Psoriatic Arthritis)Drugs 67 ： 2609-2633 ； Fisher 等 (1996)， 《用肿瘤坏死因子受体 ： Fc 融合蛋白治疗感染性休克》 (Treatment of Septic Shock with the Tumor Necrosis Factor Receptor ： Fc Fusion Protein)New Eng J Med 334 ： 1697-1702 ； Korzenik(2004)， 《克罗恩氏病 ： 英夫利昔单抗之外的未来抗肿瘤坏死因 子疗法》 (Crohn′ s disease ： future anti-tumor necrosis factor therapies beyond infliximab)Gastro Clin of North Am 33 ： 285-301)。 打破对象对自身 TNFα 免疫耐受是 治疗和 / 或预防 TNFα 相关疾病的一种策略。
     已经通过多种策略尝试打破免疫耐受的挑战， 如本文及其它文献所述。本发明的 一些实施方式提供了非天然 TNFα， 即包含非天然氨基酸 (UAA) 的 TNFα， 当给予对象时， 刺激或增强针对内源性 TNFα 的免疫应答， 如对象中出现或不出现代表疾病状态的血清水 平和 / 或表达水平的 TNFα。本文还提供针对疾病状态的治疗和疫苗， 如那些本文所述与 TNFα 的存在或存在水平相关的疾病状态， 这意味着给予与天然 TNFα 交叉反应的抗非天 然 TNFα 抗体， 以减弱或预防 TNFα- 相关疾病状态的症状。
     通常， 血清水平水平的升高与多种疾病状态相关。 然而应当理解的是， 在体内产生免疫应答的个体和 / 或给予预防性处理的个体等并不显示代表疾病状态的血清 TNFα 水 平。因此， 应当理解的是本发明的抗体和 / 或非天然免疫原可给显示或不显示 TNFα 相关 疾病的个体。
     产生包含任何非天然氨基酸的非天然 TNFα， 如任何本文描述的非天然 TNFα， 在 本文中使用非天然免疫原和非天然免疫原产生及实施例中。 尽管使用正交翻译系统产生下 文实施例中的非天然氨基酸， 应当理解的是也可用本文详述的一种或多种非正交方法也可 产生非天然 TNFα， 所述非正交方法不是化学修饰或翻译后修饰 ( 如选择性压力掺入， 固相 合成和蛋白质半合成等 )。
     如本文实施方式所述， 非天然 TNFα 在 86 位氨基酸上包含高免疫原性 (E.Keinan 编， 《催化抗体》 (Catalytic Antibodies)(WV 公司， 魏恩海姆， 2005)， 1-28)， 结构保守的， 86 抗体可接近的 4- 硝基 -L- 苯丙氨酸 (pNO2Phe， 图 1A) 残基， 如 pNO2Phe TNFα。在该实施 86 方式中， 取代突变使非天然 mTNFα， 如 pNO2Phe mTNFα， 维持与天然 mTNFα 基本相似的三 级和四级蛋白质结构， 因此使所产生的对抗非天然 mTNFα， 如 pNO2Phe86mTNFα 的中和抗体 更有可能与天然 mTNFα， 如小鼠 TNFα 上所对应的表位交叉反应。如本文详述， 与内源性 天然 mTNFα 相比， 非天然氨基酸的取代和 / 或加入不任意改变 ( 或不显著改变 ) 非天然 mTNFα 与的构象结构。在小鼠对象体内具有治疗性和 / 或预防性处理用途的其它非天然 TNFα 衍生物 ( 如 GenBank 登录号 NP_038721) 包括 pNO2Phe11-mTNFα， pNO2Phe19-mTNFα， pNO 2 Phe 21 -mTNF α，pNO 2 Phe 42 -mTNF α，pNO 2 Phe 49 -mTNF α，pNO 2 Phe 104 -mTNF α， 或 pNO2Phe113-mTNFα。在人类对象体内具有治疗性和 / 或预防性处理用途的其它非天然 hTNFα 衍 生 物 (GenBank 登 录 号 AAA61200) 包 括 pNO2Phe11-hTNFα， pNO2Phe19-hTNFα， p N O 2 P h e 2 1 - h T N F α ，p N O 2 P h e 4 2 - h T N F α ，p N O 2 P h e 4 9 - h T N F α ，p N O 2 P h e 8 7 - h T N F α ， pNO2Phe105-hTNFα 或 pNO2Phe114-hTNFα。
     通常， 血清水平水平的升高与多种疾病状态相关。 然而应当理解的是， 在体内产生 免疫应答的个体和 / 或给予预防性处理的个体等并不显示代表疾病状态的血清 TNFα 水 平。因此， 应当理解的是本发明的疫苗、 抗体和 / 或非天然免疫原可给显示或不显示 TNFα 相关疾病的个体。
     基于含抗体可接近的对 - 硝基苯丙氨酸的非天然 RBP 免疫原的抗 -RBP。
     在实施例 2 所描述的实施方式中， 本发明的方法和组合物有利于治疗和 / 或预防 RBP4 相关疾病。RBP4， 低分子量血清蛋白质， 分泌自肝脏和脂肪组织， 是 90％血清维生素 的主要载体。RBP4 水平过量引起此类视觉疾病， 如马修伍德综合症、 年龄相关性黄斑变性 (AMD) 和斯塔加特病 (Stargardt’ s disease)。而且， 还已知血清 RBP4 水平升高利于胰岛 素抵抗和 / 或糖尿病的发生。本发明的一些实施方式提供了非天然 RBP4， 即包含非天然氨 基酸的 RBP4， 可将其给予对象用来治疗和 / 或预防这些疾病， 如刺激针对天然 RBP4 的抗体、 B 细胞或 T 细胞应答。 然而这里也应当理解的是， 在体内产生免疫应答的个体和 / 或给予预 防性处理的个体等并不显示代表疾病状态的血清 RBP4 水平。因此， 应当理解的是本发明的 疫苗、 抗体和 / 或非天然免疫原可给显示或不显示 RBP4 相关疾病的个体。
     本文可用于产生非天然 TNFα 的方法可用于产生非天然 RBP4。非天然 RBP4 可包 含任何本文所述除了翻译后修饰或化学修饰之外的方法掺入 RBP4 的非天然氨基酸。可以 使用任何非天然氨基酸取代任何天然的 RBP4 产生非天然的 RBP4。无需使用结构保守的非天然氨基酸取代天然氨基酸。或者或此外， 可将一个或多个其它非天然氨基酸加入 RBP4 多 肽产生非天然 RBP4。非天然 RBP4 可任意包含与天然 RBP4 基本相似的结构， 因此使针对非 天然 RBP4 产生的中和抗体与天然 RBP4 上对应表位交叉反应的可能性增加。在对象中具有 治疗性和 / 或预防性处理用途的非天然的 RBP4 包括 pNO2Phe43mRBP4 和 pNO2Phe108mRBP4 及 对应的人体构建物。
     给药和制剂
     抗体和 / 或免疫原制剂
     为了产生或增强针对靶标部分的免疫应答， 如 TNFα 或本文所述任何其它数种可 能的靶标， 本发明的治疗方法可使用针对免疫原的抗体， 所述免疫原是如包含一个或多个 非天然氨基酸的靶标部分的衍生物， 和 / 或使用免疫原本身， 如非天然 TNFα。通常此类抗 体和 / 或免疫原与生理可接受的佐剂、 赋形剂和 / 或稳定剂组合出现， 该组合在所用剂量下 对于接受者 ( 如对象 ) 是无毒的。然而应当理解的本发明无需限制抗体和 / 或免疫原制备 物的具体制剂。
     抗体和 / 或免疫原 ( 即包含一个或多个非天然氨基酸的靶标部分的衍生物 ) 的制 剂包含生理可接受的佐剂、 赋形剂和 / 或稳定剂。本领域已知的赋形剂包括例如蔬菜和动 物油和脂肪。稳定剂、 润湿和乳化剂、 各种渗透压的盐， 维持所需 pH 的缓冲液和 / 或皮肤穿 透增强剂可用作各种制剂种的辅料 ( 即赋形剂 )。已知制备各种常规给药形式的方法并为 本领域熟练技术人员所了解， 例如参见 《雷鸣顿 ： 药学科学实践》 (Remington ： The Science and Practice of Pharmacy)( 第 21 版， 利平科特威廉斯 & 威尔金斯出版公司 )(Lippincott Williams & Wilkins)， 2005)。制剂包括种或多种佐剂， 如明矾、 弗氏完全佐剂 (FCA)、 弗氏 不完全佐剂 (FIA)、 脂多糖 (LPS)、 角鲨烯， 病毒颗粒、 MSP1、 QS21 等。而且， 制剂中还包括免 疫原与载体融合， 所述载体如多肽载体、 糖载体 ( 如单糖如甘露糖的一个或多个单位， 粘蛋 白的一个或多个单位等 )、 钥孔血蓝素 (KLH)、 卵清蛋白、 鸡卵清蛋白、 破伤风毒素或白喉毒 素等。本领域熟练技术人员熟知多种佐剂、 载体、 赋形剂、 稳定剂等， 可任意用于本发明。
     而且， 抗体和 / 或免疫原制剂中常用赋形剂的例子包括缓冲液 ( 如磷酸缓冲液， 柠 檬酸缓冲液和其它有机酸缓冲液 )， 抗氧化剂 ( 如抗坏血酸 )， 低分子量 ( 小于约 10 鬲残 基 ) 多肽， 其它蛋白质 ( 如血清清蛋白、 明胶和免疫球蛋白 )， 亲水性聚合物 ( 如聚乙烯吡 咯烷酮 )， 氨基酸 ( 如甘氨酸、 谷胺酰胺、 天冬酰胺、 精氨酸， 和赖氨酸 )， 单糖， 二糖和其它糖 ( 包括葡萄糖、 甘露糖和糊精 )， 螯合剂 ( 如乙二胺四乙酸 [EDTA])， 糖醇 ( 如甘露醇和山梨 TM 糖醇 )， 成盐计数离子 ( 如钠 ) 和 / 或阴离子表面活性剂 ( 如吐温 ， PluronicsTM 和 PEG)。
     应当理解的是所用具体佐剂、 赋形剂稳定剂和制剂有所不同， 取决于制剂是否包 含本文抗体或非天然免疫原， 具体给药途径， 所用其它药物， 和所用剂量等。例如， 在静脉 内、 肌肉内或皮下给药中， 可将抗体或免疫原掺入药学上可接受的注射赋形剂中。通常赋 形剂如无菌水， 水性盐溶液， 水性缓冲盐溶液， 水性右旋糖溶液， 水性甘油溶液， 乙醇或其组 合。根据本领域确立的用于抗体或抗原性蛋白质给药的方案保证此类溶液制备物的无菌 性、 合适 pH、 等渗和稳定性。 通常， 赋形剂的选择尽量减少致敏性和其它不需要的效应， 以适 合具体的给药途径， 如皮下、 肌肉内等。
     在一些实施方式中， 可制备口服用制剂， 如掺入食物或饮料， 制剂成为可咀嚼或可 吞咽的片剂或胶囊等。因此此类制剂可迅速被血流摄取并分布于身体各个组分。一般口服给药的赋形剂药学级的乳糖、 甘露醇、 淀粉、 甲基纤维素、 硬脂酸镁、 糖精钠、 滑石粉、 纤维 素、 葡萄糖、 明胶、 蔗糖、 碳酸镁等。当组合物以固体制备物的形式用于口服给药， 制备物可 以是片剂、 颗粒、 粉末、 胶囊等。
     在一些实施方式中， 本发明使用缓释药学制剂递送抗体和 / 或非天然免疫原。示 范性缓释制剂包括固体疏水性聚合物的半透性基质， 本发明的抗体和 / 或非天然免疫原与 其相连或封装其中。合适聚合物的例子包括聚酯， 水凝胶， 聚乳酸， L- 谷氨酸和 T- 乙基 -L 型谷氨酸共聚物， 非降解乙烯， 醋酸乙烯， 可降解乳酸乙酯共聚物和聚 D-(-)-3- 羟丁酸。此 类基质可以是有形物质的形式， 如胶片或微胶囊。
     在本文的各种方法中， 免疫原如任何非天然 TNFα 或任何其它本文所述免疫原或 抗与靶标部分交叉反应的免疫原抗体也可以制备为透皮给药的制剂。对于透皮给药， 可将 抗体和 / 或非天然免疫原掺入亲脂性载体并制剂为外用乳膏剂或油膏剂粘性贴剂。已知 制备各种常规给药形式的方法并为本领域熟练技术人员所了解， 例如参见 《雷鸣顿 ： 药学科 学实践》 (Remington ： The Science and Practice of Pharmacy)( 第 21 版， 利平科特威廉 斯 & 威尔金斯出版公司 )(Lippincott Williams & Wilkins)， 2005)。因此， 缓释胶囊可包 含脂质体包含的活性药物。脂质体是由各种类型的脂、 磷脂和 / 或表面活性剂组成的囊泡。 这些组分一般以双层组成排列， 与生物膜的脂排列类似。包含抗体 / 非天然免疫原的脂质 体可由任何已知方法进行制备， 如 Epstein 等 (1985)， PNAS USA 82 ： 3688-92， 以及 Hwang 等， (1980)PNAS USA， 77 ： 4030-34。可通过反相蒸发方法， 利用包含如磷脂酰胆碱、 胆固醇 和 PEG- 衍生的磷脂酰乙醇胺 (PEG-PE) 的液体制剂产生有用的脂质体。需要的话， 可将脂 质体挤压通过规定孔径得到特定直径的脂质体。
     在另外的实施方式中， 如通篇描述的本发明抗体和 / 或非天然免疫原可制备为粘 膜给药的制剂。粘膜给药包括如下途径 ： 口腔、 气管、 吸入、 鼻、 咽、 直肠、 舌下、 阴道等。通过 粘膜给药， 抗体和 / 或非天然免疫原可制剂为乳液、 口胶、 含片、 喷雾、 片剂等。通过粉末或 喷雾制剂进行鼻内给药。直肠和阴道给药的制剂包括乳膏剂、 洗剂， 灌肠剂或栓剂等。
     在一些实施方式中， 将抗体和 / 或非天然免疫原掺入适于角膜应用的溶液或悬液 如液滴或喷雾， 制备适合角膜给药的制剂。
     本文所用药学制剂还包括吸附于可种植膜如硅橡胶膜上的抗体和 / 或免疫原， 如 国际公开号 WO 91/04014 所述。
     本发明所用药学制剂以标准形式存储， 包括水性溶液或冻干块。通常此类制剂给 予对象时是无菌的。通过无菌滤膜易于使水性溶液无菌。如果制剂以冻干状态储存， 制剂 可在冻干前或后过滤并重配。
     抗体和 / 或非天然免疫原给药
     如本发明所述， 本发明关注通过给予对抗非天然靶标部分 ( 非天然免疫原 ) 的与 靶标部分交叉反应的抗体和 / 或通过给予非天然靶标部分本身， 在对象中产生或增强针对 靶标部分如自身部分如 TNFα 的免疫应答的组合物和方法。此类靶标部分包括例如下文实 施例中所述任何非天然 TNFα， 以及多种其它分子， 如本文所述的。 通常， 单独或与其它处理 或药物联合给予 ( 如共同给药 ) 具体的制剂以治疗性和 / 或预防性处理一种或多种医学症 状 / 疾病状态。应当理解的是， 根据是否给予针对非天然免疫原的抗体， 是否给予非天然免 疫原， 所给予的抗体和 / 或非天然免疫原的具体制剂等， 给药 / 治疗方案有所不同。因此，在一些实施方式中， 给予本发明的抗体与给予本发明的非天然免疫原是不同的 ( 如剂量、 时效等 )。 应当理解的是本文关于具体制剂和 / 或给药方案的叙述不应视作对本文的限制。
     本领域熟练技术人员熟悉多种医学 / 生理学 / 心理学测试和测量， 有助于选择接 受本发明组合物给药的对象和 / 或进行本发明方法操作的对象。例如检测病毒或细菌感染 等 ( 如 HIV 感染 ) 是本领域技术人员所熟知并广泛实践的。相似的， 多种诊断性测试 ( 如 基于症状和 / 或具体感染物的出现等 ) 可用于其它医学失调， 如癌症、 自身免疫病 ( 如 SLE) 等。可使用这类测定帮助选择本文中非天然免疫原和 / 或针对非天然免疫原的抗体的给予 对象。而且， 在一些情况下， 基于家族史和环境暴露等任意选择对象。例如， 基于家族史和 家族易患疾病状态 ( 如阿耳茨海默病， 乳腺癌等 ) 选择对象。同样， 基于感染物或其它疾病 诱因的暴露或潜在 / 暴露风险任意选择对象 ( 如性工作者对 HIV 的暴露或可能暴露， 健康 护理工作者对肝炎的暴露或可能暴露， 工人对二氧化硅化合物的暴露可能导致二氧化硅诱 导的肺纤维化等 )。本领域技术人员熟悉其它例子。
     抗体给药
     本发明的抗体具有治疗性和 / 或预防性用途。因此， 在各种实施方式中， 可将其用 于如产生或增强针对一种或多种特定靶标部分的免疫应答。因此， 本发明提供了使用本发 明的抗体治疗一种或多种与该靶标相关或相联系的疾病状态 ( 如癌症、 自身免疫病症、 病 原性感染等 )。如通篇所述， 本发明的抗体可用于治疗和 / 或预防多种疾病和 / 或失调。例 如， 疾病或失调诸如内毒素休克、 脑疟疾、 自身免疫病、 多器官功能衰竭、 多发性硬化症、 心 脏功能障碍、 动脉粥样硬化、 缺血再灌注损伤、 胰岛素抵抗、 类风湿关节炎、 克罗恩病、 炎性 肠病、 恶病质、 感染性休克、 艾滋病、 移植物抗宿主病、 杀菌肉芽肿、 成人呼吸窘迫综合症、 二 氧化硅致肺纤维化， 以及多种其它疾病， 可应用本发明进行治疗。如上所述， 本发明的抗体 对于非天然免疫原 ( 非天然疾病相关靶标部分， 如非天然 TNFα) 具有特异性， 但是与不包 含天然氨基酸的对应靶标部分 ( 如天然 TNFα) 交叉反应。应当理解的是， 本发明的各种包 含抗体给药方法可任意与其它治疗性 / 预防性处理联用 ( 如化疗、 抗生素和 / 或抗病毒治 疗、 手术等 )。
     本发明的抗体可通过注射 ( 如静脉内、 腹膜内、 皮下或肌肉内注射 ) 或其它方法如 输注给予对象。可通过肿瘤内， 肿瘤周围， 损伤内或损伤周围的途径给予抗体， 因而发挥局 部以及全身性效应。
     可根据经验确定给予本发明抗体的有效剂量、 时效、 方案等。 本领域技术人员熟悉 用抗体治疗多种医学病症的定制方法。在对象中关于抗体治疗的参数 ( 如剂量、 时效等 ) 可不同， 取决于例如接受抗体的个体 ( 如对象物种、 疾病状态、 总体身体状况等 )， 给药途 径， 所用抗体具体类型以及给药处理是预防性或治疗性等。文献报道了指定抗体治疗方案 的详细指导原则， 如 《单克隆抗体手册》 (Handbook of Monoclonal Antibodies)， Ferrone 等编， 诺格出版社， 帕尔克里奇， 新泽西州 (Noges Publications)(Park Ridge， N.J.， ) (1985) ； 诊断和治疗抗体 ： 技术机理和临床数据 (Antibodies in Diagnosis and Therapy ： Technologies Mechanisms and Clinical Data)， CRC， 1999。
     非天然免疫原给药
     在其它实施方式中， 本发明非天然免疫原 ( 即不含一个或多个非天然氨基酸的靶 标部分的版本， 包括但不限于 ： 下文所述非天然 TNFα 或 RBP4) 可给予对象以进行预防性和/ 或治疗性处理。如本文详述， 给予该非天然免疫原在对象中产生免疫应答， 对抗非天然免 疫原的抗体应答。 而且， 然而， 在对象中产生的对抗天然免疫原的抗体优选与在对象体内或 能够在对象体内的靶标部分的天然版本 ( 即病理感染、 癌症。自身免疫病症等引起的疾病 相关部分， 但不包含非天然氨基酸 ) 交叉反应 ( 与非天然免疫原相对应。
     在本文方法中， 非天然免疫原， 如非天然 TNFα 或任何本文所列举的其它多种可 能靶标， 可以药物组合物给药的通常接受的任何方法进行给药。本领域熟练技术人员对于 此类给药途径和递送方案非常熟悉。例如， 非天然免疫原给药途径包括但不限于 ： 口服、 脑 内、 鞘内、 腹膜内、 肌肉内、 静脉内、 皮下、 透皮、 粘膜 ( 如栓剂或鼻内或穿颊给药 ) 或角膜给 药等。 因此， 取决于给药途径， 可以多种剂型提供非天然免疫原， 例如片剂、 胶囊、 粉末、 控释 制剂、 悬浮剂、 乳剂、 栓剂、 乳膏、 软膏、 洗剂或气溶胶。参见上文。具体实施方式使用适于剂 量精确的简单给药形式。
     递送最多包含整天剂量， 或者以能有效产生至少平均每日剂量的量延长非天然免 疫原递送时间， 如 3-10 天。
     当对象中的抗体应答 ( 通常针对不包含非天然氨基酸的对应的天然靶标部分 ) 较 弱或比需要的低， 可再给予非天然免疫原 ( 如直到所需抗体滴度充分升高 )。而且， 使用非 天然免疫原免疫之后， 可从对象中取血清样品检测所需抗体的产生。
     抗体和 / 或非天然免疫原和其它组分的共同给药
     需要的话可将本发明的抗体和 / 或非天然免疫原与一种或多种其它药物和治疗 联合使用。可将抗体 / 非天然免疫原与其它药物在相同制剂中进行给药， 或分别给予 ( 如 根据不同方案， 不同条件在不同时间， 不同制剂进行给药 )。而且， 在各种实施方式中， 多种 抗体类型和 / 或多种非天然免疫原可任意与其它药物 ( 治疗 ) 同时或顺序给予对象。
     本发明的抗体和 / 或非天然免疫原也可与各种治疗如手术、 放射治疗等同时或顺 序给予。
     可与本发明的抗体和 / 或非天然免疫原任意共同给予的其它药物 / 治疗与本发明 的抗体 / 非天然免疫原所治疗的医学状况的具体方面相同 ( 如降低对象体内的具体靶标部 分 ) 或可治疗对象体内其它或相关 ( 或者甚至不相关 ) 医学状况。因此， 共同给予的药物 / 治疗可治疗潜在医学状况 ( 疾病状态 ) 的其它方面。例如， 在各种治疗中， 本发明的抗体和 / 或非天然免疫原可任意与任何多种常用治疗联用， 如治疗发烧、 关节痛和炎症等所用阿司 TM TM 匹林， 水杨酸， 布洛芬， 萘普生， 舒林酸 ( 如奇诺力 Clinoril )， 奥沙普秦和托美丁。在一 些实施方式中， 抗疟药如羟基氯喹、 氯喹和阿的平可治疗其它病症 ( 如 SLE) 相关的疟疾或 各种皮肤异常。皮质类固醇， 通常是氯泼尼松， 可治疗器官炎症等。一些雄激素化合物， 如 TM 达那唑 ( 如 Danocrine ) 可用于控制免疫血小板减少和严重溶血性贫血。
     而且， 本发明的抗体 / 非天然免疫原还可与有效治疗第二种病症的药物联用， 所 述第二种病症由潜在医学状况引起， 或甚至因为对于潜在医学状况的治疗引起。 例如， 在一 些实施方式中， 本发明的治疗可与降钙素联用， 有助于治疗各种附属病症引起的骨密度丢 失， 所述附属病症可能因在方案种使用氯泼尼松、 甲氨蝶呤、 免疫抑制剂、 抗炎药等引起。
     抗体和 / 或非天然免疫原剂量的时效和调整
     如上所述， 在对象中达到所需效果的抗体 / 非天然免疫原的剂量范围和给药速率 ( 因此， 任意对于医学状况 / 疾病状态的有效治疗 ) 可根据标准工业实践进行。 这些范围不同， 取决于所需应答是否是对医学状况 ( 如癌症， SLE， 舍格伦综合征， 细菌感染， 病毒感染， 硬皮病， 过敏疾病， HIV/AIDS 等 ) 的预防性、 治疗性或治愈性处理， 症状类型或严重程度， 所 给予的其它药物， 治疗对象的年龄、 性别医疗史或其它个体参数等。在一些实施方式中， 根 据如 ELISA 等测量的靶标部分具体水平的变化确定剂量。为了测定对象中的这类水平， 本 文典型实施方式可用于测量任何一种或多种生物学组织中把靶标部分的水平， 外周血、 血 清、 血浆、 尿、 阴道液、 精液、 唾液、 腹膜液、 淋巴液、 水性或玻璃体液、 眼泪、 肺积水或浆膜液。
     本领域熟练技术人员熟悉在各种对象中达到所需效果的治疗方案的个体定制。 因 此， 在许多实施方式中， 尽管具体抗体和 / 或非天然免疫原剂量用作起始点或靶标水平， 但 基于接受治疗对象的具体因素可任意调整该剂量。例如， 如果没有到达所需靶标部分水平 可增加剂量。此外， 如果 / 当达到所需水平， 可降低剂量找到稳定能达到所需水平的最低水 平.
