一种降解联苯菊酯的菌株及其应用 技术领域 本发明属于化学农药生物降解技术领域， 涉及一株对联苯菊酯具高效降解能力的 菌株及其应用， 用于联苯菊酯的生物降解， 以及该农药污染的水体， 土壤以及农产品的生物 修复和生物净化。
背景技术
拟除虫菊酯是目前使用量仅次于有机磷的一类杀虫剂， 为杀虫剂中的第二大类， 约占世界杀虫剂市场的 20％， 在我国的施用面积已占杀虫剂总施用面积的 1/3 以上。近年 来， 农药中毒事件及职业性中毒病例逐年增加。 曾一度被人们认为低毒、 使用安全的拟除虫 菊酯类农药， 近年来相关研究表明， 此类农药有蓄积毒性， 人长期接触会引起慢性疾病， 有 致癌、 致畸、 致突变的危险 ； 另外对鱼类， 蚌类等水生生物有很高的毒性。
联苯菊酯和其他拟除虫菊酯类农药一样， 残留在作物上然能引起人畜中毒， 严重 危害人的健康。世界各国及组织 ( 美国、 欧盟、 国际食品法典委员会 (CAC) 等 ) 都对联苯菊 酯制定了严格的限量标准。
由于联苯菊酯对光， 热稳定， 在环境中的半衰期较长， 在自然环境下难分解， 因此 用微生物降解自然环境和农产品中的农药具有重要意义， 特别是针对应用广泛的联苯菊酯 农药的高效降解菌株， 其应用价值和经济效益更为明显。 发明内容 本发明目的在于针对生产实践中的实际问题和需求， 提供一株对联苯菊酯具有高 效降解能力菌株。该菌株对联苯菊酯具有高效降解能力， 达 80％以上。本发明的另一目的 在于提供应用本发明菌株降解联苯菊酯农药的应用方法。
本发明的技术方案概述如下 ：
本发明提供一株对联苯菊酯具有高效降解能力的降解菌株， 该菌株为枯草芽孢杆 菌 (Bacillus Subtilis) 的菌株 LBK1 ； 所述菌株的 16SrDNA 序列为 SEQ ID ： NO.1。
所述的菌株的应用， 该菌株用于联苯菊酯农药的生物降解。
所 述 的 菌 株 的 应 用， 降解组合条件为 ： 温 度 25 ℃ -35 ℃， PH ＝ 6-8， 接种量 3％ -10％， 装液量 25-100ml。
所述的菌株的应用， 降解组合条件为 ： 温度 30 ℃， PH ＝ 7， 接种量 10 ％， 装液量 50ml。
该菌株生物学特性革兰氏阳性， 周生鞭毛， 杆状， 菌落呈乳白色圆点且表面光滑， 不能利用葡萄糖， 不能水解淀粉。 可以以联苯菊酯为唯一碳源。 该 接触酶、 产 H2S 反应阳性 ； 菌株在 4℃～ 40℃， pH 4.0 ～ 8.0 范围内均可生长。但是最适生长温度为 30℃， 最适生长 pH 为 7.0。该菌株对农药的耐受浓度为 0.6mg/L， 最适生长农药浓度为 0.1mg/L。该菌株在 72h 内对联苯菊酯的降解率可达 80％以上。
具体实施方式
以下结合具体实施例， 对本发明进行详细说明。
菌株的分离与筛选
土样 ： 采集与浙江省某农药厂。
所用培养基为 ： LB 培养基 (g/L) ： 蛋白胨 10.0g， 酵母膏 5.0g， Nacl5.0g。
基 础 盐 培 养 基 (g/L)NaCl 1.0g， NH4NO31.0g， K2HPO41.5g， KH2PO40.5g， MgSO4·7H2O0.1g， FeSO4·7H2O 0.01g， 蒸 1000mL， 调 pH7.0 左右。固体培养基 ： 向液体培养 基中加 2％的琼脂。
在无菌条件下向已装有 100ml 基础盐培养基的 250ml 锥形瓶中加入 10g 污泥， 内 含 50mg/L 联苯菊酯。于 30℃， 180r/min 震荡培养 7d 后， 按 10％的接种量转接到含 100mg/ L 联苯菊酯的基础盐培养基里， 同样条件培养 7d。以后每 7d 按 10％接种量进行驯化培养， 联苯菊酯浓度每次增加 50mg/L。直到提高联苯菊酯浓度为 400mg/L 后， 将培养液涂布在基 础盐固体培养基上， 选取生长快， 菌落规则， 传代稳定的单菌落， 划线培养 3 次后制成斜面， 保存于冰箱待用。
菌株生化鉴定
表 1 LBK1 菌株生理生化测定结果
菌株分子鉴定
LBK1 菌株经 16SrDNA 测定， 获得如下序列 SEQ ID ： NO.1 ：
TGTCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGT GTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCT TCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTG CCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTT CCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTT GCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGA CGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGC
TCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAA TGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGT ATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTG TTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTT CCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAAT AATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTA CCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATC ACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGG CCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCA CCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCA AACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACC CGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCA
测序结果在 NCBI 的 GeneBank 里进行 Blust 比对， 其结果与 Bacillus Subtilis strain BEF5314 同源性达到 98％， 因此 LBK1 在分子分类上鉴定为枯草芽孢杆菌 (Bacillus Subtilis)。
菌株的生物降解作用 ：
该菌的用途是降解联苯菊酯农药， 适用于农药污染的水体、 土壤及农产品的生物 修复或生物净化。
种子液的制备 ： 将 LBK1 菌株在无菌操作条件下用接种环挑取一环接种于 50ml LB 液体培养基中， 于 30℃、 摇床 120r/min 培养 48h。然后在 4000r/min 条件下离心 10min 收 集菌体， 并用 10ml 的 0.02mol/L Na2HPO4-KH2PO4 缓冲液洗涤 2 次， 再用同一缓冲液制成菌悬 液并调整菌体浓度使其 OD600 在 1.5 左右， 备用。
LBK1 对联苯菊酯的降解率的初步测定实验 ： 在基础盐液体培养基中添加联苯菊 酯标准溶液， 使其浓度为 200mg/L， 总体系为 50mL， 按 5％的接种量将种子液接入基础盐培 养液中， 30℃， 180r/min 摇床培养。以不接菌的培养液为空白对照， 每个处理设 3 个平行。
LBK1 对不同浓度联苯菊酯的降解 ： 在基础盐培养基中添加联苯菊酯标准溶液， 使 其浓度分别为 100、 200、 300、 400mg/L， 以 5％的接种量接入 LBK1， 于 30℃、 180r/min 的条件 下摇床培养。
LBK1 正交优化试验 ：
本实验考察温度、 pH 值、 接种量和装液量四个因素对 LBK1 降解联苯菊酯的影响。 采用四因素三水平正交实验方案， 根据 L9(34) 正交表， 进行正交试验。运用 SPSS 软件对各 因素的影响程度进行评估， 并给出最佳组合条件。最佳条件为 A2B2C3D2 即温度 30℃， PH ＝ 7， 接种量 10％， 装液量 50ml， 在此条件下降解率可达 95.92％。
测定结果如下 ：
表 2 LBK1 对联苯菊酯的降解
表 3 LBK1 对不同浓度联苯菊酯的降解
表 4 正交优化试验
背景技术
拟除虫菊酯是目前使用量仅次于有机磷的一类杀虫剂， 为杀虫剂中的第二大类， 约占世界杀虫剂市场的 20％， 在我国的施用面积已占杀虫剂总施用面积的 1/3 以上。近年 来， 农药中毒事件及职业性中毒病例逐年增加。 曾一度被人们认为低毒、 使用安全的拟除虫 菊酯类农药， 近年来相关研究表明， 此类农药有蓄积毒性， 人长期接触会引起慢性疾病， 有 致癌、 致畸、 致突变的危险 ； 另外对鱼类， 蚌类等水生生物有很高的毒性。
联苯菊酯和其他拟除虫菊酯类农药一样， 残留在作物上然能引起人畜中毒， 严重 危害人的健康。世界各国及组织 ( 美国、 欧盟、 国际食品法典委员会 (CAC) 等 ) 都对联苯菊 酯制定了严格的限量标准。
由于联苯菊酯对光， 热稳定， 在环境中的半衰期较长， 在自然环境下难分解， 因此 用微生物降解自然环境和农产品中的农药具有重要意义， 特别是针对应用广泛的联苯菊酯 农药的高效降解菌株， 其应用价值和经济效益更为明显。 发明内容 本发明目的在于针对生产实践中的实际问题和需求， 提供一株对联苯菊酯具有高 效降解能力菌株。该菌株对联苯菊酯具有高效降解能力， 达 80％以上。本发明的另一目的 在于提供应用本发明菌株降解联苯菊酯农药的应用方法。
本发明的技术方案概述如下 ：
本发明提供一株对联苯菊酯具有高效降解能力的降解菌株， 该菌株为枯草芽孢杆 菌 (Bacillus Subtilis) 的菌株 LBK1 ； 所述菌株的 16SrDNA 序列为 SEQ ID ： NO.1。
所述的菌株的应用， 该菌株用于联苯菊酯农药的生物降解。
所 述 的 菌 株 的 应 用， 降解组合条件为 ： 温 度 25 ℃ -35 ℃， PH ＝ 6-8， 接种量 3％ -10％， 装液量 25-100ml。
所述的菌株的应用， 降解组合条件为 ： 温度 30 ℃， PH ＝ 7， 接种量 10 ％， 装液量 50ml。
该菌株生物学特性革兰氏阳性， 周生鞭毛， 杆状， 菌落呈乳白色圆点且表面光滑， 不能利用葡萄糖， 不能水解淀粉。 可以以联苯菊酯为唯一碳源。 该 接触酶、 产 H2S 反应阳性 ； 菌株在 4℃～ 40℃， pH 4.0 ～ 8.0 范围内均可生长。但是最适生长温度为 30℃， 最适生长 pH 为 7.0。该菌株对农药的耐受浓度为 0.6mg/L， 最适生长农药浓度为 0.1mg/L。该菌株在 72h 内对联苯菊酯的降解率可达 80％以上。
具体实施方式
以下结合具体实施例， 对本发明进行详细说明。
菌株的分离与筛选
土样 ： 采集与浙江省某农药厂。
所用培养基为 ： LB 培养基 (g/L) ： 蛋白胨 10.0g， 酵母膏 5.0g， Nacl5.0g。
基 础 盐 培 养 基 (g/L)NaCl 1.0g， NH4NO31.0g， K2HPO41.5g， KH2PO40.5g， MgSO4·7H2O0.1g， FeSO4·7H2O 0.01g， 蒸 1000mL， 调 pH7.0 左右。固体培养基 ： 向液体培养 基中加 2％的琼脂。