     基于所治疗的潜在医学状况的症状调整抗体 / 非天然免疫原的剂量。例如， 如果 对对象的具体医学状况进行治疗， 具体状况的症状可任意作为剂量的指导或指示 ( 量和时 效 )。因此， 在一些实施方式中， 对状况严重性的评价， 如症状发作间隔的测定， 可作为治疗 过程的间接测量， 因此可相应定制给药。本领域技术人员熟悉其它可用于监测医学状况的 症状的测试 / 诊断尺度。
     可给予抗体和 / 或非天然免疫原的对象
     多种动物受益于本发明提供的疫苗、 治疗性处理和 / 或预防性处理。这些动物包 括但不限于 ： 家畜， 如牛、 猪、 山羊、 绵羊、 鸡和 / 或其它一般农场动物。一般的家养宠物， 如 猫、 狗、 鹦鹉、 鹦鹉， 也受益于给予对抗非天然免疫原的交叉抗体和 / 或抗原本身。
     关于生物医学测试和动物模型和兽医治疗中所用动物对象的更多细节的阐述 参见如 Ng， Chow 和 Ogden 编 《在生物医学研究中使用动物 ： 研究者入门》 (Using Animal Models in Biomedical Research ： A Primer for the Investigator)， 第一版， 新加坡， 世 界科学出版公司， 2008(Singapore ： World Scientific Publishing Company， 2008) ； Conn 编 《生物医学研究模型原始资料》 (Sourcebook of Models for Biomedical Research.) 斯普林格出版公司， 新泽西州托托瓦 (Totowa， NJ ： Springer)， 2008 ； Woodhead 编， 《生物 医学研究中的非哺乳动物 ( 第一卷 )》 (Nonmammalian Animal Models for Biomedical Research(Vol 1))， 纽约 ： 科学出版社， 1990(New York ： Academic Press， 1990)。 参见 Adams 等， 《兽医药理学和治疗， 第八版》 (Veterinary Pharmacology and Therapeutics.Eighth Edition)， 美国 ： 韦理 - 布莱克维尔 (USA ： Wiley-Blackwell)， 2001 ； Kahn 和 Line 编 . 《默克 兽医手册 ： 第九版》 (Merck Veterinary Manual.Ninth Edition)， 美国 ： 默克 (USA ： Merck)， 2005 ； 及其所引文献。
     本发明提供的抗体和 / 或非天然免疫原不仅可用于治疗对象中的疾病状态如人， 还可以进行治疗效果测试， 以及代谢测试， 毒理学测试和具体测试确定抗体和 / 或非天然 免疫原对生殖功能或胚胎毒性的影响， 或确定其致癌潜能。进行这些观察性研究意味着本 发明的抗体和 / 或非天然免疫原克给予多种动物对象。本领域熟练技术人员熟悉多种医学 测试和测量， 有助于选择接受本发明组合物给药的动物对象和 / 或进行本发明方法操作的 对象。 此类动物对象包括但不限于 ： 如哺乳动物， 如山羊、 绵羊、 骆驼、 牛、 猪、 兔、 马、 仓鼠、 非 人灵长类 ( 猴， 包括猕猴、 狒狒、 旧大陆猴和黑猩猩 )、 豚鼠、 大鼠、 小鼠和 / 或猫。 鸟类， 如家禽 ( 鸡、 火鸡 )、 鸡尾鹦鹉、 鹦鹉和笼中鸟和 / 或鸟舍鸟， 以及鸟类胚胎， 也可用于本发明抗体 和 / 或非天然免疫原的研究和开发， 生产， 质控或安全性测试。
     鱼类， 如斑马鱼、 新月鱼和和剑尾鱼 ； 两栖类， 包括如青蛙、 蝾螈和爬行类 ( 蛇， 蜥 蜴和龟 ) 也可以用在各种各样的测试确定本文所述组合物和 / 或其给药方法的安全性， 有 效剂量和 / 或毒理学。参见 Barry 等 (2002)， 《爬行动物、 两栖动物、 鱼类和头足类生物医 学研究的应用的信息资源》 (Information Resources for Reptiles， Amphibians， Fish， and Cephalopods Used in Biomedical Research)， 美国农业部国家农业图书馆动物福利 信息中心 (United States Department of Agriculture National Agricultural Library Animal Welfare Information Center)， 及其所引文献。
     试剂盒及制造物
     在一些实施方式中， 本发明提供包含用于制造本发明所述方法和组合物的试剂盒 或物品。此类试剂盒可任意包含一个或多个容器、 标签和说明书， 以及用于构建抗体和 / 或 非天然免疫原和 / 或真实抗体和 / 或非天然免疫原 ( 如非天然 TNFα 或本文所述其它多种 例子 ) 的组分。
     试剂盒还可任意包含一种或多种抗体 ( 即， 对抗非天然免疫原的抗体， 所述抗体 交叉反应对抗对象体内的天然把表部分 ) 和 / 或一种或多种非天然免疫原以及任意其他组 分 ( 如各种抗生素， 各种抗真菌药物等 )。此类非天然免疫原包括但不限于 ： 任意一种或多 种本发明提供的非天然 TNFα。试剂盒还任意包括试管或其它容器 ( 如， 玻璃、 塑料、 尼龙、 棉、 聚酯、 金属等容器 ) 用于储存组分， 或者在其中混合 / 制备组分， 以及一种或多种进行对 象 ( 如， 需要治疗的人等 ) 给药的设备。在一些实施方式中， 进行对象给予组分的设备包括 储存和 / 或混合 / 制备组分的容器。
     试剂盒还任意包含除本发明抗体 / 非天然免疫原组分外的其他组分， 如缓冲液、 稀释剂、 滤器、 敷料、 绷带、 喷头、 纱布、 屏障、 半渗透屏障、 亚舍板、 针头和注射器等。
     在许多实施方式中， 试剂盒包含涉及使用试剂盒治疗对象一种或多种医学病症 / 疾病状态的说明书 ( 如书面指导 )。在一些实施方式中， 试剂盒包含用户联系进行指导的 URL 地址或电话号码等。试剂盒可以是单位剂量， 散装包 ( 多次给药包装 ) 或亚单位剂量。
     实施例
     提供以下实施例， 以说明而非限制要求保护本发明。 应理解， 本文所述的实施例和 实施方式只是为了说明， 本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变， 它们包括在 本申请的构思和范围以及所附权利要求书的范围内。
     实施例 1 ： 用遗传编码的非天然氨基酸打破免疫耐受
     选择性诱导针对自身蛋白质的强烈免疫应答， 或增加外来抗原中特定表位的免疫 原性对于癌症、 蛋白质错误折叠和感染性疾病疫苗的生产具有显著影响。本文中我们显示 了将免疫原性非天然氨基酸掺入感兴趣的蛋白质产生交叉反应 WT 蛋白质的高滴度抗体。 具体来说， 鼠肿瘤坏死因子 -α(mTNFα) 单一酪氨酸残基 (Tyr86) 突变为对 - 硝基苯丙氨 酸 (pNO2Phe) 在小鼠中诱导高滴度抗体应答， 然而对于 Tyr86 → Phe 突变没有显著抗体应 答。针对 pNO2Phe 产生的抗体对天然 mTNFα 具有高度交叉反应性， 并且保护小鼠对抗脂多 糖 (LPS)- 引起的死亡。该方法提供了诱导针对自身和外来的特定表位的抗体应答， 并引起 中和性免疫应答。现在疫苗学的一大挑战是产生有效方法选择性诱导针对自身蛋白质的强烈免 疫应答， 或增强外来抗原中特定表位的免疫原性， 所述表位诱导产生中和抗体但不具免 疫优势。已有多种策略应对该挑战， 包括开发改良佐剂， 将外源辅助肽引入嵌合抗原， 以 及使用 DNA 疫苗 (Dalum 等 (1999)， 《针对 TNFα 免疫诱导的治疗性抗体》 (Therapeutic antibodies elicited by immunization against TNF-alpha)Nat Biotechnol 17 ： 666-669 ； Makela 等 (2002)， 《偶 联 疫 苗 的 进 化》 (Evolution of conjugate vaccines) Expert Rev Vaccines 1 ： 399-410 ； Restifo 等 (1996)， 《新疫苗 ： 构建诱导抗肿瘤免疫的病 毒》 (The new vaccines ： building viruses that elicit anti-tumor immunity)Curr Opin Immunol， 8： 658-663 ； Baldridge 等， 《疫苗佐剂 ： 免疫学及临床实践》 (Vaccine Adjuvants ： Immunological and Clinical Principles)C.J.Hackett， Harn， D.A.， J 编 ( 修马那出版社， 新泽西州托托瓦 )(Humana Press， Totowa， NJ， 2006)， 235-255)。有趣的是， 将近 50 年前， Weigle(Weigle(1965)《注射异源或改变的同源甲状腺球蛋白后诱导兔的自身免疫》 (The induction of autoimmunity on rabbits following inj ections of heterologous or altered homologous thyroglobulin)J Exp Med 121 ： 289-308) 显示用重氮衍生物非特异 性标记的兔甲状腺球蛋白免疫兔后产生对天然甲状腺球蛋白交叉反应的抗体。 尽管这些实 验产生了高异源性抗原， 一种解释是化学修饰导致产生诱导产生高滴度交叉反应抗体的抗 原表位。相似的， 有报道 T 细胞耐受可被自反应性 B 细胞打破， 用与自身抗原有一个或多个 氨基酸不同的交叉反应外来抗原进行免疫易于诱导 T 细胞耐受 (Mamula 等 (1992)， 用外来 和自身共同抗原打破 T 细胞耐受 ： 细胞色素 C 自身免疫 B 和 T 细胞表位的研究 (Breaking T cell tolerance with foreign and self co-immunogens.A study of autoimmune B and T cell epitopes of cytochrome c)J Immunol 149 ： 789-795)。
     与相对无选择性的修饰蛋白质的化学方法相比， 现在通过遗传学编码非天然氨 基酸的方法可能使蛋白质产生高度精确的 “化学突变” 。已有超过 50 种非天然氨基酸在 细菌、 酵母或哺乳动物细胞中编码， 包括金属结合和翻译后修饰氨基酸， 荧光和氧化还原 活性氨基酸， 以及光反应和化学反应氨基酸 (Wang 等 (2001)， 《扩展大肠杆菌的遗传编码》 (Expanding the genetic code of Escherichia coli)Science 292 ： 498-500 ； Chin 等 (2003)， 《扩展的真核遗传编码》 (An expanded eukaryotic genetic code)Science 301 ： 964-967 ； Xie 和 Schultz(2006) 《蛋白质化学工具箱 - 扩展遗传编码》 (A chemical toolkit for proteins-an expanded genetic code.)Nat Rev Mol Cell Biol 7 ： 775-782)。具体 说， 将苯丙氨酸的衍生物对 - 硝基苯丙氨酸 (pNO2Phe， 图 1A) 搀入细菌蛋白质中对应琥珀 无义密码子， 用作光谱距离探针时具有高保真度和良好的效率 (Tsao 等 (2006)， 《在大肠杆 菌中将距离探针遗传学掺入蛋白质》 (The genetic incorporation of a distance probe into proteins in Escherichia coli)J Am Chem Soc 128 ： 。 4572-4573)。 历史上曾使用 硝基芳基作为高免疫原性半抗原 ( 参见 Keinan 编， 《催化抗体》 Catalytic Antibodies(WV 公司， 魏恩海姆， 2005))， 可能是由于缺电子的 π 系统趋于与对抗体结合位点常见的 Tyr 和 Trp 侧链相互作用。由于其结构相似性， 我们推测包含 Phe → pNO2Phe 或 Tyr → pNO2Phe 突 变的蛋白质可产生与天然蛋白质交叉反应的强烈的免疫应答。因此， 我们显示用鼠肿瘤坏 86 死因子 -α(mTNFα)Tyr → pNO2Phe 突变子免疫小鼠， 产生对 WT mTNFα 响应的高滴度抗 体， 因此可有效保护小鼠对抗脂多糖 (LPS) 刺激。选择 mTNFα 作为本研究的目标蛋白质， 因为 ： (i) 它是一个已经经过深入研究 的细胞因子， 涉及感染、 炎症和自身免疫现象的调节 (Vassalli(1992)， 《肿瘤坏死因子 的病理生理学》 (The Pathophysiology of Tumor Necrosis Factors)Ann Rev Immunol 10 ： 411-452) ； (ii) 该蛋白的生物学特征已进行广泛研究， 包括其表达、 结构、 功能和信 号 转 导 机 制 (Vassalli(1992)， 《肿 瘤 坏 死 因 子 的 病 理 生 理 学》 (The Pathophysiology of Tumor Necrosis Factors)Ann Rev Immunol 10 ： 411-452) ； Baeyens 等 (1999)， 《1.4A 分 辨 下 小 鼠 肿 瘤 坏 死 因 子 ： 对 其 选 择 性 和 三 聚 化 的 调 节》 (The structure of mouse tumour-necrosis factor at 1.4 A resolution ： towards modulation of its selectivity and trimerization.)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55 ： 772-778 ； Pennica 等 (1985)， 《在大肠杆菌中克隆并表达小鼠肿瘤坏死因子的 cDNA》 (Cloning and expression in Escherichia coli of the cDNA for murine tumor necrosis factor) Proc Natl Acad Sci USA 82 ： 6060-6064 ； Pasparakis 等 (1996)， 《TNFα 缺陷小鼠中的免 疫和炎症应答 ： 原代 B 细胞滤泡、 滤泡树突细胞网络和生发中心的形成以及体液免疫应答 成熟中非常需要 TNFα》 (Immune and inflammatory responses in TNF alpha-deficient mice ： a critical requirement for TNF alpha in the formation of primary B cell follicles， follicular dendritic cell networks and germinal centers， and in the maturation of the humoral immune response)， J Exp Med 184 ： 1397-1411 ； Baeyens 等 (1997)《小鼠肿瘤坏死因子的结晶和初步 X 射线研究》 (Crystallization and preliminary X-ray studies of mouse tumor necrosis factor)， Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53 ： 329-330 ； B.B.Aggarwal， Vileck， J.， 编， 《肿 瘤 坏 死 因 子 ： 结 构、 功能和作用机理》 (Tumor Necrosis Factors ： Structure， Function and Mechanism of Action)， (Dekker， 纽约， 1992)， 第 1-587 页 ) ； 和 (iii)mTNFα 敲除小鼠能够存活并且没有 明显的表型异常 (Pasparakis 等 (1996)《TNFα 缺陷小鼠中的免疫和炎症应答 ： 原代 B 细 胞滤泡、 滤泡树突细胞网络和生发中心的形成以及体液免疫应答成熟中非常需要 TNFα》 ， J Exp Med 184 ： 1397-1411)， 这提示小鼠在产生针对 TNFα 的中和免疫应答的条件下可以存 活。此外， 抗 -TNFα 抗体 (Knight 等 (1993) 《小鼠 - 人嵌合抗 TNF 抗体的构建和初步表征》 (Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody)， Mol Immunol 30 ： 1443-1453 ； Present 等 (1999)《用于治疗克罗恩氏病患者 的瘘的英夫利昔单抗》 (Infliximab for the Treatment of Fistulas in Patients with Crohn′ s Disease)New Engl J Med340 ： 1398-1405) 和可溶性嵌合 TNFα， 受体 (Peppel 等 (1991)《作为 TNF 活性的二价拮抗剂的肿瘤坏死因子 (TNF) 受体 -IgG 重链嵌合蛋白》 (A tumor necrosis factor(TNF)receptor-IgG heavy chain chimeric protein as a bivalent antagonist of TNF activity)J Exp Med 174 ： 1483-1489 ； Williams 等 (1995) 《用 TNF 受体 -IgG 融合蛋白和联合抗 -CD4 成功治疗胶原诱导的关节炎》 (Successful therapy of collagen-induced arthritis with TNF receptor-IgG fusion protein and combination with anti-CD4)， Immunology 84 ： 433-439) 广泛用于治疗自身免疫病， 正在 探索使用多种方法开发临床上使用的 TNFα- 特异性疫苗。后者包括含有外来免疫优势 T- 辅助表位的重组 TNFα 分子、 与噬菌体 Qβ 的病毒样颗粒形成的 TNFα 融合蛋白和钥孔血 蓝素 -TNFα 异源复合物 (Dalum 等 (1999) 《用 TNF-α 免疫产生的治疗抗体》 (Therapeuticantibodies elicited by immunization against TNF-alpha)， Nat Biotechnol 17 ： 666-669， Spohn 等 (2007) 《选择性靶向可溶性 TNFα 的基于病毒样颗粒的疫苗能预防关节 炎且不诱导潜伏结核病的再活化》 (A Virus-Like Particle-Based Vaccine Selectively Targeting Soluble TNFα Protects from Arthritis without Inducing Reactivation of Latent Tuberculosis)， J Immunol 178 ： 7450-7457 ； Le Buanec 等 《TNFα， kinoid 疫 苗接种诱导的 TNFα 中和抗体保护小鼠免遭自体 TNFα 驱动的慢性和急性炎症》 (TNFα， kinoid vaccination-induced neutralizing antibodies to TNFα protect mice from autologous TNFα-driven chronic and acute inflammation)， Proc Natl Acad Sci USA 103 ： 19442-19447)。
     根 据 三 聚 体 mTNFα 的 X- 射 线 晶 体 结 构 (Baeyens 等 (1997)《小 鼠 肿 瘤 坏 死 因子的结晶和初步 X 射线研究》 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53 ： 329-330 ； Baeyens 等 (1999)《小 鼠 肿 瘤 坏 死 因 子 在 1.4A 分 辨 率 下 的 结 构 ： 选择性和三聚化的 调 节》 (The structure of mouse tumour-necrosis factor at 1.4 A resolution ： towards modulation of its selectivity and trimerization)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55 ： 772-778)， 单个 Tyr86 → pNO2Phe 突变的 mTNFα(pNO2Phe86mTNFα) 已确定 选作我们进行初步研究的免疫原 ( 图 1B)。Tyr86 在不同哺乳动物 TNF 中高度保守， 该位点的突变对蛋白质折叠和三聚体形成无影响， 但导致细胞毒性显著降低 (Van Ostade 等 (1994)《人肿瘤坏死因子的结构活性研究》 (Structure-activity studies of human tumour necrosis factors)Protein Engineering 7 ： 5-22 ； Loetscher 等 (1993)《仅 对 55-kDa 或 75-kDa TNF 受体有特异性的人肿瘤坏死因子 α(TNFα) 突变体》 (Human tumor necrosis factor alpha (TNF alpha)mutants with exclusive specificity for the 55-kDa or 75-kDa TNF receptors)J Biol Chem 268 ： 26350-7 ； Zhang 等 (1992)《人肿 瘤坏死因子 -α 受体结合位点的定点突变分析和购销关系》 (Site-directed mutational analysis of human tumor necrosis factor-alpha receptor binding site and structure-functional relationship) J Biol Chem 267 ： 24069-75)( 宜用于免疫接种目 的 )。
     在该例子中， 通过遗传方法将非天然氨基酸对 - 硝基苯丙氨酸 (pNO2Phe) 引入鼠 肿瘤坏死因子 -α(mTNFα) 以替代残基 Tyr86。发现用这种含 pNO2Phe 的蛋白质免疫的小鼠 能产生强烈的中和抗体应答， 这种应答能与野生型 mTNFα 发生有效的交叉反应。而且， 发 现这种免疫能有效保护小鼠对抗脂多糖 (LPS) 诱导的死亡。结果表明含有天然产生的蛋白 质中没有的高度免疫原部分独特 NO2 基团的自身蛋白将被免疫系统识别为外来抗原。由于 包含独特 NO2 基团蛋白质和天然蛋白质的结构相似性， 针对修饰蛋白质所引发的抗体与对 应的自身蛋白质交叉反应。 因此该方法提供了打破自身蛋白质免疫耐受和产生疫苗的常规 方法。
     在实验中， 大肠杆菌 XL1-Blue 和 BL21(DE3) 分别用于克隆和表达宿主。载体 pET26b 获自诺瓦基公司 ( 美国威斯康星州麦迪逊 )(Novagen(Madison， WI， USA))。 除非另有 注明， 大肠杆菌菌株生长于含有 1％甘油和 0.3mM 亮氨酸的极限培养基 (GMML 培养基 ) 或 2x YT 培养基中。 限制性酶、 T4 DNA 连接酶、 dNTP 和 Xa 因子蛋白酶获自 NEB( 美国麻省比佛利 ) (Beverly， MA， USA)。IPTG 和用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)4-12％Bis-Tris 凝胶购自英骏公司 (Invitrogen)( 美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 )(Carlsbad， CA， USA)。pNO2-Phe 购自先进化学技术公司 (Advanced ChemTech)( 路易斯维尔， 肯塔基州， 美国 )。 引物购自整合 DNA 技术公司 (Integrated DNA Technologies)( 科尔维尔， 美国衣阿 华州 )。 DNA 聚合酶购自斯查塔基公司 ( 美国加利福尼亚州拉霍亚 )(Stratagene(La Jolla， CA， USA))。抗 -TNFα 抗体购自 R&D 系统公司 (R&D system)( 明尼阿波利斯， 明尼苏达， 美 国 )(Minneapolis， MN， USA)， 重组 mTNFα 获自生物资源公司 (BioSource)( 卡马里奥， 加州， 美国 )(Camarillo， CA， USA)。利用 QIAGEN 质粒纯化试剂盒提取质粒 DNA， 用 QIAquick PCR 或凝胶纯化试剂盒在限制性酶消化后纯化 DNA( 凯杰公司， 瓦伦西亚， 加州， 美国 )(QIAGEN， Valencia， CA， USA)。
     构建 mTNFα 表达载体
     为 了 在 大 肠 杆 菌 中 表 达 mTNFα， 构 建 含 N- 末 端 His6 标 签、 Xa 因 子 切 割 位 点 和 T7-lac 启 动 子 后 mTNFα 基 因 的 质 粒 pET26-mTNFα。 质 粒 构 建 如 下 ： 使用如下 引 物， 通 过 聚 合 酶 链 反 应 (PCR) 从 质 粒 pMuTNFα(ATCC#63169) 中 扩 增 tnfα 基 因 ： 5’ -ATATACATATGCTCAGATCATCTTCTCA AAATTCG 和 5’ -AACAACCTCGAGTTATCACAGAGCAATGACTCC AAAGT AGACC。 用 NdeI 和 XhoI 限制性酶硝化所得 PCR 产物， 并将其连接入 pET26b 载体 ( 诺 瓦基公司 )。然后在重组载体上附加 N- 末端 6 个组氨酸的标签 (His6- 标签 )， 后随 Xa 因 子蛋白酶解位点， 随后紧邻成熟 WT mTNFα 的第一个密码子。通过将质粒 pET26-mTNFα 中 86 11 Tyr ， Lys 或 Asp42 位点的的密码子突变为 TAG 琥珀密码子， 将 pNO2Phe 定点掺入 mTNFα， 使用 QuickChange 诱变试剂盒 ( 斯查塔基公司 ) 产生这些取代。使用相同的试剂盒制备 mTNFα 突变子 Ala86 mTNFα， Phe86mTNFα 和 Phe42 mTNFα。 诺华研究基金基因组研究所 ( 美 国加州圣地亚哥 )(the Genomics Institute of the Novartis Research Foundation(San Diego， CA， USA)) 进行 DNA 序列分析确认所有 mTNFα 构建物的序列。
     在大肠杆菌中表达 pNO2Phe86 mTNFα
     在来源于甲烷球菌 (M.jannaschii) 的正交琥珀抑制子 tRNACUA/ 氨酰 -tRNA 合成 酶对存在的条件下， 表达 pNO2Phe86 mTNFα、 pNO2Phe11 mTNFα 和 pNO2Phe42 mTNFα 突变子， 所述对响应琥珀密码子能特异地将 pNO2Phe( 如图 1A 所示结构 ) 掺入大肠杆菌的蛋白质中 (Tsao 等 (2006)， 《利用遗传学方法将距离探针掺入大肠杆菌的蛋白质中》 (The genetic incorporation of a distance probe into proteins in Escherichia coli)J Am Chem Soc 128 ： 4572-4573)。 在变性或天然条件下用 Ni2+ 亲和色谱纯化突变蛋白质 ( 约 1mg/L， 在 GMML 极限培养基中 )， 然后切割 His6 标签和并用大小排阻色谱进行纯化。 为了表达 pNO2Phe86 mTNFα、 pNO2Phe11 mTNFα 和 pNO2Phe42 mTNFα 突变子， 用 mutNO2PheRS、 mutRNACUA 和各自 突变 mTNFα 基因共同转化大肠杆菌 BL21(DE3) 细胞。 转化细胞在 37℃下含 1mM pNO2Phe 的 GMML 培养基中培养， 并在 OD600nm 达到 0.5 时用 1mM IPTG 诱导。在 37℃连续振荡培养细胞 12-16h， 然后收集。 在 -80℃储存细胞团块直到使用。 通过完全相同的步骤表达 WT mTNFα、 86 42 Phe mTNFα 和 Phe mTNFα。然而， 与 pNO2Phe mTNFα 突变子相比， 在含 pNO2Phe 的富营 养培养基 (2x YT 培养基 ) 中表达这些蛋白质。
     在变性条件下纯化 WT mTNFα 和 pNO2Phe86 mTNFα
     所有的纯化步骤在室温下操作。将细胞团块在冰上融化 15 分钟， 以每克湿重加入 5ml 裂解缓冲液 (100mM NaH2PO4， pH ＝ 8.0， 10mM Tris/HCl， 8M 尿素 )， 重悬细胞糊。将细胞悬液在冰上超声 3 分钟。10,000x g 离心 25 分钟后， 在上清中加入 10ml Ni-NTA His- 结合 树脂 ( 诺瓦基公司， 威斯康星州麦迪逊， 美国 )， 并在旋转摇床上混合 60 分钟。
     将裂解物 - 树脂混合物装载于 5ml 聚亚丙烯柱上 ( 凯杰公司 )， 并用 40ml 洗涤缓 冲液 A(100mM NaH2PO4， pH ＝ 6.3， 10mM Tris/HCl， 8M 尿素 ) 冲洗两次。用 10ml 洗涤缓冲 液 B(100mM NaH2PO4， pH ＝ 5.9， 10mM Tris/HCl， 8M 尿素 ) 冲洗两次后， 用 100mM NaH2PO4， pH ＝ 4.5， 10mM Tris/HCl， 8M 尿素洗脱。用 10K 分子量截留 Amicon Ultra-15 离心滤器设备 ( 密理博， 贝德福德， 麻省， 美国 )(Millipore， Bedford， MA， USA) 浓缩蛋白质混合物， 然后装 载于 Xa 切割缓冲液 (20mM Tris/HCl ； 200mM NaCl ； 1mM EDTA， pH ＝ 7.4) 预平衡的 HiPrepTM 26/10 脱盐柱 (GE 健康护理公司 (GE Healthcare)， 新泽西州皮斯卡塔韦， 美国 ) 上。在加 入 Xa 因子 (5％ w/w) 前， 使用分子量截留 Amicon Ultra-15 离心滤器设备浓缩含有包含体 的浑浊组分。
     室温下 3 天内定量去除 N- 末端 His6- 标签， 用 SDS-PAGE 分析检验。蛋白酶解后， 通过离心从包含体中分离可溶性 Xa 蛋白酶和 His6- 标签肽。然后将蛋白质溶解于～ 1ml 增溶缓冲液 (8M 尿素， 50mM Tris/HCl， pH ＝ 8.0， 10mM DTT) 中， 并注入增溶缓冲液预平衡 的 Superdex 75 10/300GL 柱 (GE 健康护理公司 )。在 AKTA 纯化仪 (GE 健康护理 ) 上以 0.3 毫升 / 分钟 (ml/min) 的流速进行两轮大小排阻色谱。对于折叠， 使用 10K 分子量截留 Slide-A-Lyzer 透析盒 ( 皮尔斯公司， 罗克福德， 伊利诺州美国 )(Pierce， Rockford， IL， USA) 相对复性缓冲液 (240mM NaCl ； 10mM KCl ； 0.5％ Triton X-100 ； 50mM Tris/HCl ； 1mM 86 EDTA， pH ＝ 8.0) 透析蛋白质样品。. 相对磷酸缓冲盐水 (PBS) 对再折叠的 pNO2Phe mTNFα 进行透析。
     在天然环境下纯化 WT 和突变 mTNFα
     天然条件下所有的纯化步骤在 4℃进行。在冰上融化细胞团块 15 分钟， 以每克湿 重加入 5ml 裂解缓冲液 (50mM Tris/HCl， pH ＝ 8.0 ； 150mM NaCl， 10％ (v/v) 甘油 ) 重悬细胞 糊。在加入完全蛋白酶抑制剂混合物 ( 罗氏， 印第安纳波利斯， 印弟安纳州， 美国 )(Roche， Indianapolis， IN， USA) 后， 用 150L 溶酶体 (100mg/mL ； MP 生物医学公司， 欧文， 加州， 美国 ) (MP Biomedicals， Irvine， CA， USA)， 50 L of DNase I(5mg/mL ； 罗氏 )， 5L RNase A(100mg/ mL ； 西格玛 - 奥得里奇公司， 圣路易斯， 密苏里州， 美国 )(Sigma-Aldrich， St.Louis， MO， USA)， 盒 125 U benzonase 核酶 ( 诺瓦基公司 )(Novagen) 处理 10mL 细胞悬液。室温下搅 拌细胞悬液 20 分钟， 发生裂解。将预裂解得细胞在液氮中速冻， 然后 37℃水浴融解。重复 冻融一次。在冰上超声 2 分钟完全裂解。
     18,000x g 离心 20 分钟后， 在上清中加入 1ml Ni-NTA His- 结合树脂 ( 诺瓦基 公司 )， 并在旋转摇床上混合 30 分钟。将裂解物 - 树脂混合物装载于 5ml 聚亚丙烯柱 上 (QIAGEN)， 并用 20ml 裂解缓冲液冲洗两次。用 2mL 洗脱缓冲液 (50mM Tris/HCl， pH 8.0 ； 150mM NaCl， 250mM 咪唑， 10 ％ (v/v) 甘油 ) 洗脱蛋白质， 用 10K 分子量截留 Amicon Ultra-15 离心过滤装置 ( 密理博 ) 进行浓缩， 并用 PBS 预平衡的 Superdex 75 10/300GL 柱 ( 流速 0.3ml/min) 进行纯化。用 MALDI-TOF 质谱表征所有蛋白质， 在 Voyager-DE-STR 仪 器上进行 ( 应用生物系统公司， 福斯特城， 加州， 美国 (Applied Biosystems， Foster City， CA)， USA)， 使用芥子酸作为基质， 实验在斯克里普斯研究所质谱中心进行 (Scripps Center for Mass Spectrometry， The Scripps Research Institute)( 加利福尼亚州拉霍亚， 美国 )。所有在天然条件下纯化的 mTNFα 蛋白质 25℃条件下以＞ 10mg/mL 的浓度完全溶解 于 PBS 缓冲液 (pH ＝ 7.5) 中。
     分析 pNO2Phe86mTNFα 的组合物和均一性
     然后通过 SDS-PAGE( 图 1C) 和质谱 ( 图 1D) 分子突变蛋白的组成和均一性。如图 1C 所示， 使用 pNO2Phe 特异性 mutRNACUA/ 氨酰基 -tRNA 合成酶对， 在 1mM pNO2Phe 不存在 86 ( 第 2 道 ) 和存在 ( 第 3 道 ) 的条件下 mTNFαTyr 琥珀突变的表达。用 Ni-NTA 亲和柱纯 化蛋白质样品， 用 SDS-PAGE 和 SimplyBlueTM 染色进行分析。 第 4 道代表野生型 mTNFα， 第1 86 道是分子量标准品。图 1C 的结果显示在变性条件下纯化的 pNO2Phe mTNFα 与 WT mTNFα 在 SDS-PAGE 上具有相似泳动性 ； 当突变基因在缺少 pNO2Phe 的条件下表达， 未观察到全长 mTNFα， 表明 86 位上没有可检测到的内源性氨基酸的掺入。
     通过 MS/MS 测序分析胰蛋白酶解片段， 对突变蛋白均一性组成进行分析 ( 图 1D)。 86 为了制备该步骤的蛋白质样品， 将含有 pNO2Phe mTNFα 的切割胶条切成小片， 并与 25mM NH4HCO3/50％乙腈混合。涡旋 10 分钟后， 弃去上清。该步骤重复两次， 在 Speed Vac 上将胶 块干燥约 20 分钟。 加入 25mM NH4HCO3 中的 25μL 还原蛋白质样品。 反应在 56℃下进行约 1 小时。去除上清后， 将胶块与 25μl 55mM 碘乙酰胺混合。在室温下避光孵育 45 分钟后， 进 行胰蛋白酶胶中消化， 如公开步骤所述 (Rosenfeld 等， (1992) 《一维或二维凝胶电泳后蛋白 质胶中消化用于内部测序分析》 (In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one-or two-dimensional gel electrophoresis)Anal Biochem 203 ： 173-179 ； Hellman 等， (1995)《氨基酸测序内部蛋白质片段微制备 “胶中” 消化步骤的改 良》 (Improvement of an‘In-Gel’ digestion procedure for the micropreparation of internal protein 片段 for 氨基酸 sequencing)Anal Biochem 224 ： 451-455)。用 C18 ZipTip( 密理博 ) 纯化所得肽混合物， 并 Thermo Finnigan LTQ 质谱仪 ( 塞默科技公司， 萨默 塞特， 新泽西州， 美国 )(Thermo Scientific， Somerset， NJ， USA) 上进行 MS/MS 片段化， 使用 纳米喷射源以正离子模式运行， 实验在斯克里普斯研究所质谱中心进行 (Scripps Center for Mass Spectrometry， The Scripps Research Institute)( 加利福尼亚州拉霍亚， 美 国 )。对如上所述制备的 8- 聚胰蛋白酶解片段的 MS/MS 分析与在 86 位残基掺入 pNO2Phe 的模式精确匹配 ( 图 1D， 图 12)。10 聚片段 FAISXQEK 的部分序列， 其中 X 代表 pNO2Phe 可 从图 1D 的注释 b 或 y 离子系列中读出。在图 12 中， 含有 pNO2-Phe 胰蛋白酶片段序列以单 字母代码表示 (X， pNO2-Phe)。显示了观察到的 y 和 b 系列的离子片段。红色标明关键的证 明了 pNO2-Phe 掺入的 y 和 b 离子。所有的质量以单一同位素质量报告。
     用 MALDI-TOF 质谱表征所有蛋白质 ( 图 2、 3， 以及表 1)， 在 Voyager-DE-STR 仪器上 进行 ( 应用生物系统公司， 福斯特城， 加州， 美国 (Applied Biosystems， Foster City， CA)， USA)， 使用芥子酸作为基质， 实验在斯克里普斯研究所质谱中心进行 (Scripps Center for Mass Spectrometry， The Scripps Research Institute)( 加利福尼亚州拉霍亚， 美国 )。 MALDI-TOF 谱 ( 表 1， 图 2) 也显示了与含全长 mTNFα 的 pNO2Phe 的期望分子量 ([M-H]+ ： 17286). 完全匹配的峰 ([M-H]+ ： 17287。这些结果表明选择性将 pNO2Phe 掺入突变 mTNFα。
     表1： mTNFα 变体 MALDI-TOF 质谱分析。
     分析 pNO2Phe86mTNFα 的三级结构
     为 了 确 定 pNO2Phe 突 变 对 于 pNO2Phe86mTNFα、 Phe86mTNFα、 pNO2Phe42mTNFα、 Phe42mTNFα 和 pNO2Phe11mTNFα 三级 / 四级结构的影响， 用快速蛋白质液相色谱分析 WT mTNFα 和突变 mTNFα 样品 ( 表 2)。图 1B 显示了含 Tyr-86、 Asp42m 和 Lys-11 引入物的 mTNFα 三聚体的 X- 射线晶体结构 (PDB ID 代码 2TNF)。 使用 Superdex 75 10/300GL 凝胶渗 入柱 (GE 健康护理 )， 在快速蛋白质液相色谱 (FLPC) 上分析所有蛋白质样品。 在 25℃ PBS 缓 86 冲液中， 以 0.3ml/min 的流速进行大小排阻色谱。 WT mTNFα 和 pNO2Phe mTNFα 在 25℃的