在无菌条件下向已装有 100ml 基础盐培养基的 250ml 锥形瓶中加入 10g 污泥， 内 含 50mg/L 联苯菊酯。于 30℃， 180r/min 震荡培养 7d 后， 按 10％的接种量转接到含 100mg/ L 联苯菊酯的基础盐培养基里， 同样条件培养 7d。以后每 7d 按 10％接种量进行驯化培养， 联苯菊酯浓度每次增加 50mg/L。直到提高联苯菊酯浓度为 400mg/L 后， 将培养液涂布在基 础盐固体培养基上， 选取生长快， 菌落规则， 传代稳定的单菌落， 划线培养 3 次后制成斜面， 保存于冰箱待用。
菌株生化鉴定
表 1 LBK1 菌株生理生化测定结果
菌株分子鉴定
LBK1 菌株经 16SrDNA 测定， 获得如下序列 SEQ ID ： NO.1 ：
TGTCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCTAAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGT GTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCT TCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTG CCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTT CCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTT GCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGA CGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGC
TCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAA TGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGT ATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTG TTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTT CCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAAT AATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTA CCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATC ACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGG CCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCA CCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCA AACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACC CGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCA
测序结果在 NCBI 的 GeneBank 里进行 Blust 比对， 其结果与 Bacillus Subtilis strain BEF5314 同源性达到 98％， 因此 LBK1 在分子分类上鉴定为枯草芽孢杆菌 (Bacillus Subtilis)。
菌株的生物降解作用 ：
该菌的用途是降解联苯菊酯农药， 适用于农药污染的水体、 土壤及农产品的生物 修复或生物净化。
种子液的制备 ： 将 LBK1 菌株在无菌操作条件下用接种环挑取一环接种于 50ml LB 液体培养基中， 于 30℃、 摇床 120r/min 培养 48h。然后在 4000r/min 条件下离心 10min 收 集菌体， 并用 10ml 的 0.02mol/L Na2HPO4-KH2PO4 缓冲液洗涤 2 次， 再用同一缓冲液制成菌悬 液并调整菌体浓度使其 OD600 在 1.5 左右， 备用。
LBK1 对联苯菊酯的降解率的初步测定实验 ： 在基础盐液体培养基中添加联苯菊 酯标准溶液， 使其浓度为 200mg/L， 总体系为 50mL， 按 5％的接种量将种子液接入基础盐培 养液中， 30℃， 180r/min 摇床培养。以不接菌的培养液为空白对照， 每个处理设 3 个平行。
LBK1 对不同浓度联苯菊酯的降解 ： 在基础盐培养基中添加联苯菊酯标准溶液， 使 其浓度分别为 100、 200、 300、 400mg/L， 以 5％的接种量接入 LBK1， 于 30℃、 180r/min 的条件 下摇床培养。
LBK1 正交优化试验 ：
本实验考察温度、 pH 值、 接种量和装液量四个因素对 LBK1 降解联苯菊酯的影响。 采用四因素三水平正交实验方案， 根据 L9(34) 正交表， 进行正交试验。运用 SPSS 软件对各 因素的影响程度进行评估， 并给出最佳组合条件。最佳条件为 A2B2C3D2 即温度 30℃， PH ＝ 7， 接种量 10％， 装液量 50ml， 在此条件下降解率可达 95.92％。
测定结果如下 ：
表 2 LBK1 对联苯菊酯的降解
表 3 LBK1 对不同浓度联苯菊酯的降解
表 4 正交优化试验
应当理解的是， 对本领域普通技术人员来说， 可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。7CN 101967459 A
序列表1/3 页
8CN 101967459 A序列表2/3 页
9CN 101967459 A序列表3/3 页10