     PBS 缓冲液中以＞ 10mg/ml 的浓度完全溶解。用伯乐 ( 伯乐实验室， 埃库莱斯， 加州， 美国 ) (Bio-Rad Labs， Hercules， CA， USA) 的凝胶渗入分子量标准品对柱子进行校准， 标准品包含 甲状腺球蛋白 (670kDa)、 γ 球蛋白 (158kDa)、 卵清蛋白 (44.0kDa)、 肌红蛋白 (17.0kDa) 和 维生素的 B-12(1.35kDa)。蛋白质洗脱后测量洗脱组分在 280nm 的光吸收。
     WT mTNFα 和 pNO2Phe86mTNFα 均显示相似的保留时间， 对应分子量与其三聚体形 式相匹配。图 4 显示了蛋白质标准品分子量的对数相对在 Superdex 75 10/300GL 凝胶渗 入柱上的保留时间进行作图。计算中忽略甲状腺球蛋白 (670kDa)， 因为其分子量远超过 Superdex 75 10/300GL 柱 (3kDa-70kDa) 的分离范围。 基于图 4 的图确定 pNO2Phe86 mTNFα、 WT mTNFα、 mTNFαF86、 pNO2Phe42mTNFα、 mTNFαF42 和 pNO2Phe11mTNFα 四聚体结构的分子量， 如表 2 所示 ( 如下 )。单体 pNO2Phe86mTNFα 洗脱保留时间为 41.47 分钟。
     表2： WT mTNFα 和 mTNFα 突变子分子量的观察值和计算值
     对蛋白质标准品分子量的对数相对在 Superdex 75 10/300GL 凝胶渗入柱上 的 保 留 时 间 进 行 作 图， 通 过 该 图 确 定 pNO2Phe86TNFα、 Phe86mTNFα、 pNO2Phe42mTNFα、
     Phe42mTNFα、 pNO2Phe11mTNFα 和 WT mTNFα 四聚体的分子量。
     pNO2Phe86mTNFα 生物学活性的分析
     在 NFκB- 荧光素酶报告细胞系中， 通过测量 mTNFα- 诱导的 NFκB 的活化对蛋白 质的生物学活性进行检测。报告基因实验中使用稳定表达 NFκB-Luc 的 HEK293 细胞 (Ye 等， (2000)《ER 压力诱导 SREBP 加工酶切割膜结合 ATF6》 (ER Stress Induces Cleavage of Membrane-Bound ATF6 by the Same Proteases that Process SREBPs)Mol Cell 6 ： 1355-1364)。胰蛋白酶硝化稳定细胞， 重悬于含 10％ FBS 的 DMEM 中， 浓度为 5x105 细胞 / 毫升， 以 20μl/ 孔种植于 384- 孔白板中 ( 葛雷娜公司， 朗伍德， 佛罗里达州 )(Greiner， Longwood， FL)。在 37 ℃含 5 ％ CO2 的组织培养箱中孵育 2 小时后， 在细胞中加入 20μl TNFα。继续孵育细胞 24 小时。加入 20μl Bright-Glo( 普洛麦格公司， 威斯康星州麦迪 逊 )(Promega， Madison， WI) 测定荧光素酶活性， 并且用冷光读板机读板。实验结果表明， WT mTNFα 激活 NFκB- 荧光素酶报告细胞系中 NFκB 信号转导。相比之下， pNO2Phe86 突 变子 ( 图 5) 仅有 2％实验中 WT mTNFα 的活性， 这与之前关于 Tyr86 为受体结合所必须， 引 入 86 位残基突变引起活性显著丧失的报道一致 (Van Ostade 等 (1994)， 《人肿瘤坏死因子 的结构活性研究》 (Structure-activity studies of human tumour necrosis factors) Protein Engineering 7 ： 5-22 ； Loetscher 等 (1993)， 《人肿瘤坏死因子 α(TNFα) 突变 子对于 55-kDa 或 75-kDa TNF 受体具有排他的特异性》 (Human tumor necrosis factor alpha(TNF alpha)mutants with exclusive specificity for the 55-kDa or 75-kDa TNF receptors)J Biol Chem 268 ： 26350-7 ； Zhang 等 (1992)， 《人肿瘤坏死因子 -α 受体结合 位点的定点突变分析以及结构功能关系》 (Site-directed mutational analysis of human tumor necrosis factor-alpha receptor binding site and structure-functional relationship)J Biol Chem 267 ： 24069-75)。 在 MALDI-TOF 谱 中 发 现 另 外 一 个 峰 与 86 pNO2Phe mTNFα 前两个氨基酸的删除相对应 ( 表 1， 图 2)， 推测是由于 Xa 蛋白酶解切 割步骤中过度消化所致。前两个 N 末端氨基酸的删除仅仅轻微影响 TNF 活性， 因此难以 将截短蛋白质从全长蛋白质中分离 (Van Ostade 等 (1994)， 《人肿瘤坏死因子的结构活 性研究》 (Strncture-activity studies of human tumour necrosis factors)Protein Engineering 7 ： 5-22)， 故而用混合物直接免疫小鼠， 包括突变 mTNFα 和 WT 对照。
     另外的实验表明 N- 末端 His6 标签存在与否不影响免疫结果 ( 图 13)。五只 Bcl2 小鼠， 如 #3262、 #3263、 #3264、 #3331、 #3351， 随机分为两组， 分别用 His6-Phe86 mTNFα(WT) 或 His6-pNO2Phe86 mTNFα 进行注射， 所用方案为 RIMMS( 多位点重复免疫 ) 方案 ( 如下文所 述 )。简单说 18 天对小鼠进行 8 次注射。每次注射中， 含 5μg 蛋白质的 200μl PBS 与完 全弗氏佐剂 (CFA)1 ∶ 1 混合用作首次注射， 或与不完全弗氏佐剂 (IFA)1 ∶ 1 混合用于剩 下 6 个外周淋巴结附近特定位点的注射。 第 21 天时， 通过酶联免疫吸附实验 (ELISA)， 使用 86 86 辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠 IgG 第二抗体， 确定针对 pNO2Phe mTNFα 和 Phe mTNFα 的抗体滴度。参见图 13。该图中， 将免疫前小鼠血清稀释 100 倍 (1 ∶ 100 pre)， 将免疫后 小鼠血清稀释 1,000 倍 (1 ∶ 1K post) 或 10,000 倍 (1 ∶ 10K post) 后进行 ELISA。用 WT mTNFα(WT， 前三根柱 ) 或 pNO2Phe86 mTNFα(mod， 后三根柱 )The 包被 ELISA 板。 86
     pNO2Phe mTNFα 免疫小鼠中抗 pNO2Phe86 mTNFα 或 WT mTNFα 的血清滴度分析
     mTNFα 可存活且不显示明显表型异常 (Pasparakis 等 (1996)， 《TNFα 缺陷小鼠中免疫和炎症应答 ： 肿瘤坏死因子在原代 B 细胞滤泡， 滤泡树突状细胞网络和生发中心的 形成， 以及成熟的体液免疫中的关键作用》 (Immune and inflammatory responses in TNF alpha-deficient mice ： a critical requirement for TNF alpha in the formation of primary B cell follicles， follicular dendritic cell networks and germinal centers， and in the maturation of the humoral immune response)J Exp Med 184 ： 1397-1411)， 表明小鼠在针对 TNFα 的中和免疫应答中可以存活， 从而使免疫接种小鼠可 86 用于分析 TNFα 抗体产生和生物学活性。为了测定 pNO2Phe mTNFα 突变子的免疫原性， 32 只 C57BL/6 小鼠分为三组并分别注射 pNO2Phe86 mTNFα、 WT mTNFα 和 PBS 缓冲液， 所用 方案为 RIMMS( 多位点重复免疫 ) 方案 (Kilpatrick 等 (1997)， 《使用 RIMMS 快速开发亲和 成熟的单克隆抗体》 (Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS)Hybridoma 16 ： 381-389)。为了避免 mTNFα 毒性所引起的副作用， 研究中一 直使用每次注射 5μg mTNFα(Libert 等， (1999)《鉴定小鼠 12 号染色体末端控制肿瘤坏 死因子诱导致死性休克耐受的基因座》 (Identification of a locus on distal mouse chromosome 12 that controls resistance to tumor necrosis factor-induced lethal shock)Genomics 55 ： 284-289)。 图 6 显示用 PBS(6A)、 WT mTNFα(6B)、 pNO2Phe86 mTNFα(6C) 或 Phe86 mTNFα(6D) 免疫 C57BL/6 小鼠中的血清滴度。简单说 17 天对小鼠进行 8 次注射。 每次注射中， 含 5μg 蛋白质的 200μl PBS 与完全弗氏佐剂 (CFA)1 ∶ 1 混合用作首次注射， 或与不完全弗氏佐剂 (IFA)1 ∶ 1 混合用于剩下 6 个外周淋巴结附近特定位点的注射。第 21 天时， 通过酶联免疫吸附实验 (ELISA)， 使用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠 IgG 第二 86 抗体， 确定针对 pNO2Phe mTNFα 和 WT mTNFα 的抗体滴度。
     为 了 进 行 ELISA， 高 吸 附 384- 孔 板 ( 朗 可 公 司， 新 泽 西 州 罗 彻 斯 特 )(Nunc， Rochester， NY) 用 30μl 0.5μg/ml 蛋白质 4℃包被过夜。用 PBS+0.05％吐温 20(PBST) 洗板两次， 用含 80μl 1％ BSA 的 PBS 封闭并再次用 PBST 冲洗。依次将板与 20μl 第一抗 体或用含 1％ BSA 的 PBS 稀释的血清， 20μl HRP- 偶联的山羊抗小鼠 IgG( 杰克逊免疫研究 实验室， 西格罗韦， 宾夕法尼亚州 )(Jackson ImmunoResearch Laboratories， West Grove， PA) 和 20μl TMB 底物 (KPL， 盖瑟斯堡， 马里兰州 )(KPL， Gaithersburg， MD) 孵育， 并测量 650nm 吸收。孵育间用 PBST 洗板。
     用 ELISA 测定抗 WT mTNFα( 图 6A 和 6B， 左侧柱 ) 或 pNO2Phe86 mTNFα( 图 6A 和 6B， 右侧柱 )。对于 Phe86 mTNFα 免疫小鼠， 用 ELISA 测定抗 WT mTNFα( 图 6C 和 6D， 左侧 86 柱 ) 或 Phe mTNFα( 图 6C 和 6D， 右侧柱 )。 测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液稀释血清样 品。 用 WT mTNFα 或仅有 PBS 缓冲液免疫的小鼠血清中抗 pNO2Phe86 mTNFα 和 WT mTNFαIgG 滴度不显著 ( 图 6)。正如预期， WT mTNFα 作为自身蛋白质， 应该被小鼠免疫系统耐受。相 86 86 比之下， 用 pNO2Phe mTNFα 免疫的小鼠显示了对 pNO2Phe mTNFα( 图 6C， 每对柱子的右 侧柱 ) 和 WT mTNFα( 图 6C， 每对柱子的左侧柱 ) 的明显高血清滴度。因此， 单一 pNO2Phe 突变 ( 使单体分子量改变 29 道尔顿 ) 诱导了强烈的免疫应答， 得到与 WT mTNFα 高度交叉 反应的抗体。使用 Bcl-2 小鼠获得相似结果， 表明该结果不依赖于品系 ( 图 7)。再次使用 的 RIMMS 方案包括 17 天进行 8 次注射 ( 每次注射 5g)， 在 CFA 存在的条件下进行初次注射， IFA 存在下进行剩余 7 次注射。用 ELISA 测定抗 WT mTNFα( 每一组四根柱子的第一、 第二 86 根 ) 或 pNO2Phe mTNFα( 每一组四根柱子的第二、 第三根柱子 )。测量前， 用含 1％ BSA 的PBS 缓冲液 1/100 或 1/1000 稀释血清样品。
     我们还检测了没有免疫增强剂时的免疫原性， 发现用 pNO2Phe86 mTNFα 免疫小鼠， 在没有任何佐剂存在时也诱导了显著的抗 -TNFα 滴度 ( 图 8)， 表明该方案可用于不需要强 佐剂的治疗条件。在没有 CDA 或 IFA 的条件下， 用 (a)WT mTNFα， 或 (b)pNO2Phe86 mTNFα 免疫 17 天进行 8 次注射 ( 每次注射 5μg 蛋白质 ) 的 Bcl-2 小鼠的血清滴度。用 ELISA 测 定抗 WT mTNFα( 每对柱的左侧柱 ) 或 pNO2Phe86mTNFα( 每对柱的右侧柱 )。测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液稀释血清样品。
     而且， 顺序用 pNO2Phe86 mTNFα 进行 8 次免疫后抗体应答持续， 在 19 周后非常强 烈 ( 图 14)。临床用途尤其需要这种长期持续性， 因为目前疗法缺陷在于当免疫停止后， 自身抗体滴度迅速降低。图 14 显示了测定血清滴度持续性的结果。为了进行该实验， 用 86 pNO2Phe mTNFα 免疫三只 Bcl-2 转基因小鼠。在顺序进行 8 次免疫后， 在规定时间点取血 86 进行抗 pNO2Phe mTNFα 的 ELISA 分析。每次测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液 1 ∶ 100 稀释血清样品。T 对应最后一次免疫和取血之间的时间长度。
     为了验证免疫应答是非天然氨基酸中免疫原性硝基芳基的结果， 产生 Tyr86 → Phe 突变 mTNFα(Phe86 mTNFα)。 用大小排阻色谱确认三聚体四级结构后， 在 CFA/IFA 存在或不 存在的条件下用该突变子免疫 Bcl2 小鼠。对于无佐剂条件下免疫的小鼠， RIMMS 方案包括 17 天 8 次注射 ( 每次注射 5g 蛋白质 )。对与佐剂存在条件下免疫的小鼠， CFA 用作首次注 射， IFA 用于剩余 7 次注射。 用 ELISA 测定抗 WT mTNFα( 图 9， 每一组四根柱子的第一、 第二 86 根 ) 或 Phe mTNFα( 图 9， 每一组四根柱子的第二、 第三根柱子 )。测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液 1/100 或 1/1000 稀释血清样品。 存在或不存在佐剂的条件下均没有产生显著的 抗 -TNFα 滴度， 表明 NO2 是打破免疫耐受所需要的 ( 图 6D 和 9)。而且， pNO2Phe86mTNFα 特 异性 CD4+T 细胞仅在用该突变蛋白质免疫小鼠时产生， 而在用 WT mTNFα 或 Phe86mTNFα 免 疫小鼠时则不产生 ( 图 15A)。相比之下， 当在体外用 WT mTNFα 刺激来自 pNO2Phe86mTNFα 免疫小鼠的 CD4+T 细胞时， 没有观察到显著的增殖 ( 图 15B)。为了进行 T- 细胞增殖实验， 通过使用 MACS 珠子 ( 美天旎生物技术公司 )(Miltenyi Biotec) 的磁性消耗从淋巴结分离 来自免疫小鼠的 CD4+T 细胞。然后将 T 细胞放置与来自天然 Bcl-2 小鼠的辐射的脾细胞以 及数量递增的抗原一起培养。将培养物孵育 48h， 然后用 [3H] 胸苷脉冲标记过夜。收集培 养板置于滤纸垫上， 并用 TopCount 闪烁计数仪 ( 珀金埃尔默公司 )((PerkinElmer) 进行定 量。
     使 用 mTNFα 突 变 子 和 WT mTNFα 肽 片 段 的 初 步 表 位 作 图 实 验 表 明 对 于 86 pNO2Phe mTNFα 的多克隆应答涉及多个蛋白质表位。综上， 这些结果表明将 pNO2Phe 掺入 mTNFα 序列创造了 T 细胞表位， 增强了 T 细胞对于触发对抗疾病相关蛋白质的有效免疫应 答的帮助。其它免疫方案 ( 如， 用突变和 WT TNFα 顺序免疫 ) 也可产生高滴度的交叉反应 抗体。这些结果与 Dalum 等 (1999)， 《对抗 TNFα 免疫得到的治疗性抗体》 (Therapeutic antibodies elicited by immunization against TNF-alpha)Nat Biotechnol 17 ： 666-669 相一致， 这篇文章将免疫优势 T 辅助细胞表位掺入 mTNFα 以打破免疫耐受。然而 目前的方案导致蛋白质中存在小的扰动， 不会破坏其三级折叠或显著影响其表达、 可溶性 或稳定性。
     对 TNFα 中潜在 MHC II 类 DR 表位的基于序列的计算机分析预测 Tyr86 周围的多肽序列并非 T- 细胞表位 (Steed 等 (2003)， 《合理设计显性负 TNF 变体使 TNF 信号转导失 活》 (Inactivation of TNF Signaling by Rationally Designed Dominant-Negative TNF Variants)Science 301 ： 1895-1898)。 为了开始探讨该方法的普遍性， 我们检测了在其它位 点进行 pNO2Phe 取代是否具有相似效果。 将不参与三聚化或受体结合的表面暴露残基 Asp42 突变为 pNO2Phe。在 SDS-PAGE 和质谱确认突变后， 用 pNO2Phe42 mTNFα 或 Phe42 mTNFα 突 变子免疫两组 C57BL/6 小鼠 ( 图 10)。RIMMS 方案包括在佐剂不存在下 17 天进行 8 次注 射 ( 每次注射 5g 蛋白质 )。ELISA 测定抗 WT mTNFα( 图 10A， 每组三根柱子的第一根 ； 图 42 11 10B， 每对柱子的第一根 )， 抗 pNO2Phe mTNFα/pNO2Phe mTNFα( 图 10A， 图 10A， 每组三根 42 柱子的第二根 ； 图 10B， 7、 8、 9 中每对柱子的第二根 )， 或抗 Phe mTNFα( 图 10A， 每组柱子 的第三根 ) 或 PBS( 图 10B， 5、 6 中每对柱子的第二根 )。测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲 液 1/100( 图 10A) 或 1/800( 图 10B) 稀释血清样品。仅当 pNO2Phe42 mTNFα 进行免疫时诱 导显著的抗 -TNFα 滴度， 用 pNO2Phe42 mTNFα 免疫的小鼠诱导显著的抗 -TNFα 滴度。这 个结果表明 pNO2Phe 诱变是一个相当普遍的赋予特定自身或外来抗原高免疫性的方法。
     将另一表面暴露残基 Lys11 突变为 pNO2Phe 得到相似结果。这些结果表明 pNO2Phe 诱变一个相当普遍的赋予特定自身或外来抗原高免疫性的方法， 可不仅仅限于表面暴露 Tyr 或 Phe 残基的取代。然而， 初步研究表明在 104 和 19 位掺入 pNO2Phe 效果相对较弱。用 104 pNO2Phe mTNFα 免疫 C57BL/6 小鼠产生缺少与天然 mTNFα 显著交叉反应的抗体。因此， 环境影响对于确定免疫应答的特点具有影响。最后， 可能遗传编码免疫原性氨基酸也具有 同样的有利的应用， 或者对于更小的抗原， 可通过半合成或全肽合成掺入免疫原性非天然 氨基酸。
     分析 pNO2Phe86mTNFα 免疫小鼠对 LPS 刺激的应答
     我们接下来在严重的内毒素血症小鼠模型中测定用 pNO2Phe86TNFα 免疫接种小鼠 能否使其对抗脂多糖 (LPS) 刺激 (F.Niessen 等 (2008)《树突细胞 PAR-S1P3 信号转导将 凝血和炎症联系在一起》 (Dendritic cell PAR-S1P3 signalling couples coagulation and inflammation)Nature 452 ： 654-658。在该模型中， 已知 LPS 诱导的感染性休克参与 TNFα 的产生和释放。所有研究小鼠内毒素血症的实验均按照国立卫生研究院动物保护指 南 (National Institutes of Health Animal Protection Guidelines) 进行， 并经过斯克 力普研究院动物护理和使用委员会批准。 通过涡旋 30 秒将脂多糖 (LPS， 大肠杆菌 (E.coli) O111:B4， CEB 公司 (Calbiochem/EMD Biosciences)， 加州圣地亚哥， 美国 ) 溶解于 37℃生 理盐水 (0.9％ w/v NaCl)， 之前和之后各进行 2 分钟超声处理。在 2％异氟烷麻醉下， 对9 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠 ( 杰克逊实验室 ( 美国缅因州巴尔哈伯 (Bar Harbor， ME， USA)) 腹膜内注射 7.5mg/kg LPS 以进行被动免疫， 或者对 15 周龄的小鼠注射 8.5mg/kg LPS 进 行主动免疫。所有实验均在 12 小时昼夜交替的室内、 稳定条件 ( 温度 20-22 ℃和相对湿 度 40-60％ ) 下进行。接受主动或被动免疫的小鼠的 Kaplan-Meier 存活曲线见图 11。作 Kaplan-Meier 曲线， 并用对数秩检验分析存活差异。
     用 PBS、 WT mTNFα 和 pNO2Phe86mTNFα 免疫 C57BL/6 小鼠。在完成上述免疫方 案后， 对这些小鼠腹膜内注射 LPS(8.5mg/kg)， 确定它们的存活率。在图 11A 中， 将利用 86 pNO2Phe mTNFα 或 WT mTNFα 免疫的小鼠 ( 每组 8 只 ) 与接受假免疫的 7 只小鼠作比较。 显示与野生型相比用 pNO2Phe86mTNFα 免疫的小鼠的存活优势 (p ＜ 0.01)。在图 11B 中， 将利用 100μg 来自 pNO2Phe86mTNFα 或野生型免疫小鼠的纯化 IgG 注射的小鼠 ( 每组 8 只 ) 与接受盐水注射的对照作比较。显示与野生型相比用 pNO2Phe86mTNFα 免疫的小鼠的存活 优势 (p ＜ 0.01)。在图 11C 中， 小鼠 ( 每组 6 只 ) 接受 100μL 来自 pNO2Phe86mTNFα 或野 生型 mTNFα 免疫小鼠的汇集血清。显示与野生型相比用 pNO2Phe86mTNFα 免疫的小鼠的存 活优势 (p ＜ 0.01)。对照小鼠注射等体积的生理盐水。
     如 图 11A 所 示， 用 pNO2Phe86mTNFα 突 变 体 免 疫 的 小 鼠 的 存 活 优 势 (87.5 ％ ) 明显高于接受 PBS 和 WT mTNFα 免疫的小鼠 ( 存活率 12.5 ％ )。类似地， 接受来自经 86 pNO2Phe mTNFα 预免疫的 Bcl-2 小鼠的汇集血清 (100uL) 或纯化 IgG 抗体 (4mg/kg) 的 C57BL/6 小鼠的存活率 (83.3-87.5％ ) 明显高于接受来自经 WTmTNFα 免疫的 Bcl-2 小鼠的 汇集血清或 IgG 的小鼠 (16.7-25.0％ )( 图 11B， 11C)。因此， 这些结果表明， 自身蛋白质的 单一 NO2Phe 突变体诱导针对天然蛋白质的强烈的交叉反应抗体应答， 从而在疾病模型中产 生保护作用。目前， 我们将这些研究扩展到其他 TNFα 依赖性模型， 包括胶原诱导的关节炎 (CIA) 模型和 KRN 转基因小鼠 (K/BxN) 模型 (Ditzel(2004)《K/BxN 小鼠 ： 人炎性关节炎模 型》 (arthritis(CIA)model and KRN transgenic mouse(K/BxN)model(Ditzel(2004) “The K/BxN mouse ： A model of human inflammatory arthritis)Trends Mol Med 10 ： 40-45)。
     上述注射中所用的 IgG 抗体通过将鼠血清加载到 10ml 琼脂糖偶联蛋白 G 亲和 柱 (γ 结合 + 琼脂糖 (GammaBind Plus Sepharose)， 法玛西亚生物技术公司 (Pharmacia Biotech)， 新泽西州皮斯卡塔韦， USA) 上得以制备。用三倍柱体积的 PBS(pH 7 ＝ 4) 洗涤 该柱。用两倍柱体积的 0.1M 乙酸 (pH 3 ＝ 0) 进行洗脱。然后用 1M Tris/HCl(pH ＝ 9.0) 中和洗脱液， 并用 PBS(pH ＝ 7.4) 透析。
     在内毒素刺激前 24 小时， 对小鼠进行被动免疫。在第一个实验中， 小鼠接受腹膜 86 内注射 100μL 来自 pNO2Phe mTNFα 或 WT mTNFα 免疫小鼠的汇集血清。第二组接受 4mg/ kg 由 pNO2Phe86mTNFα 或 WT mTNFα 免疫的小鼠血清纯化的 IgG。对照小鼠注射等体积的 生理盐水。
     上述发现表明， 在 TNFα 依赖型小鼠模型中， Tyr86 到 pNO2Phe 的单一突变 ( 与 WT- 蛋白质的唯一差别是在溶剂接触位点用 -NO2 基团取代取代 -OH) 显著增强了蛋白质的 免疫原性并导致中和抗体应答。将残基 86 和临近残基 85 诱变成 Ala 对 pNO2Phe86 或 WT 蛋 白质抗体滴度的影响很小， 表明这些抗体识别不连续的表位。结果表明含有天然产生的蛋 白质中没有的高度免疫原部分独特 NO2 基团的蛋白质将被免疫系统识别为外来抗原。由于 结构非常相似， 引发的抗体能与相应自身蛋白质发生交叉反应， 从而打破免疫耐受。
     该实施例显示可能通过将 pNO2Phe 定点掺入蛋白质表位， 如靶标自身蛋白质的表 位打破免疫自身耐受， 例如用于产生疫苗。虽然已知改变的蛋白质可诱导自体抗体， 但赋 予蛋白质免疫原性的改变的疾病限定特性使它们的产生和治疗应用变得复杂 (Lerner 等 (1968)《在家兔中用分离自正常的同源和自身尿液的可溶性抗原诱导急性肾小球肾炎》 (The induction of acute glomerulonephritis in rabbits with soluble antigens isolated from normal homologous and autologous urine)J Immunol 100 ： 1277-1287)。 例如， Weigle 的研究中所用的阿散酰 - 磺酰 - 甲状腺球蛋白制备物包含每分子甲状腺 球蛋白～ 50 个偶氮连接 (Weigle(1965)《在事先用改变的甲状腺免疫球蛋白刺激的兔 中不含佐剂注射未改变的甲状腺免疫球蛋白产生甲状腺炎和抗体》 (The production ofthyroiditis and antibody following injection of unaltered thyroglobulin without adjuvant into rabbits previously stimulated with altered thyroglobulin)J Exp Med 122 ： 1049-1062)， 得到高度异源性并可能聚集或部分未折叠的抗原。 相似的， 在抗原的 不同位点插入 T- 细胞表位可创造与天然蛋白质相比， 三级结构、 可溶性和稳定性不改变的 蛋白质。相比之下， 本文的改变具有明确的化学定义且局限于单一残基。而且， 这些突变似 乎不影响蛋白的总体四级结构及其可溶性。 得到的抗体因此更可能识别天然蛋白质中的对 应表位。 最后， 含 pNO2Phe 的 TNFα 突变体诱导保护性的交叉反应免疫应答， 而无需强佐剂， 所得到的高滴度维持 4 个月。这些特性有利于本方法学的治疗应用。
     该方案可应用于其它自身蛋白质， 包括那些与蛋白折叠疾病相关的 ( 如淀粉 β1-42 肽 ) 或癌症相关的。此外， 通过在弱免疫原性或沉默表位引入 pNO2Phe 基团， 该方法 可产生针对病原区域的强烈抗体应答， 预测其得到对抗病毒。细菌或寄生虫感染的中和抗 体 ( 如， 疟疾的 CS1 蛋白质或 HIV-1 gp41 的 E410 表位 )。而且， 将免疫原性氨基酸选择性 掺入蛋白质有利于产生功能性抗体， 如 G 蛋白偶联受体， 及其它历史上难以产生强烈抗体 应答的膜结合受体的激动剂或拮抗剂。 当前该现象的结构基础以及对其在人类疾病应用的 探讨正在阐明之中。
     实施例 1 相关附图中所示结果的解释。
     图 1 显示确认 pNO2Phe 掺入 mTNFα 的实验结果。 图 1A 是非天然氨基酸 pNO2Phe 的 结构。图 1B 显示了含 Tyr-86、 Asp42 和 Lys-11 的 mTNFα 三聚体的 X- 射线晶体结构 (PDB ID 代码 2TNF)。 图 1C 显示了使用 pNO2Phe- 特异性 mutRNACUA/ 氨酰基 -tRNA 合成酶对， 在 1mM 86 pNO2Phe 存在 ( 第 3 泳道 ) 而非缺少 ( 第 2 泳道 ) 的条件下， mTNFαTyr 琥珀突变子的表 达的确认实验结果。图 1C 中在变性条件下用 Ni-NTA 亲和柱纯化蛋白质样品， 用 SDS-PAGE TM 和 SimplyBlue 染色进行分析。第 4 道包含 WT mTNFα， 第 1 道是分子量标准品。图 1D 对 86 pNO2Phe mTNFα 突变子进行了表征。提供了 10 聚片段 FAISXQEK 的串连质谱， 其中 X 表示 86 pNO2Phe。10 聚片段通过胰蛋白酶消化 pNO2Phe mTNFα 产生。含 pNO2Phe 的 10 聚体的部分 序列可从 b 或 y 离子系列读出。
     进行多种实验确认 pNO2Phe 掺入 mTNFα， 并显示掺入 pNO2Phe 不影响非天然 TNFα 86 的四级结构。图 2 提供了 pNO2Phe mTNFαMALDI-TOF 质谱分析结果， 图 3 提供了 WT mTNFα 质谱分析结果 ； 图 2 中峰确认非天然 TNFα 分子量表明掺入 pNO2Phe 残基。图 4 显示了确 定在突变 mTNFα 蛋白质的四级结构上进行 Tyr86 → pNO2Phe 取代效果的 FPLC 实验结果。 突 变子洗脱时间表明突变子三聚化。
     还 对 突 变 TNFα 进 行 了 活 性 评 价，图 5 显 示 了 WT mTNFα( 方 块 )、 86 pNO2Phe mTNFα( 三 角 )、 pNO2Phe42mTNFα( 倒 三 角 )、 Phe86mTNFα( 钻 石 ) 和 Phe42mTNFα( 圈 ) 的 NF-κB- 荧光素酶活性分析。与 WT TNFα 相比， 非天然 TNFα 活性降 低。
     图 6A 显 示 了 PBS 免 疫 C57BL/6 小 鼠 的 血 清 滴 度 ； 图 6B 显 示 了 WT mTNFα 免 86 疫小鼠的血清滴度 ； 图 6C 显示了 pNO2Phe mTNFα 免疫小鼠的血清滴度 ； 图 6D 显示了 86 Phe mTNFα 免疫小鼠的血清滴度 ； 用 WT mTNFα 或仅仅用 PBS 缓冲液免疫小鼠得到的 86 抗 pNO2Phe mTNFα 和 WT mTNFα 血 清 IgG 滴 度 不 明 显。 正 如 预 期， WT mTNFα 作 为 自 86 身蛋白质， 应该被小鼠免疫系统耐受。相比之下， pNO2Phe mTNFα 免疫小鼠显示了对于pNO2Phe86mTNFα 的高血清滴度。
     实验方案包括 17 天进行 8 次注射 ( 每次注射 5μg 蛋白质 )， 起始注射在存在完 全弗氏佐剂 (CFA) 的条件下进行， 剩下的注射在存在不完全弗氏佐剂 (IFA) 的条件下进行。 用 ELISA 测定抗 WT mTNFα(1-32 每对柱的左侧柱 ) 或 pNO2Phe86mTNFα(1-32 每对柱的右侧 柱 )。对于 Phe86mTNFα 免疫小鼠 ( 图 6D)， ELISA 测定对抗 WT mTNFα(33-36 每对柱的左侧 86 柱 ) 或 Phe mTNFα(33-36 每对柱的右侧柱 )。 测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液 1 ∶ 1000 稀释血清样品。
     使用 Bcl-2 小鼠获得与上相似结果， 表明该结果不依赖于品系 ( 图 7)。 图 7 显示了 86 86 WT mTNFα 或 pNO2Phe mTNFα 免疫 Bcl2 小鼠中对抗 WT mTNFα 和 pNO2Phe mTNFα 的血清 滴度水平。RIMMS 方案包括 17 天进行 8 次注射 ( 每次注射 5μg 蛋白质 )， 起始注射在存在 CFA 的条件下进行， 剩下的注射在存在 IFA 的条件下进行。用 ELISA 测定抗 WT mTNFα( 每 一组四根柱子的第一、 第二根 ) 或 pNO2Phe86mTNFα( 每一组四根柱子的第二、 第三根柱子 )。 测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液 1 ∶ 100 或 1 ∶ 1,000 稀释血清样品。
     图 8 显示了在没有佐剂存在的条件下 pNO2Phe86mTNFα 免疫小鼠血清滴度测量结 果。该免疫诱导了显著的抗 -TNFα 滴度， 表明该方案能够应用于不需要强烈佐剂的治疗条 件下。 。 图 8A 显示了 WT mTNFα 免疫 Bcl-2 小鼠的血清滴度， 图 8B 显示了 pNO2Phe86mTNFα 免 疫小鼠的滴度。如下进行免疫 ： 在没有 CFA 或 IFA 存在的条件下， 17 天进行 8 次注射 ( 每次 注射 5μg 蛋白质 )。 用 ELISA 测定抗 WT mTNFα( 每对柱的左侧柱 ) 或 pNO2Phe86mTNFα( 每 对柱的右侧柱 )。测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液 1 ∶ 1000 稀释血清样品。
     为了验证免疫应答是非天然氨基酸中免疫原性硝基芳基的结果， 产生 Tyr86 → Phe 突变子 mTNFα(Phe86mTNFα) 并在存在或缺少 CFA/IFA 的条件下用该突变子 Bcl2 小鼠。 图9 86 86 提供了有无佐剂存在的条件下用 Phe mTNFα 免疫 Bcl2 小鼠的抗 wt mTNFα 和 Phe mTNFα 血清滴度测量。存在或不存在佐剂的条件下均没有产生显著的抗 -TNFα 滴度， 表明 NO2 是 打破免疫耐受所需要的。
     对于无佐剂条件下免疫的小鼠， RIMMS 方案包括 17 天 8 次注射 ( 每次注射 5μg 蛋 白质 )。对与佐剂存在条件下免疫的小鼠， CFA 用作首次注射， IFA 用于剩余 7 次注射。用 ELISA 测定抗 WT mTNFα( 每一组四根柱子的第一、 第二根 ) 或 Phe86mTNFα( 每一组四根柱 子的第二、 第三根柱子 )。测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液 1 ∶ 100 或 1 ∶ 1,000 稀释 血清样品。
     图 10 显示确定 TNFα 其它表面位点的免疫原性确定实验的结果 ； 图 10A 显示了 42 42 用 pNO2Phe mTNFα 或 Phe mTNFα 免 疫 C57BL/6 小 鼠 抗 WT mTNFα、 pNO2Phe42mTNFα 和 Phe42mTNFα 的血清滴度。图 10B 中显示了用 pNO2Phe11mTNFα 或 WT mTNFα 免疫 C57BL/6 小鼠抗 WT mTNFα、 PBS 以及 pNO2Phe11mTNFα 的血清滴度。仅当 pNO2Phe42mTNFα 进行免疫 时诱导显著的抗 -TNFα 滴度， 用 pNO2Phe42mTNFα 免疫的小鼠诱导显著的抗 -TNFα 滴度。 这个结果表明 pNO2Phe 诱变是一个相当普遍的孵育特定自身或外来抗原高免疫性的方法。
     RIMMS 方案包括在没有佐剂下 17 天进行 8 次注射 ( 每次注射 5μg 蛋白质 )。 ELISA 测定抗 WT mTNFα( 图 10A， 每组三根柱子的第一根 ； 图 10B， 每对柱子的第一根 )， 抗 42 11 pNO2Phe mTNFα/pNO2Phe mTNFα( 图 10A， 图 10A， 每组三根柱子的第二根 ； 图 10B， 7、 8、 9 42 中每对柱子的第二根 )， 或抗 Phe mTNFα( 图 10A， 每组柱子的第三根 ) 或 PBS( 图 10A， 5、 6中每对柱子的第二根 )。测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液 1/100( 图 10A) 或 1/800( 图 10B) 稀释血清样品。
     在该模型中， 已知 LPS 诱导的感染性休克参与 TNFα 的产生和释放。我们接下来 在严重的内毒素血症小鼠模型中测定用 pNO2Phe86TNFα 免疫接种小鼠能否使其对抗脂多糖 (LPS) 刺激 (F.Niessen 等 (2008)《树突细胞 PAR-S1P3 信号转导将凝血和炎症联系在一 起》 (Dendritic cell PAR-S1P3 signalling couples coagulation and inflammation) Nature 452 ： 654-658。 图 11 显示了在严重内毒素血症模型中用 pNO2Phe86mTNFα 免疫能否 提高老鼠生存的实验结果。显示了接受主动或被动免疫的小鼠的 Kaplan-Meier 存活曲线。 在图 11A 中， 将利用 pNO2Phe86mTNFα 或 WT mTNFα 免疫的小鼠 ( 每组 8 只 ) 与接受假免疫 的 7 只小鼠作比较。 显示与 WT 相比用 pNO2Phe86mTNFα 免疫的小鼠的存活优势 (p ＜ 0.01)。 在图 11B 中， 将利用 100μg 来自 pNO2Phe86mTNFα 或 WT 免疫小鼠的纯化 IgG 注射的小鼠 ( 每 组 8 只 ) 与接受盐水注射的对照作比较。显示与 WT 相比用 pNO2Phe86mTNFα 免疫的小鼠的 存活优势 (p ＜ 0.01)。在图 11C 中， 小鼠 ( 每组 6 只 ) 接受 100μL 来自 pNO2Phe86mTNFα 或 WT mTNFα 免疫小鼠的汇集血清。与 WT 相比用 pNO2Phe86mTNFα 免疫的小鼠的存活优势 (p ＜ 0.01)。显示了 WT。
     图 12 提供了源自 pNO2Phe86mTNFα 的 8 聚蛋白酶解片段的 MS/MS 分析。以单字母 代买表示含 pNO2Phe 蛋白酶解片段的序列 (X ＝ pNO2Phe)。显示了观察到的 y 和 b 系列的 离子片段。证明 pNO2Phe 掺入的关键 y 和 b 离子是 b5、 b6、 b7、 y7、 y6、 y5 和 y4。所有的质量以 单一同位素质量报告。MS/MS 分析与 86 位残基掺入 pNO2Phe 的模式精确匹配。
     图 13 显示了 His6-Phe86mTNFα(WT) 或 His6-pNO2Phe86mTNFα 的 N- 末端 His6 标签 对于后续免疫实验结果无影响。
     临床用途尤其需要血清抗体的长期持续性， 因为目前疗法缺陷在于当免疫停止 后， 自身抗体滴度迅速降低。图 14 显示了确定抗 TNFα 免疫应答血清滴度持续性的实验 结果。用 pNO2Phe86mTNFα 免疫三只 Bcl-2 转基因小鼠。在顺序进行 8 次免疫后， 在规定时 86 间点取血进行抗 pNO2Phe mTNFα 的 ELISA 分析。每次测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液 1 ∶ 100 稀释血清样品。T 对应最后一次免疫和取血之间的时间长度。每组 6 根柱的第一 根是取血前， 第二根是 t ＝ 1 周， 第三根是 t ＝ 8 周， 第四根是 t ＝ 12 周， 第五根是 t ＝ 16 周， 第六根是 t ＝ 19 周。
     图 15 显 示 了 T 细 胞 增 殖 实 验 结 果。 图 15A 显 示 了 来 自 用 WT mTNFα、 86 pNO2Phe mTNFα 和 Phe86mTNFα 免疫的 Bcl-2 转基因小鼠的 CD4+T 细胞在体外用梯度稀释的 pNO2Phe86mTNFα 刺激。图 15B 显示了来自用 WT mTNFα、 pNO2Phe86mTNFα 和 Phe86mTNFα 免 疫的 Bcl-2 转基因小鼠的 CD4+T 细胞在体外用梯度稀释的 WT mTNFα 刺激。 pNO2Phe86mTNFα 特异性 CD4+T 细胞仅在用该突变蛋白质免疫小鼠时产生， 而在用 WT mTNFα 或 Phe86mTNFα 免疫小鼠时则不产生。相比之下， 当在体外用 WT mTNFα 刺激来自 pNO2Phe86mTNFα 免疫小 鼠的 CD4+T 细胞时， 没有观察到显著的增殖。
     实施例 2 ： 用非天然氨基酸免疫化学终止耐受的机制研究
     实施例 2 对掺入了非天然氨基酸的 TNFα 的所产生的多克隆 IgG 抗体的特性和持 久性进行了表征， 为非天然氨基酸诱导 ( 如 pNO2Phe- 诱导 ) 的自身耐受的丧失的一般性增 添了新的支持。实施例 2 显示了将鼠肿瘤坏死因子 -α(mTNFα) 的多个表面残基独立突变为对 - 硝基苯丙氨酸 (pNO2Phe) 引起了 T 细胞 - 依赖的多克隆和持续抗 -mTNFαIgG 自身抗 体应答持续至少 40 周。 实施例显示抗体结合于 mTNFα 上多个表位， 并且保护小鼠免遭脂多 糖 (LPS) 刺激诱导的严重内毒素血症。 用鼠视黄醇结合蛋白质 (RBP4)pNO2Phe43 突变子免疫 小鼠也显示可诱导高滴度的 IgG 抗体应答， 该抗体与野生型 mRBP4 交叉反应。因此， 实施例 2 进一步支持了本发明可作为常用方法产生对抗癌症相关或其它弱免疫原的有效免疫治疗 疗法。
     主动免疫疗法在超过两个世纪都处于预防感染性疾病努力的前沿 (Waldmann， T.A.(2003)《免疫疗法 ： 过去， 现在和未来》 (Immunotherapy ： past， present and future) Nat Med 9 ： 269-277)。然而， 免疫系统发动对于自身抗原的强烈免疫应答的能力降低使产 生针对癌症或慢性退行性疾病的治疗疫苗更加困难。最近， 我们显示将免疫原性非天然氨 基酸掺入自体蛋白提供了克服免疫耐受的简单有效的方法 ( 参见 Grunewald， J. 等 (2008) 《免疫化学终止自体耐受》 (Immunochemical termination of self-tolerance)Proc Natl Acad Sci U S A 105 ： 11276-11280 以及实施例 1)。本文中我们表征了多克隆 IgG 抗体应 答的特性和持续性， 并开始确立 pNO2Phe- 诱导的自身耐受丧失的一般性。将鼠肿瘤坏死因 子 -α(mTNFα) 的多个表面残基独立突变为对 - 硝基苯丙氨酸 (pNO2Phe) 引起了 T 细胞 - 依 赖的多克隆和持续抗 -mTNFαIgG 自身抗体应答持续至少 40 周。抗体结合于 mTNFα 上多 个表位， 并且保护小鼠免遭脂多糖 (LPS) 刺激诱导的严重内毒素血症。用鼠视黄醇结合蛋 白质 (RBP4)pNO2Phe43 突变子免疫小鼠也显示可诱导高滴度的 IgG 抗体应答， 该抗体与野生 型 mRBP4 交叉反应。这些发现表明这可能是产生有效对抗癌症相关或其它弱免疫原性抗原 的免疫疗法的一般方法。
     免疫识别自身 - 非自身过程的关键在于自体耐受 (Goodnow(2007)《自身免疫性 疾病发病的多个步骤》 (Multistep pathogenesis of autoimmune disease)Cell 130 ： 25-35)， 其中哺乳动物的免疫系统对于自身蛋白产生 “耐受” 以避免自身免疫病， 主要是 因为自反应 B- 或 T- 细胞缺少或失活。然而， 多年前已知可诱导免疫系统攻击自身蛋 白质。例如， 可通过在嵌合抗原中引入外来 T 辅助细胞表位诱导对于自身蛋白质的交叉 反 应 免 疫 应 答 (Dalum 等 (1999)， 《免 疫 诱 导 对 抗 TNFα 的 治 疗 性 抗 体》 (Therapeutic antibodies elicited by immunization against TNF-alpha)Nat Biotechnol 17 ： 666-669， Zuany-Amorim 等 (2004)《Auto Vac TNF106 诱导 TNFα 自身抗体的产生 ： 治疗 过敏疾病的新方法》 (Induction of TNF-alpha autoantibody production by AutoVac TNF 106 ： a novel therapeutic approach for the treatment of allergic diseases) Int Arch Allergy Immunol 133 ： 154-163) 通过对自身抗原的广泛化学衍生化 (Weigle， W.O.(1965)， 《异源或改变的同源甲状腺球蛋白注射后诱导兔的自身免疫》 (The Induction of Autoimmunity in Rabbits Following Injection of Heterologous or Altered Homologous Thyroglobulin)J Exp Med 121 ： 289-308)， 或 通 过 DNA 疫 苗 (Leitner 等 (2003)， 《基于 α 病毒的 DNA 疫苗激活内在抗病毒通路打破免疫耐受》 (Alphavirus-based DNA vaccine breaks immunological tolerance by activating innate antiviral Pathways)Nat Med 9 ： 33-39)。此外， 已鉴定多种参与自身耐受的特定基因和细胞机制， 破 坏它们将打破耐受和自身免疫病 (Goodnow(2007)， 《免疫疾病发生的多个步骤》 (Multistep pathogenesis of autoimmune disease)Cell 130 ： 25-35 ； Hill 等 (2008)， 《自身免疫病遗传学基础的进展》 (Recent acquisitions on the genetic basis of autoimmune disease) Front Biosci 13 ： 4838-4851)。尽管取得了这些进展， 但是设计有效免疫疗法的进程依 旧缓慢， 比如仅有少数癌症治疗疫苗处于临床开发的晚期 (Small 等 (2006)《转移性、 无 症状、 激素难治性前列腺癌病人中使用 sipuleucel-T(APC8015) 进行的安慰剂控制的 III 期 免 疫 治 疗 实 验》 (Placebo controlled phase III trial of immunologic therapy with sipuleucel-T (APC8015)in patients with metastatic， asymptomatic hormone refractory prostate cancer)J Clin Oncol 24 ： 3089-3094 ； Schlom 等 (2007)《 ，癌症的疫 苗疗法 ： 生物学及实践》 (Role of vaccine therapy in cancer ： biology and practice) Curr Oncol 14 ： 238-245)。
     硝基芳基具有高度免疫原性， 可能由于其形成强大堆叠和范德华相互作用的能 力。事实上， 含有二硝基苯基团的自体癌症细胞的非特异性衍生化在黑色素瘤病人中用 作疫苗 (Berd， D.(2004)“M-Vax ： an autologous， hapten-modified vaccine for human cancer” Expert Rev Vaccines 3 ： 521-527)， 并且生理学中 3’ - 硝基酪氨酸的形成参与多种 自身免疫病的病理中 (Aulak 等 (2001)， 《蛋白质组方法鉴定炎症刺激过程中体内硝化的蛋 白质》 (Proteomic method identifies proteins nitrated in vivo during inflammatory challenge)Proc Natl Acad Sci U S A 98 ： 12056-12061 ； Pacher 等 (2007)， 《一氧化氮 和过氧亚硝基阴离子与健康和疾病》 (Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease)Physiol Rev 87 ： 315-424 ； Hardy 等 (2008)， 《在 TCR 或 MHC 接触位置将酪氨酸 转化为炎症相关类似物 3’ - 硝基酪氨酸可以充分影响 CD8T 细胞对 MHC I 类限制性的淋 巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒糖蛋白抗原表位的识别》 (Conversion of tyrosine to the inflammation-associated analog 3′ -nitrotyrosine at either TCR-or MHC-contact positions can profoundly affect recognition of the MHC class I-restricted epitope of lymphocytic choriomeningitis virus glycoprotein 33 by CD 8T cells) J Immunol 180 ： 5956-5962)。为了测试该免疫原性基团是否可用于打破对于特定自身蛋 白质的耐受， 我们首先在鼠 TNFα 的单一位点引入对 - 硝基苯丙氨酸 (pNO 2Phe) 残基。使 用遗传学方法将 mTNFα 的 Tyr86 取代为 pNO2Phe， 增强了 T 细胞帮助诱导针对疾病相关 自身蛋白质的强烈交叉反应抗体应答 (Grunewald， J. 等 (2008)， 《自身耐受的免疫化学终 止》 (Immunochemical termination of self-tolerance)Proc Natl Acad Sci U S A 105 ： 11276-11280)。 本文中， 我们显示免疫化学打破自身耐受引起持续的高滴度抗御应答， 有效 保护小鼠对抗脂多糖 (LPS) 的刺激。而且， 我们显示该方法可一般化至免疫功能无关的自 身蛋白质， 名为视黄醇结合蛋白质 4(RBP4)。
     pNO2Phe- 诱导打破自身耐受的机制研究
     之前我们显示了用 pNO2Phe 取代 mTNFαTyr86 引起针对野生型 (WT) 蛋白质的 高滴度的交叉反应抗体应答。显示突变蛋白可在免疫动物中诱导 T 细胞增殖， 尽管 WT 蛋 白质不能诱导 (Grunewald， J. 等 (2008)， 《自身耐受的免疫化学终止》 (Immunochemical termination of self-tolerance)Proc Natl Acad Sci U S A 105 ： 11276-11280)。为 了提供对抗 pNO2Phe TNFα 的 T 细胞依赖的免疫应答的更多证据， 我们用抗 - 小鼠 IgM 或 抗 - 小鼠 IgG 第二抗体对进行 mTNFα， 自身抗体进行 ELISA 分析。pNO2Phe86 mTNFα 免疫 Bcl-2 小鼠血清中抗 -mTNFα 自身抗体主要是 IgG 亚型， 表明 T 细胞介导的免疫球蛋白类型转换 ( 图 16A)。为了确定 pNO2Phe 的存在对于整个免疫过程是否重要， 我们首先用完全弗 86 氏佐剂 (CFA) 中的 pNO2Phe mTNFα 注射 4 只小鼠， 然后用不完全弗氏佐剂 (IFA) 中的 WT 86 mTNFα 或 pNO2Phe mTNFα 进行 7 次注射。图 20 的结果清楚表明， 相对于 pNO2Phe86mTNFα， WT mTNFα 不能维持显著滴度的交叉反应性抗 -mTNFα 抗体。该结果支持了 pNO2Phe- 诱导 的自身耐受需要硝基苯基介导的 T 细胞应答这异观点， 并且与之前关于 Tyr86Phe TNFα 突 变子无法诱导强烈免疫应答的研究相一致。
     一个关于 pNO2Phe- 诱导自身耐受打破相关机制的问题是抗体应答是否针对包含 pNO2Phe 的表位， 或者是否发生表位扩展， 引起对抗靶标蛋白质中多个表位的多克隆 IgG 应 86 答。为了回答这个问题， 用 pNO2Phe mTNFα 免疫 Bcl-2 小鼠产生 50 个 B 细胞杂交瘤， 经 过 ELISA 筛选鉴定这些克隆是否产生对抗 WT mTNFα 的抗体。然后我们测试这些单克隆抗 体 (mAbs) 与三个 mTNFα 片段组成集合的结合， 这些片段通过大肠杆菌表达， 分子量经过 MALDI TOF 验证 ( 图 21) ： N 末端片段 (aa 1-60)， 内部片段 (aa 61-100) 和 C 末端片段 (aa 101-156)。尽管该实验大范围家那到针对线性 ( 推测是连续的 )B 细胞表位的特异性， 我们 鉴定了 5 个 mAb(3L24， 5K19， 6J22， 7O1， 和 7F23) 结合于 N 末端片段， 1 个 mAb(1P19) 结合于 C 末端片段 ( 图 22)。显著的是， 没有 mAbs 结合原始免疫原的 pNO2Phe86 编码内部片段。因 此， 通过 pNO2Phe86mTNFα 免疫产生结合多于一个表位的抗体， 并且这些表位无需包括免疫 86 原中的 pNO2Phe 残基。来自 pNO2Phe mTNFα 免疫小鼠的多克隆 IgG 与天然 mTNFα 交叉反 应， Kd 值在纳摩尔范围 ( 图 16B)。总之， 这些结果进一步支持了通过简单在自身蛋白质中 插入 pNO2Phe 残基产生针对自身蛋白质的交叉反应中和抗体的假说。
     pNO2Phe 诱导抗体应答的持续性
     为了确定抗 -mTNFαIgG 抗体滴度的持续性， 我们用 pNO2Phe86mTNFα 免疫三只 Bcl-2 小鼠。在最后一次刺激注射后， 在规定时间点取血用 ELISA 分析抗 pNO2Phe86mTNFα。 显著的是， 抗体水平维持在大于 80％初始水平至少至少 40 周 ( 图 16C)， 之后处死小鼠。相 比之下， 之前一项基于用包含鸡卵清溶酶体 T 细胞表位的 mTNFα 进行免疫的抗 mTNFα 接 种研究中， 最后一次刺激 4 周后滴度下降， 26 周后 mTNFα 抗体滴度降低了 80-87％ (Dalum 等 (1999)， 《抗 TFNα 免 疫 诱 导 治 疗 性 抗 体》 (Therapeutic antibodies elicited by immunization against TNF-alpha)Nat Biotechnol 17 ： 666-669)。 因此， 我们基于 pNO2Phe 的疫苗方案能够有效诱导对抗作为疾病相关自身抗原的 TNFα 的持续免疫并产生长期保 护。
     将突变扩展至 mTNFα 其它表面位点
     为了检验 pNO2Phe 诱导的自身耐受的打破的通用性， 将 mTNFα 的另外 4 个表面暴 11 21 42 49 露残基突变为 pNO2Phe ： Lys 、 Gln 、 Asp 和 Val ( 图 23A)。这些残基的结构也与对 - 硝基 苯丙氨酸不同。 在 SDS-PAGE 和质谱确认 pNO2Phe11mTNFα、 pNO2Phe21mTNFα、 pNO2Phe42mTNFα 和 pNO2Phe49mTNFα 的组成和均一性之后 ( 图 23B 和表 3)， 大小排阻色谱显示蛋白质的四 级结构为三聚体 ( 表 4)。而且， NFκB- 荧光素酶报道基因实验显示 pNO2Phe11mTNFα 活性 为 WTmTNFα 的 9％、 pNO2Phe21mTNFα 活性为 WT mTNFα 的 22％、 pNO2Phe42mTNFα 活性为 WT mTNFα 的 22％和 pNO2Phe49mTNFα 活性为 WT mTNFα 的 10％ ( 表 4 和图 23C)。因此所有 突变子的活性显著高于之前表征的 pNO2Phe86mTNFα， 在实验中它仅相当于野生型蛋白质活 性的 2％。 为了测定 pNO2PhemTNFα 突变子的免疫原性， 14 只 C57BL/6 小鼠分为五组并分别注射这些突变子或 WT mTNFα， 所用方案为 RIMMS( 多位点重复免疫 ) 方案 (Kilpatrick 等 (1997)， 《使用 RIMMS 快速开发亲和成熟的单克隆抗体》 (Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS)Hybridoma 16 ： 381-389)。 ELISA 分析表明 NFκB- 荧光素酶报道基因实验中的 mTNFα 活性与诱导抗体应答的能力无关， 排除了对于 免疫系统的直接影响。如图 17 所示， 11 位的 pNO2Phe 诱导对抗 WT mTNFα 的高滴度的 IgG 11 应答， 与对抗 pNO2Phe mTNFα 免疫原的相当。相比之下， 尽管 21、 42 和 49 位的突变也产生 了对抗含 pNO2Phe 抗原的高滴度 IgG 应答， 但是 IgG 抗体仅与 WT mTNFα 产生微弱的交叉反 应。 针对四个突变抗体 TNFα 产生的抗体用于对四十只 C57BL/6 小鼠进行主动免疫， 将小鼠 随机分为 5 组， 并用抗 -pNO2Phe 或抗 -WT mTNFαIgG 进行注射。主动免疫后 24 小时， 如前 所述用 LPS 刺激动物 (Niessen 等 (2008)， 《树突细胞 PAR1-S1P3 信号通路与凝血和炎症相 关》 (Dendritic cell PAR1-S1P3 signalling couples coagulation and inflammation) Nature 452 ： 654-658)。 在致死量的 LPS 刺激下， 所有接受抗 -pNO2Phe11mTNFαIgG 的小鼠均 存活 ( 图 18). 即便是接受中度交叉反应的抗 -pNO2Phe21mTNFαIgG、 抗 -pNO2Phe42mTNFαIgG 和抗 -pNO2Phe49mTNFαIgG 的其它组， 存活率也至少为 75％ ； 然而注射抗 -WTmTNFαIgG 小 鼠的存活率仅为 13％。因此， 使用 pNO2Phethe 打破自身耐受的能力不取决于单一氨基酸位 置， 因为我们显示至少 5 个位置 ( 包括 86 位 ) 可在体内诱导抗 -mTNFαIgG 应答的中和性 交叉反应。而且， 取代位点无需与对 - 硝基苯丙氨酸的结构相似。
     表3： mRBP4 变体的 ESI 质谱分析
     (n.d.， 未检测 ) 表4： mTNFα 变体的四级结构测定和 NF-κB- 荧光素酶活性分析突变 mRBP4 蛋白质的表达和表征
     既然当将 mTNFα 内多个位置突变为 pNO2Phe 时可以打破自身耐受， 于是我们考虑 是否能将该方法推广到其它自身蛋白质。 具体说， 我们检测了 pNO2Phe 打破对抗另一血清自 身蛋白质 RBP4 模型自身耐受的能力 (Zanotti 等 (2004)， 《血浆视黄醇结合蛋白 ： 结构以及 与视黄醇、 维生素 A 和甲状腺素转运蛋白的相互作用》 (Plasma retinol-binding protein ： structure and interactions with retinol， retinoids， and transthyretin)Vitam Horm 69 ： 271-295 ； Raghu 等 (2004)， 《血浆视黄醇结合蛋白， 甲状腺素转运蛋白与其配体的相互 作用 ： 在维生素 A 的平衡， 甲状腺素转运蛋白淀粉样变性的影响》 (Interactions amongst transthyretin and their ligands ： implications in plasma retinol-binding protein， vitamin A homeostasis and transthyretin amyloidosis)Biochim Biophys Acta 1703 ： 1-9)。与 TNFα 相比， 这是一个高度可溶、 分子量相对较低 (20kDa) 的单体蛋白质。RBP4 敲除小鼠除了视力缺陷外未显示表型异常 (Vogel 等 (2002)， 《视黄醇结合蛋白缺陷小鼠 ： 视力受损的生化基础》 (Retinol-binding protein-deficient mice ： biochemical basis for impaired vision)Biochemistry 41 ： 15360-15368)， 表明小鼠在针对自身 RBP4 的中 和免疫应答中可以存活。基于人单体 RBP4 的 X 射线晶体结构 (Cowan 等 (1990)， 《以 2A 分 辨率晶体细化人血清视黄醇结合蛋白》 (Crystallographic refinement of human serum retinol binding protein at 2A resolution)Proteins 8 ： 44-61)， 我们选择如下表面 43 108 暴露残基突变为 pNO2Phe ： Tyr 和 Tyr ( 图 24)。这些残基在不同哺乳动物的 RBP4 中高 度保守， 包括鼠 RBP4(mRBP4)。将这些 mRBP4 突变子以及 WT mRBP4 在大肠杆菌中以 N- 末 端 His6- 标签蛋白质表达， 在变性条件下用 Ni2+ 亲和色谱纯化， 并按照前述实验方案进行 再折叠 (Greene 等 (2001)， 《保守残基在结构和稳定性中的角色 ： 人血清视黄醇结合蛋白 的色胺酸， 脂质运载蛋白超家族模型》 (Role of conserved residues in structure and stability ： tryptophans of human serum retinol-binding protein， a model for the lipocalin superfamily)Protein Sci 10 ： 2301-2316)。SDS-PAGE 分析以及对含非天然 氨基酸的胰蛋白酶解 MS/MS 片段化， 确认了 pNO2Phe 定点掺入 mRBP4 的 43 和 108 位点 ( 图 24， 25 和 27)。分析型大小排阻色谱表明所有 mRBP4 蛋白质为单体结构， 这与已经发表的人 RBP4 的四级结构一致 ( 表 5)(Cowan 等 (1990)， 《以 2A 分辨率晶体细化人血清视黄醇结合 蛋白》 (Crystallographic refinement of human serum retinol binding protein at 2A resolution)Proteins 8 ： 44-61)。而且， 根据视黄醇替换实验， 所有的 pNO2PhemRBP4 突变 子与视黄醇结合的 Kd 值在纳摩尔范围， 这与 WT mRBP4 非常一致 ( 表 5)。
     表5： mRBP4 蛋白质四级结构测定和视黄醇结合亲和力
     用蛋白质标准品分子量的对数值相对 Superdex 75 10/300GL 柱上的保留时间作 图， 确定 pNO2Phe43mRBP4、 pNO2Phe108mRBP4 和 WT mRBP4 的四级结构。用 TR-FRET 视黄醇结合 实验确定 mRBP4 蛋白质的结合亲和力。
     pNO2Phe- 诱导打破自身耐受的通用性
     为了检测 pNO2Phe mRBP4 突变子的免疫原性， 将 12 只 Bcl2 小鼠随机分为 4 组， 按 43 108 照 RIMMS 方案用 pNO2Phe mRBP4、 pNO2Phe mRBP4 和 WT mRBP4 注射。( 参见 Kilpatrick 等 (1997)， 《使用 RIMMS 快速开发亲和成熟单克隆抗体》 (Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS)Hybridoma 16 ： 381-389)。根据 ELISA 分 108 析， 用 WT mRBP4 或 pNO2Phe mRBP4 免疫的小鼠没有产生对抗 WT mRBP4 的显著血清 IgG 滴 度 ( 图 19A)。相比之下， 用 pNO2Phe43mRBP4 免疫的小鼠显示显著高的血清 IgG 滴度 ( 直至
     1 ∶ 100,000)， 与 pNO2Phe43mRBP4 免疫原和野生型蛋白质均产生结合。 使用 C57BL/6 小鼠得 86 到相似结果 ( 图 26)。而且， 根据之前使用 pNO2Phe mTNFα 的观察， 用 pNO2Phe43mRBP4 蛋白 质进行免疫诱导 pNO2Phe43mRBP4 特异性 CD4+T 细胞， 表明成熟 T 细胞 - 依赖的免疫应答 ( 图 19B)。总之， 这些结果进一步支持了在蛋白质序列中引入 pNO2Phe 创造强 T 细胞表位， 从而 起始了持续性交叉反映 IgG 抗体应答的假说。并非所有的位点都引起强交叉反应性免疫应 答， 这并不让人吃惊， 因为不可能所有位点均对应潜在的 T 细胞表位。
     我 们 显 示 用 遗 传 学 方 法 引 入 pNO2Phe 引 起 持 续 的 对 抗 自 身 蛋 白 质 mTNFα 和 mRBP4 的 IgG 抗体应答。机制方面， 在单一位点掺入对 - 硝基苯基得到可被 pNO2Phe 突 变子刺激而不能被 WT 蛋白刺激的 T 细胞。这种 pNO2Phe 诱导的 T 细胞依赖的应答最终 引起自激活 B 细胞的活化， 并产生与天然自身蛋白质高度交叉反应的多克隆抗体。这些 结果与最近关于翻译后修饰蛋白质可增强 T 细胞应答性的研究是可相比较的 (Cantaert 等 (2006)， 《瓜氨酸蛋白在类风湿关节炎 ： 关键 … 但还不够！ 》 (Citrullinated proteins in rheumatoid arthritis ： crucial… but not sufficient ！ )Arthritis Rheum 54 ： 3381-3389 ； Backlund 等 (2002)《人源化的转基因小鼠和类风湿关节炎中选择优势 T 细 胞特异性Ⅱ型胶原蛋白的糖化抗原 (263-270)》 (Predominant selection of T cells specific for the glycosylated collagen type II epitope(263-270)in humanized transgenic mice and in rheumatoid arthritis)Proc Natl Acad Sci U S A 99 ： 9960-9965 ； Dzhambazov 等 (2005)， 《II 型胶原蛋白上的主要 T 细胞表位在正常软骨中 被糖基化， 但在大鼠和人类的关节炎中被修饰》 (The major T cell epitope on type II collagen is glycosylated in normal cartilage but modified by arthritis in both rats and humans)Eur J Immunol 35 ： 357-366)。例如， 瓜氨酸化和糖基化是 T 细 胞依赖性自身免疫病中所涉及的翻译后修饰 (Cantaert 等 (2006)， 《瓜氨酸蛋白在类风 湿关节炎 ： 关键 … 但还不够！ 》 (Citrullinated proteins in rheumatoid arthritis ： crucial…but not sufficient ！ )Arthritis Rheum 54 ： 3381-3389 ； Backlund 等 (2002)《人源化的转基因小鼠和类风湿关节炎中选择优势 T 细胞特异性Ⅱ型胶原蛋白的糖化抗 原 (263-270)》 (Predominant selection of T cells specific for the glycosylated collagen type II epitope(263-270)in humanized transgenic mice and in rheumatoid arthritis)Proc Natl Acad Sci U S A 99 ： 9960-9965 ； Dzhambazov 等 (2005)， 《II 型 胶原蛋白上的主要 T 细胞表位在正常软骨中被糖基化， 但在大鼠和人类的关节炎中被修 饰》 (The major T cell epitope on type II collagen is glycosylated in normal cartilage but modified by arthritis in both rats and humans)Eur J Immunol 35 ： 357-366)。357-366 ； Zhang 等 (2008)， 《类风湿关节炎中对瓜氨酸化蛋白的免疫》 (Immunity to citrullinated proteins in rheumatoid arthritis)Annu Rev Immunol 26 ： 651-675 ； Sollid， L.M.(2000)， 《乳糜泻的分子基础》 (Molecular basis of celiac disease)Annu Rev Immunol 18 ： 53-81)。 相似的， 皮肤抗原的二硝基氟苯修饰作为过敏接触的 T 细胞应答 模型已用了数十年 (Toews 等 (1980) 《表皮郎格汉斯细胞细胞密度决定用 DNFB 皮肤染色后 是否哕接触过敏或反应迟钝》 (Epidermal Langerhans cell density determines whether contact hypersensitivity or unresponsiveness follows skin painting with DNFB)J Immunol 124 ： 445-453)。因此将 pNO2Phe 定点掺入自身蛋白质建立了一个简单的模型系统 通过生化方法模拟翻译后或化学介导的自身耐受丧失。 因此该方法也有助于理解在自身免 疫过程中免疫系统如何对化学修饰抗原产生免疫应答。 而且， pNO2Phe 诱导的自身耐受的打 破不仅作为产生对抗癌症或退行性疾病相关病理性自身蛋白质的中和抗体的有效方法， 也 可应用于感染物的弱免疫性外来抗原。
     细菌菌株和试剂
     大肠杆菌 XL1-Blue 和 XL10-Gold 用作克隆宿主， 大肠杆菌 BL21(DE3) 用作表达菌 株。 限制性酶、 T4 DNA 连接酶、 dNTP 和 Xa 因子蛋白酶获自 NEB( 美国麻省比佛利 )(Beverly， MA， USA)。引物购自整合 DNA 技术公司 (Integrated DNA Technologies)( 科尔维尔， 美 TM 国衣阿华州 )。使用 PureLink Quick 质粒小抽试剂盒 ( 英峻公司 ) 制备质粒 DNA， 使用 TM PureLink PCR 微型试剂盒 ( 英峻公司 ) 进行限制酶消化后的 DNA 纯化。
     含 pNO2Phe 的 mTNFα 和 WT mTNFα 的生产
     如前所述产生 WT mTNFα 和 pNO2Phe mTNFα 突变子 (Grunewald， J 等 (2008)， 《自 身耐受的免疫化学终止》 (Immunochemical termination of self-tolerance)Proc Natl Acad Sci U S A 105 ： 11276-11280)。 简单说， 使用标准 PCR 诱变步骤引入 TAG 琥珀密码子， 从而将 pNO2Phe 定点掺入鼠 TNFα 基因。 为了表达 pNO2Phe mTNFα 突变子， 用 mutNO2PheRS、 mutRNACUA 和突变的 mTNFα 基因共同转化大肠杆菌 BL21(DE3) 细胞。转化细胞 37 ℃培养 于含 1mMpNO2Phe( 阿尔法阿萨尔公司， 沃德山， 麻省 )(Alfa Aesar， Ward Hill， MA)、 1％甘 油和 0.3mM 亮氨酸的极限培养基中 (GMML 培养基 )， 加入 1mM IPTG 启动蛋白表达。在不含 pNO2Phe 的 2x YT 培养基中表达 WT mTNFα。在天然或者变性条件下， 通过固化金属亲和色 谱 (IMAC) 和大小排阻色谱 (SEC) 纯化蛋白。用 MALDI-TOF 或 ESI 质谱对所有蛋白进行表 征。胰蛋白酶胶内硝化以及对包含非天然氨基酸的各自酶解片段的 MS/MS 片段华也炎症了 pNO2Phe 成功掺入突变蛋白质。在伯乐凝胶渗入分子量标准品 ( 拨了实验室， 埃库莱斯， 加 州 )(Bio-Rad Labs， Hercules， CA) 校正的 Superdex 75 10/300GL 凝胶渗入柱上， 通过分析 型 SEC 分析蛋白质的四级结构。如前所述使用稳定表达 NFκB- 荧光素酶的 HEK293 细胞，通过 NFκB- 荧光素酶报告基因实验确定 pNO2Phe mTNFα 突变子的活性 (Grunewald， J等 (2008)， 《自身耐受的免疫化学终止》 (Immunochemical termination of self-tolerance) Proc Natl Acad Sci U S A 105 ： 11276-11280)。
     构建 mRBP4 表达载体 pSpeedET-mRBP4
     使用聚合酶不完全引物延伸 (PIPE) 克隆法特制引物， 通过 PCR 扩增鼠 RBP4 编码 cDNA(aa 19-201)( 诺华研究基金基因组研究所 )(Genomics Institute of the Novartis Research Foundation)(Klock 等 (2008)， 《用于克隆和诱变的聚合酶不完全引物延伸法 组合微型筛选加速结构基因组研究》 (Combining the polymerase incomplete primer extension method for cloning and mutagenesis with microscreening to accelerate structural genomics efforts)Proteins 71 ： 982-994) ： 5’ -CTGTACTTCCAGGGCGAGCGCGACT GCAGGG(5’ 插入正向引物 ) 以及 5’ CAAACTGTTTCTGGAGGGCC(3’ 插 入反向引物 )。使用 5’ 载体反向引物 5’ -GCCCTGGAAGTACAGGTTTTCGTGATGATGATGATGATG 和 3’ 载体正向引物 5’ AACTCGTTTAAACGGTCTCCAGC。下划线和斜体 碱基表示引物间发生退火的两个不同的互补区域。pSpeedET 载体附加 N- 末端 His6- 标签 序列 (MGSDKIHHHHHH)， 后随 TEV 蛋白酶位点 (ENLYFQG)， 后面紧接 mRBP4 的第 19 个密码子。 未纯化的 mRBP4(aa 19-201) 插入物 PCR 产物与未纯化的 pSpeedET 载体 PCR 产物 1 ∶ 1(v/ v) 混合。混合后， 用 2μL 反应混合物转化 XL10-Gold 细胞。通过将 Tyr43 或 Tyr108 的密 码子突变为 TAG 琥珀密码子， 将 pNO2Phe 定点掺入 mRBP4(aa 19-201)。通过 DNA 序列分析 确认所有 pSpeedET-mRBP4 构建物的序列。
     pNO2Phe mRBP4 和 WT mRBP4 的蛋白质表达和纯化
     为了表达 pNOPhe mRBP4 突变子， 用 mutNO2PheRS、 mutRNACUA 和突变的 mRBP4 基因共 同转化大肠杆菌 BL21(DE3) 细胞。转化菌株生长于 37℃含 1mM pNO2Phe 的 GMML 培养基中， 当 OD600 到达 0.5 时， 用 0.2％ (w/v) 阿拉伯糖诱导， 并在 12-16 小时后收集。 相对于 pNO2Phe mRBP4 突变子， WT mRBP4 在不含 pNO2Phe 的 2x YT 培养基中培养 3 小时。将细胞团块重悬 于含 NaH2PO4， 10mM Tris(pH 8.0) 的 8M 尿素中， 并在冰上超声裂解 3 分钟。在 40,000x g 离心 25 分钟去除细胞碎片。在上清中加入 5ml 50％ Ni-NTA 泥浆 ( 诺瓦基公司， 威斯康星 州麦迪逊 ) 中， 振荡 60 分钟轻柔混合。用 8M 尿素， 100mM NaH2PO4， 和 10mM Tris(pH 6.3) 洗涤 Ni-NTA 珠子。用含 100mM NaH2PO4， 和 10mM Tris(pH 4.5) 的 8M 尿素进行洗脱。用 10L 分子量截留 Amicon Ultra-15 离心过滤装置进行蛋白浓缩 ( 密理博， 贝德福德， 麻省， 美国 )。相对磷酸缓冲盐水 (PBS， pH 7.4) 进行透析沉淀 mRBP4 蛋白质， 并用含 20mM Tris 和 20mM 二硫苏糖醇 (pH 8.0) 的 8M 尿素进行溶解。按照 Greene 等 (2001)， 《保守残基在结 构和稳定性中的角色 ： 人血清视黄醇结合蛋白的色胺酸， 脂质运载蛋白超家族模型》 (Role of conserved residues in structure and stability ： tryptophans of human serum retinol-binding protein， a model for the lipocalin superfamily)Protein Sci 10 ： 2301-2316) 所述进行 mRBP4 蛋白质体外再折叠。 简单说， 将变性材料加入 8M 尿素产生天然 蛋白质， 然后以～ 30 滴 / 分钟的速度逐滴加入到含 20mM Tris、 10mM β- 巯基乙醇、 1mM 2， 2′ - 二硫二乙醇， 和 1％甘油 (pH 8.5) 的折叠缓冲液中。折叠在 4℃进行 16h， 用 10L 分子 量截留 Amicon Ultra-15 离心过滤装置进行蛋白溶液浓缩 ( 密理博 )。以 0.3ml/min 的流 速在 PBS(pH 7.4) 平衡的 Superdex 7510/300GL 柱上 (GE 健康护理公司， 新泽西州皮斯卡塔韦 ) 通过 SEC 进一步纯化蛋白。
     严重全身性炎症的小鼠模型
     所有实验均按照国立卫生研究院动物保护指南 (National Institutes of Health Animal Protection Guidelines) 进行， 并经过斯克力普研究院动物护理和使用委员会 批准。所有动物实验均在 12 小时昼夜交替的室内、 稳定条件 ( 温度 20-22 ℃和相对湿度 40-60 ％ ) 下进行 (Niessen 等 (2008)， 《树突细胞 PAR1-S1P3 信号通路与凝血和炎症相 关》 (Dendritic cell PARl-S1P3 signalling couples coagulation and inflammation) Nature 452 ： 654-658)。LPS 刺激前 24 小时， 将纯化自 pNO2Phe11mTNFα、 pNO2Phe21mTNFα、 pNO2Phe42mTNFα 和 pNO2Phe49mTNFα 免 疫 小 鼠 血 清 的 IgG 以 4mg/kg 注 射 入 9 周 龄 雄 性 C57BL/6 小鼠 ( 杰克逊实验室， 巴尔哈伯， 缅因州 ) 左侧腹腔进行主动免疫， 来自非免疫野生 型小鼠的 IgG 作为阴性对照。 用 7.5mg/kg 脂多糖 (LPS， 大肠杆菌 O111:B4 卡尔生化 /EMD 生 物科学公司， 加利福尼亚州拉霍亚 )(LPS， E.coli O111:B4 Calbiochem/EMD Biosciences， La Jolla， CA) 注射 2％异氟烷麻醉小鼠的右侧腹腔。作 Kaplan-Meier 曲线进行统计， 并用 对数秩检验加邦费罗尼校正 (Bonferroni correction) 分析存活差异。
     ELISA
     用 30μl 0.5μg/ml 蛋白质包被高吸附 384- 孔板 ( 朗可公司， 新泽西州罗彻斯 特 )(Nunc， Rochester， NY)4℃过夜。用 PBS+0.05％吐温 20(PBST) 洗涤后， 用 80μl 含 1％ BSA 的 PBS 封闭并再次用 PBST 冲洗。依次将板与 20μl 第一抗体或用含 1 ％ BSA 的 PBS 稀释的血清， 20μl HRP- 偶联的山羊抗小鼠 IgG( 杰克逊免疫研究实验室， 西格罗韦， 宾夕 法尼亚州 )(Jackson ImmunoResearch Laboratories， West Grove， PA) 和 20μl TMB 底物 (KPL， 盖瑟斯堡， 马里兰州 )(KPL， Gaithersburg， MD) 孵育， 并测量 650nm 吸收。孵育间用 PBST 洗板至少 6 次。
     T 细胞增殖实验
     通 过 使 用 MACS 珠 子 ( 美 天 旎 生 物 技 术 公 司， 奥 本， 加 州 )(Miltenyi Biotec， Auburn， CA) 的磁性消耗从免疫的 C57BL/6 小鼠的淋巴结分离 CD4+T 细胞。然后将 T 细胞放 置与来自天然 C57BL/6 小鼠的辐射的脾细胞以及数量递增的抗原一起培养。孵育 48 小时 后， 与 3H- 胸苷孵育培养过夜。收集培养板置于滤纸垫上， 并用 TopCount 闪烁计数仪 ( 珀 金埃尔默公司。波士顿， 麻省 )((PerkinElmer， Boston， MA) 进行定量。
     鼠 RBP4 活性实验
     根据厂商指导， 使用 N- 羟基硫代琥珀酰亚胺 - 生物素试剂盒 ( 皮尔斯公司， 罗克 福德， 伊利诺州美国 )(Pierce， Rockford， IL， USA) 用生物素标记 WT 和 pNO2Phe mRBP4 突变 蛋白质。为了测定视黄醇结合活性， 10nM 生物素 - 标记的 RBP4 与 1nM 链霉亲和素铕螯合物 (LANCE Eu-W8044 链霉亲合素， 珀金埃尔默公司， 福斯特城， 加州 )(Perkin Elmer， Foster City， CA) 混合。将浓度增加的 Cy5- 标记的视黄醇加入反应， 通过均相时间分辨荧光共振 能量转移 (TR-FRET) 测定视黄醇结合。
     免疫并产生单克隆抗体 (mAb)
     纯化的 WT 或 pNO2Phe mTNFα 用作免疫原产生抗 -mTNFα 抗体。使用 RIMMS 方案 免疫 Bcl-2 转基因小鼠 (C57BL/6-TgN(BCL2)22Wehi) 或 C57BL/6 小鼠。( 参见 Kilpatrick 等 (1997)， 《使用 RIMMS 快速开发亲和成熟单克隆抗体》 (Rapid development of affinitymatured monoclonal antibodies using RIMMS)Hybridoma 16 ： 381-389)。Bcl-2 转基因 小鼠表现出 B 细胞生存延长和滤泡淋巴增殖， 使其尤其适合免疫。简单说 18 天对小鼠进 行 8 次注射。每次注射中， 含 5μg 蛋白质的 200μl PBS 与完全弗氏佐剂 (CFA)1 ∶ 1 混合 ( 用作首次注射 )， 或与不完全弗氏佐剂 (IFA)1 ∶ 1 混合 ( 用于剩下的注射 )。在外周淋巴 结 (PLN) 周 6 个特性位点周围进行免疫原注射。在进行第 8 次注射当天， 收集测试血液， 用 ELISA 分析血清抗体滴度。收集并分离来自高血清滴度小鼠的 PLN。用 50％ PEG 1500 将分 离的淋巴细胞与 F0 小鼠骨髓瘤细胞融合。将融合的细胞种植于 384- 孔组织培养板。在次 黄嘌呤氨蝶呤胸苷 (HAT) 培养基中选择杂交瘤， 并用 ELISA 筛选抗 WT mTNFα。
     实施例 2 相关附图中所示结果的解释。
     图 16 显示了测定 pNO2Phe86mTNFα 免疫是否促进类型转换为 IgG 应答。显示小 鼠中 IgG 应答与 WT mTNFα 产生显著交叉反应性， 并持续至少 40 周。图 16A， 在存在完全 弗氏佐剂 (CFA) 的初始注射并在不完全弗氏佐剂 (IFA) 存在进行剩余注射的 17 天中测定 pNO2Phe86mTNFα 或 WT mTNFα 免疫的 Bcl-2 小鼠的血清滴度。用抗小鼠 IgM( 四根柱的每 一组的第一和第二根柱 ) 或抗小鼠 IgG( 四根柱的每一组的第三和第四根柱 ) 作为第二抗 体， 通过 ELISA 测定抗 WTmTNFα。 测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液 1/100( 第一和第三根 柱 ) 或 1/1,000( 第二和第四根柱 ) 稀释血清样品。图 16B 显示了 ELISA 滴定结果， 将多克 86 86 隆抗 -WT mTNFαIgG( 倒三角 ) 和多克隆抗 -pNO2Phe mTNFαIgG( 钻石 ) 对 pNO2Phe mTNFα 或 WT mTNFα 的亲和力进行了量化。图 16C 显示了 pNO2Phe86mTNFα 免疫的三只 Bcl-2 小 鼠中血清滴度的持续性。顺序用 pNO2Phe86mTNFα 进行 8 次免疫后， 在规定时间点取血进行 86 20 次抗 pNO2Phe ELISA 分析 (t 对应最后一次免疫和取血之间的时间 )。每次测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液 1 ∶ 100 稀释血清样品。每组 7 根柱的第一根是取血前， 第二根是 t ＝ 19 周， 第三根是 t ＝ 23 周， 第四根是 t ＝ 28 周， 第五根是 t ＝ 32 周， 第六根是 t ＝ 36 周， 第七根是 t ＝ 40 周。
     其 它 mTNFα 表 面 暴 露 位 点 也 具 有 显 著 的 免 疫 原 性。 在 图 17A 中 显 示 了 11 pNO2Phe mTNFα 或 WT mTNFα 免疫 C57BL/6 小鼠中抗 WT mTNFα( 每对柱的左边一根 )， pNO2Phe11mTNFα( 第 3、 4、 5 对柱的右边一根 ) 和 PBS(1、 2 对柱的右边一根 ) 的血清滴度。 21 在图 17B 中显示了 pNO2Phe mTNFα 或 WTmTNFα 免疫 C57BL/6 小鼠中抗 WT mTNFα( 每对柱 的左边一根 )， pNO2Phe21mTNFα( 第 6、 7、 8 对柱的右边一根 ) 和 PBS(1、 2 对柱的右边一根 ) 42 的血清滴度。在图 17C 中显示了 pNO2Phe mTNFα 或 WT mTNFα 免疫 C57BL/6 小鼠中抗 WT mTNFα( 每对柱的左边一根 )， pNO2Phe42mTNFα( 第 9、 10、 11 对柱的右边一根 ) 和 PBS(1、 2 对柱的诱变一根 ) 的血清滴度。在图 17D 中显示了 pNO2Phe49mTNFα 或 WT mTNFα 免疫 C57BL/6 小鼠中抗 WT mTNFα( 每对柱的左边一根 )， pNO2Phe49mTNFα( 第 12、 13、 14 对柱的 右边一根 ) 和 PBS(1、 2 对柱的诱变一根 ) 的血清滴度。每次测量前用含 1％ BSA 的 PBS 缓 冲液稀释血清样品 (17A)1/800 ； (17B)1/200 ； (17C)1/200 ； 或 (17D)1/200。
     结 果 表 明 11 位 的 pNO2Phe 诱 导 对 抗 WT mTNFα 的 高 滴 度 的 IgG 应 答， 与对抗 11 pNO2Phe mTNFα 免疫原的相当。相比之下， 尽管 21、 42 和 49 位的突变也产生了对抗含 pNO2Phe 抗原的高滴度 IgG 应答， 但是 IgG 抗体仅与 WTmTNFα 产生微弱的交叉反应。
     图 18 显示了脂多糖 (LPS) 刺激后用各种 pNO2Phe mTNFα 突变子免疫小鼠得到显 著的生存受益。在图 18A 中， LPS 刺激前一天， 用来自 pNO2Phe11mTNFα 和 pNO2Phe49mTNFα免疫小鼠的纯化 IgG 4mg/kg 对雄性 C57BL/6 小鼠进行腹膜内注射。在图 18B 中， LPS 刺激 21 42 前一天， 用来自 pNO2Phe mTNFα 和 pNO2Phe mTNFα 免疫小鼠的纯化 IgG 4mg/kg 对小鼠进 行腹膜内注射。这些小鼠相对注射对照 IgG 的小鼠进行 Kaplan-Meier 存活曲线作图 (n ＝ 8 组 )。对数秩检验加邦费罗尼校正 (Bonferroni correction) 分析可知， 每一修饰 TNF 免 疫的小鼠的存活优势相对对照组 p ＜ 0.01。
     在 致 死 量 的 LPS 刺 激 下，所 有 接 受 抗 -pNO2Phe11mTNFαIgG 的 小 鼠 均 存 活。 即 便 是 接 受 中 度 交 叉 反 应 的 抗 -pNO2Phe21mTNFαIgG、 抗 -pNO2Phe42mTNFαIgG 和 抗 -pNO2Phe49mTNFαIgG 的其它组， 存活率也至少为 75％ ； 然而注射抗 -WT mTNFαIgG 小鼠 的存活率仅为 13％。因此， 使用 pNO2Phe 打破自身耐受的能力不取决于单一氨基酸位置。
     图 19 显示了丧失对第二种自身抗原 mRBP4 的耐受。显示了用 WT mRBP4(19A)、 43 pNO2Phe mRBP4(19B)、 pNO2Phe108mRBP4(19C) 免疫 Bcl-2 小鼠的血清滴度。ELISA 测定抗 WT mRBP4(1、 2、 3、 7、 8 和 9 中的单柱 ； 4、 5、 6 每一对柱的左侧柱 ) 和 pNO2Phe43mRBP4(4、 5、 6 每一 对柱的右侧柱 )。 测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液 1 ∶ 1000 稀释血清样品。 图 19B 显示了 43 + 来自 pNO2Phe mRBP4 免疫的 C57BL/6 小鼠的 CD4 T 细胞在体外用梯度稀释的 pNO2Phe43mRBP4 刺激时的增殖。
     根据图 19A 中 ELISA 分析， 用 WT mRBP4 或 pNO2Phe108mRBP4 免疫的小鼠没有产生对 抗 WT mRBP4 的显著血清 IgG 滴度。相比之下， 用 pNO2Phe43mRBP4 免疫的小鼠显示显著高的 血清 IgG 滴度 ( 直至 1 ∶ 100,000)， 与 pNO2Phe43mRBP4 免疫原和野生型蛋白质均产生结合。
     图 20 显 示 了 WT mTNFα 不 能 维 持 pNO2Phe86mTNFα， 诱 导 耐 受 性 丧 失。 根 据 86 RIMMS 方 案，用 WT mTNFα(20A)、 pNO2Phe mTNFα(20B) 和 pNO2Phe86mTNFα 免 疫，后 随 mTNFα(20C) 免疫的 Bcl-2 小鼠的血清滴度。对于 (20C)， 免疫设计一次用 CFA 中的 86 pNO2Phe mTNFα 注射， 以及 7 次 IFA 中 WT mTNFα 的后续注射。ELISA 测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液 1 ∶ 1000 稀释血清样品。用 ELISA 测定抗 WT mTNFα( 每对柱的左侧柱 ) 或 pNO2Phe86mTNFα( 每对柱的右侧柱 )。相对于 pNO2Phe86mTNFα， WT mTNFα 不能维持交叉反 应性抗 -mTNFα 抗体的滴度。该结果支持了 pNO2Phe 诱导的自身耐受的打破需要硝基苯基 介导的 T 细胞应答这一观点。
     图 21 显示了三个 mTNFα 片段的质谱分析。图 21A 显示了 mTNFα 的 N 末端片段 (aa 1-60) 的 MALDI-TOF 质谱分析 ； 计算分子量 7776.51。图 21B 显示了 mTNFα 的内部片 段 (aa 61-100) 的 MALDI-TOF 质谱分析 ； 计算分子量 5597.36。图 21C 显示了 mTNFα 的 C 末端片段 (aa 101-156) 的 MALDI-TOF 质谱分析 ； 计算分子量 7388.18。图 21 中每一板块 的峰确认了每一 TNFa 片段均为预期分子量。
     对抗 -mTNFαmAb 与三个 mTNFα 片段的结合进行了测定。图 22 中， ELISA 测定 抗 WT mTNFαaa 1-156( 每组四根柱的第一根 ) 或 WT mTNFαaa 1-60( 每组四根柱的第二 根 )， WT mTNFαaa 61-100( 每组四根柱的第三根 ) 和 WT mTNFαaa 101-156( 每组四根柱 的第四根 )。从 pNO2Phe86mTNFα 免疫的小鼠中产生 50 个分泌抗 -mTNFαIgG 的杂交瘤。从 大肠杆菌中表达并纯化 mTNFα 的三个片段 ： N 末端片段 (aa 1-60)， 内部片段 (aa 61-100) 和 C 末端片段 (aa 101-156)。注意 ： 原始抗原中的第 86 位 ( 内部片段 ) 编码 pNO2Phe。用 ELISA 分析每一片段， 并使用 WT mTNFα 作为对照。与片段结合的抗体注明 ： 方块， N 末端片 段； 星号， C 末端片段 )。仅有 6 个 mAb 能明显识别一个片段。一个 mAb(6G17) 识别所有三个片段， 或者可能代表非特异性结合活性。 值得注意的是， 50 个 mAb 中没有可以识别对应中 间片段的线性表位， 该区域包含突变 TNFα 中的 pNO2Phe。
     图 23 显示了确认将 pNO2Phe 搀入 mTNFα 的表面暴露位点的实验结果。图 23A 提 供了 mTNFα 三聚体的 X- 射线晶体结构， 标明 Lys11、 Gln21、 Asp42、 Val49 和 Tyr86(PDB ID 编码 2TNF)30。参见 Baeyens 等 (1999)， 《1.4A 分辨率小鼠肿瘤坏死因子 α 的结构 ： 修饰其选择 性和三聚化》 (The structure of mouse tumour-necrosis factor at 1.4A resolution ： towards modulation of its selectivity and trimerization)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55 ： 772-8。图 23B 显示了 pNO2Phe11mTNFα( 第 1 泳道 )、 pNO2Phe19mTNFα( 第 2 泳道 )、 pNO2Phe21mTNFα( 第 3 泳道 )、 pNO2Phe42mTNFα( 第 4 泳道 )、 pNO2Phe49mTNFα( 第 5 泳道 ) 和 WT mTNFα( 第 6 泳道 ) 的 SDS-PAGE 凝胶分析。用 Ni-NTA 亲和色谱纯化蛋白质样 品， 在天然条件下用 SDS-PAGE 和考马斯 G-250 染色进行分析。 图 23C 提供了 WT mTNFα( 小 11 21 方块 )、 pNO2Phe mTNFα( 三角 )、 pNO2Phe mTNFα( 空心钻石 )、 pNO2Phe42mTNFα( 实心钻 石 )、 pNO2Phe49mTNFα( 圆圈 ) 和 pNO2Phe86mTNFα( 大方块 ) 的 NF-κB- 荧光素酶活性分析 结果。因此所有突变子的活性显著高于之前表征的 pNO2Phe86mTNFα， 在实验中它仅相当于 野生型蛋白质活性的 2％。
     图 24 显示了确认将 pNO2Phe 定点搀入 mRBP4 的暴露位点的实验结果。图 24A 提供 了人 RBP4 的 X- 射线晶体结构图解， 标明 Tyr43 和 Tyr108(PDB ID 编码 1RBP)21。参见 Cowan 等 (1990)《 ，以 2A 分辨率晶体细化人血清视黄醇结合蛋白》 (Crystallographic refinement of human serum retinol binding protein at 2A resolution)Proteins 8 ： 44-61)。 视黄 醇辅因子以黄色表示。 图 24B 显示了 Ni-NTA 亲和色谱和大小排阻色谱分析后对 WT mRBP4、 43 pNO2Phe mRBP4 和 pNO2Phe108mRBP4 的 SDS-PAGE 分析。图 24C 显示了存在 ( 第 1 泳道 ) 和 缺少 ( 第 2 泳道 )1mM pNO2Phe 的条件下 mRBP4 的 Tyr43 琥珀突变子的表达 ； 存在 ( 第 3 泳 108 道 ) 和缺少 ( 第 4 泳道 )1mM pNO2Phe 的条件下 mRBP4 的 Tyr 琥珀突变子的表达。这些结 果表明 pNO2Phe 以高度特异性掺入 mRBP 突变子。用 Ni-NTA 亲和色谱纯化蛋白质样品， 在 变性条件下用 SDS-PAGE 和考马斯 G-250 染色进行分析。第 5 泳道包含 WT mRBP4。
     图 25 显示了对于 pNO2Phe43mRBP4 和 pNO2Phe108mRBP4 胰蛋白酶解片段的 MS/MS 分析 与 pNO2Phe 的搀入模式相吻合。 图 25A 显示了 11 聚体片段 FSGLWXAIAKK 的串连质谱， 其中 X 43 代表 pNO2Phe。该片段通过胰蛋白酶消化 pNO2Phe mRBP4 产生。图 25B 显示了 12 聚体片段 MKXWGVASFLQR 的串连质谱， 其中 X 代表 pNO2Phe。 该片段通过胰蛋白酶消化 pNO2Phe108mRBP4 产生。含 pNO2Phe 的寡聚体的部分序列可从 b 或 y 离子系列读出。
     图 26 显示了确定 pNO2Phe43mRBP4 在 C57BL/6 小鼠中免疫原性的实验结果。图 26A 显示了 WT mRBP4 免疫的 C57BL/6 小鼠的抗 WT mRBP4 和 pNO2Phe43mRBP4 血清滴度。图 26B 显示了 pNO2Phe43mRBP4 免疫的 C57BL/6 小鼠的抗 WT mRBP4 和 pNO2Phe43mRBP4 血清滴度。 ELISA 测定抗 WTmRBP4(1-10 组第二和第一根柱 ) 或 pNO2Phe43mRBP4(6-10 组第四和第三根 柱 )。测量前， 用含 1％ BSA 的 PBS 缓冲液 1 ∶ 100 或 1 ∶ 1,000 稀释血清样品。
     根据这些 ELISA 分析， 用 WT mRBP4 或 pNO2Phe108mRBP4 免疫的小鼠没有产生对抗 WT mRBP4 的显著血清 IgG 滴度。相比之下， 用 pNO2Phe43mRBP4 免疫的小鼠显示显著高的血 清 IgG 滴度 ( 直至 1 ∶ 100,000)， 与 pNO2Phe43mRBP4 免疫原和野生型蛋白质均产生结合。
     图 27A 显示了 pNO2Phe43mRBP4 的含 pNO2Phe 的酶解片段的 MS/MS 测序结果。以单字母代买表示含 pNO2Phe 蛋白酶解片段的序列 (X ＝ pNO2Phe)。显示了观察到的 y 和 b 系列 的离子片段。红色标明关键的证明了 pNO2Phe 掺入的 y 和 b 离子。所有的质量以单一同位 素质量报告。图 27B 显示了 pNO2Phe108mRBP4 的含 pNO2Phe 的酶解片段的 MS/MS 测序结果。 以单字母代买表示含 pNO2Phe 蛋白酶解片段的序列 (X ＝ pNO2Phe)。显示了观察到的 y 和 b 系列的离子片段。证明 pNO2Phe 掺入的关键 y 和 b 离子是 b9、 b10、 y10、 y9、 y8、 y7 和 y6。所有 的质量以单一同位素质量报告。
     尽管已经出于清楚和理解的目的在一些细节中描述了本发明， 但是本领域技术人 员通过阅读该说明书可以很清楚地了解， 可以在不背离本发明真实范围的情况下进行各种 形式和细节的变化。例如， 上述所有的技术和设备都可以以各种组合联用。本申请中提到 的所有公开出版物、 专利、 专利申请或文献都通过引用全文纳入本文中， 相当于所述各单独 的公开出版物、 专利、 专利申请或文献都独立地通过引用纳入本文用于所有目的。